使用可诱导的重组核糖核酸因子生成不含肿瘤的类胚胎干细胞的多能性细胞

摘要

本发明一般而言是关于一种用于培养、生成及筛选不含肿瘤的类胚胎干细胞(ES)的多能性细胞的方法，其使用电穿孔法传送可诱导肿瘤抑制子mir-302因子至哺乳动物细胞内。更具体而言，本发明是关于一种用于生成Tet-On/Off重组转基因的方法及组合物，其在控制人类体细胞/癌症细胞中的强力霉素(Dox)下可表达人工重设的mir-302微型核糖核酸(miRNA)/发夹型RNA(shRNA)因子，因而对这些细胞的分化相关基因及癌基因诱导某些特定的基因沉默效应，进而造成将这些细胞重新编程成类ES多能性状态。

说明书

发明人：林希龙和吴堂熙 

要求的优先权 

本申请要求在2008年11月28日提交的题为“使用可诱导的重组核糖核酸因子生成不含肿瘤的类胚胎干细胞的多能性细胞”的美国临时申请序列号61/193,438的优先权。本申请要求在2008年1月16日提交的题为“使用内含子的RNA生成人类类胚胎干细胞的多能性细胞”的美国临时申请序列号61/011,333的优先权。本申请还要求在2008年9月8日提交的题为“使用可诱导重组的RNA因子生成不含肿瘤的类胚胎干细胞的多能性细胞”的美国临时申请序列号61/191,327的优先权。此外，本申请是以下申请的部分继续申请：2003年5月15日提交的题为“定向的RNA剪接和加工的基因沉默及其相关应用”的美国申请序列号10/439,262；2006年3月31日提交的题为“使用内含子的RNA的新颖的转基因方法”的No.11/278,143；2008年5月7日提交的题为“使用内含子的RNA产生人类类胚胎干细胞”的No.11/278,143；这些申请以其全部内容引入本文作为参考。 

技术领域

本发明一般而言是关于用来培养、生成及筛选不含肿瘤的类胚胎干细胞(ES)的多能性细胞的一种手段及方法，其使用在感兴趣的这些细胞中转基因表达重组肿瘤抑制子微型核糖核酸(miRNA)或小发夹型RNA(shRNA)因子。更具体而言，本发明是关于用于生成非自然发生的重组内含子的一种转基因方法及由可诱导性核酸组合物，其组成能够在哺乳动物细胞中被剪接及加工成小核糖核酸(RNA)基因沉默效应子(如前体miRNA(pre-miRNA)和/或shRNA)，然后对发育及细胞分化相关的基因及癌基因诱导某些特定基因沉默效应，导致将这些细胞重新编程为类ES多能性状态。较佳地，这些小RNA基因沉默效应子包含类肿瘤抑制子的miRNA，例如：mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d，及其 人工重设的shRNA同源物及其组合。换句话说，如此生成的这些多能性类干细胞可在无饲养层细胞(feeder-free)的细胞培养条件下培养。感兴趣的这些细胞包含体外(in vitro)、离体(ex vivo)和/或体内(in vivo)分离的体细胞或癌细胞。 

背景技术

近来在人类干细胞的研究已显示在移植治疗中具有高度期望的潜力。然而，用来克隆人类干细胞的这些来源受限，且极难控制其纯度及品质。在1998年，James Thomson等人(如：美国专利第5,843,780号、第6,200,806号、第7,029,913号，及第7,220,584号)自人类胚胎的晚囊胚(late blastocysts)分离第一株人类胚胎干(ES)细胞株(Thomson等人，(1998)Science 282：1145-1147)。H1及H9细胞是得自这些分离的人类ES细胞的两株典型细胞株。两年后，Gearhart等人(如：美国专利第6,090,622号、第6,245,566号，及第6,331,406号)也开发出一种自后囊胚(post-blastocyst)人类胚胎分离类ES原生生殖细胞的方法。因为这些ES细胞分离方法的方式必须破坏原先胚胎，引发了许多伦理及人道关注，其质疑将这些ES细胞用于临床治疗上的正当性。 

在最近几年，治疗安全及使用知情同意上的问题也受到注意。例如，因为ES细胞生长需要由周围「饲养层细胞」成纤维细胞所释放的一些不确定因子，所有人类ES细胞较佳地是在一层小鼠或人类成纤维细胞上生长(Reubinoff等人的美国专利第6,875,607号)。然而，这些成纤维细胞饲养层细胞呈现不同的表面抗原，其通常污染ES细胞抗原的纯度并可引起病人的免疫排斥。尽管已开发了一些无饲养层细胞的培养条件，这些无饲养层细胞培养方法中没有一个能将该未分化的ES细胞状态维持一段长时间。不幸地，在目前任何可得的培养条件下，人类ES细胞株不能达到100％的群体纯度。甚至是在最佳的含饲养层细胞培养条件下，一些(约5％-10％或更多)ES细胞总是倾向分化成其它组织细胞类型并失去其干细胞特性。得自这些ES细胞的最常观察到的细胞类型之一是畸胎瘤(teratoma)。畸胎瘤是通常得自人类生殖系细胞的一种肿瘤，其包含类似胚胎内胚层(endoderm)、中胚层(mesoderm)及外胚层(ectoderm)组织的多重类肿瘤细胞类型。因此，如何避免饲养层细胞的细胞污染、增加干细胞纯度 并减少肿瘤形成的风险是本干细胞研究的三个主要课题。 

2006年时，Takahashi与Yamanaka诱导了诱导性多能性干(iPS)细胞(Cell126：663-676)。藉由使用四个转录因子基因[Oct3/4(Oct4)，Sox2，c-Myc及Klf4]的反转录病毒传送进入小鼠成纤维细胞内，Takahashi与Yamanaka成功在体外将这些体成纤维细胞重新编程并转形成类ES的iPS细胞株。此方法的成功率在该全部所测试的细胞群中估计少于0.002％-2％。在2007年，这些iPS细胞的基因及行为特性经观察是类似这些小鼠ES细胞的特性(Okita等人，(2007)Nature 448：313-317；Wernig等人，(2007)Nature 448：318-324)。同时，Yu等人使用类似的方法但以一组不同转录因子开发出得自人类成纤维细胞的新颖iPS细胞株，所述转录因子包括：Oct4、Sox2、Nanog及LIN28(Yu等人，(2007)Science 318：1917-1920)。然而，Yu的方法的效率远较Takahashi的方法效率低。这些iPS细胞应用的优点显示出若配合体细胞核转移(SCNT)技术，不仅解决了原先ES细胞方法的伦理问题，也提供了对病人友善的潜在疗法(Meissner等人，(2006)Nature 439：212-215)。此iPS型SCNT治疗已测试用来处理转基因小鼠模型中的镰刀细胞贫血症(Hanna等人，(2007)Science 318：1920-1923)。然而，仍有两个未解决的问题；其一是反转录病毒的转基因使用，其二是癌基因的使用(如：c-Myc及Klf4)。反转录病毒感染是可将四个大型转录因子基因转基因传送进靶宿主细胞内的唯一有效手段；然而，多个反转录病毒载体随机插入该靶细胞基因组也可能影响其它非靶基因。这造成问题，因为由于不确定的反转录病毒插入通常会引起细胞变异，特别是当一或多个转基因是癌基因时。如何避免由这些转录因子诱导iPS细胞形成肿瘤目前为止是难以解决的。 

iPS细胞的另一缺点是其非均质性。为生成iPS细胞，至少三或更多个不同的转录因子基因必须经由反转录病毒感染来插入单个细胞基因组中。然而，由于不同的反转录病毒转基因呈现不同比率的传送效率及插入变异，多个反转录病毒插入通常造成宿主细胞基因组中各式各样的转基因组合。仅有具适当比率及数目的所述四个转录因子基因的细胞可变成具有良好多能性的iPS细胞。此是为何在反转录病毒插入后这些iPS细胞仅占整个细胞群的0.002％-2％，而 占这些细胞超过98％的其它细胞是以复杂的不确定的转基因组合而转形。为了收集具正确转基因组合的纯iPS细胞，需要一系列繁琐的细胞筛选程序(ShinyaYamanaka的美国专利第7,250,255号)。虽然iPS细胞形成机制尚未清楚，但是此技术需要多个转录调节子来协调在胚胎基因的再活化及发育信号的去活化间的转换。Oct4-Sox2-c-Myc-Klf4或Oct4-Sox2-Nanog-LIN28基因的组合效应似乎直接活化某些胚胎基因；然而，这些效应如何造成取消体细胞分化所必要的整体发育信号尚未确定。除转基因Oct4外，iPS方法所使用的所有其它转基因实际上均包含在某些组织细胞发育的起始阶段中。通过将这些发育信号放在一起，这些发育信号的协调或扰乱以某种方式终止了细胞分化，然后将该细胞转形回到ES状态。这是非自然机制，可包含不确定的风险，例如细胞变异及肿瘤形成。 

体细胞核转移(SCNT)的实验已显示体细胞核及卵母细胞的细胞质的杂合可形成多能性类干细胞，其指出在该卵母细胞的细胞质中的某些母系元素而非该细胞核中的转录因子在核重新编程中发挥重要作用(Simonsson and Gurdon，(2004)Nat Cell Biol.6：984-990)。在桑葚胚时期前的自然受精卵及早期接合子中，母系元素负责正常干细胞再生及多能性的调节及维持，其全然无肿瘤形成的风险。这是为何在32-64细胞(桑葚胚)时期前的胚胎细胞是全部相同且全能的。母系元素在卵子生成期间产生并存在于最初胚胎形成时期所需的成熟卵母细胞中。缺乏岱塞尔(Dicer，微型核糖核酸生物合成作用时所需的保守性核糖核酸酶)的小鼠卵母细胞停滞在减数分裂I的分裂期，其指出微型核糖核酸是卵母细胞中的主要母系元素之一(Murchison等人，(2007)Genes Dev.21：682-693)。在鼠科动物卵母细胞中，核糖核酸占据母系元素的一大部分，其相当于全部基因组转录组的约45％(Stitzel等人，(2007)Science 316：407-408)。在母型-合子型过渡期间，这些母系RNA很快地降解，且该合子基因的转录早在该2-4细胞时期时激活，以产生用于胚胎发育的信号(O’Farrell等人，(2004)Curr.Biol.14：R35-45)。可以想见，许多这些母系RNA是这些合子基因的抑制子，以在胚胎发育的最初时期同步化发育信号和维持全能性/多能性ES细胞再生。因此，母系RNA可能是ES细胞维持及再生所必要的这些主要母系元素之一。 

总而言之，ES细胞维持及再生的自然方式是仰赖某些母系RNA(作为抑制子)而非用于iPS技术的这些四个转录因子(作为活化子)。为了生成模拟ES细胞维持及再生的自然机制的类ES多能性细胞，极度需要一种新策略来识别及评估这些母系RNA的功能。可将这些已识别的母系RNA传送进人类成人干细胞或体细胞，以维持这些干细胞特性或将这些体细胞重新编程成类ES状态中，或两者皆可。因此，需要用来生成类ES多能性细胞的有效、简单且安全的方法及试剂组合物，较佳地是使用母系RNA。 

发明内容

本发明提供一种用于将至少一种哺乳动物细胞重新编程为至少一种多能性类干细胞的方法。该方法包含以下步骤：提供至少一细胞基质，其表达多个mir-302靶向细胞基因；提供至少一种重组核酸组合物，其可经传送、转录及加工成与在该细胞基质中的mir-302同源的至少一种基因沉默效应子；及在mir-302所靶向的这些细胞基因受抑制的情况下，以该重组核酸组合物处理该细胞基质。换句话说，本发明提供一种用来培养、生成及筛选类胚胎干(ES)多能性细胞的方法，其使用类发夹型的重组微型核糖核酸(miRNA)试剂的异位表达，这些miRNA为如mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d，及其人造重设的前体miRNA(pre-miRNA)，和/或小发夹型RNA(shRNA)同源衍生物及其组合。非自然发生/人造/人工mir-302试剂的设计包含小发夹型RNA(shRNA)和/或小干扰RNA(siRNA)同源物或基因群的错配及完美配对的构建体，这全部都可改善靶向专一性并减少转基因传送及基因沉默所需的mir-302拷贝数。 

天然微型核糖核酸(miRNA)通常是约长度18-27的核苷酸(nt)，并可依其相互的互补程度而直接降解其靶向信使RNA(mRNA)或抑制该靶向mRNA的转译。mir-302家族(mir-302s)是一群高同源性的基因间miRNA，其享有超过89％的同源性且在几乎所有的哺乳动物间是保守的。Mir-302家族包含四个成员，其经共同转录作为一非编码的RNA基因群，包含：mir-302b、mir-302c、mir-302a、mir-302d及mir-367，其以5’端至3’端的方向连接(Suh等人，(2004)Dev.Biol.270：488-498)。虽然mir-367及mir-302家族是共表达的，由于其对抗不同组的靶基 因是截然不同的种子基序(seed motif)，其功能实际上是彼此不同的。已经发现在许多哺乳动物的早期接合子及胚胎干(ES)细胞中mir-302家族的表达量极高(Tang等人，(2007)Genes Dev.21：644648；Suh等人，(2004)Dev.Biol.270：488-498)。在生长缓慢的ES细胞中表达量最丰富，并在细胞分化和/或增殖后快速地减少。小鼠的卵母细胞缺乏岱塞尔(Dicer)，岱塞尔是miRNA生物合成作用所需的一种保守性核糖核酸酶，因此这些卵母细胞停滞在减数分裂I的分裂期，这表示这些miRNA在卵子生成中扮演决定性的角色(Murchison等人，(2007)Genes Dev.21：682-693)。此外miRNA具有小抑制RNA的特性，其能够抑制具有高度互补程度的靶基因的转译(Bartel，D.P.(2004)Cell 116：281-297)，mir-302家族可能是负责避免ES细胞在早期胚胎形成期间的任何可能的早熟分化的重要的母系抑制子。这些发现暗示mir-302家族在正常ES细胞维持及再生中扮演重要的角色。 

所有mir-302成员在其5’端前十七个(17)核苷酸中共有完全相同(100％)的序列(包含完全种子基序)，以及在其第23个核苷酸成熟miRNA序列中具有整体83％-96％的同源性。该种子基序位于成熟miRNA序列的5’端的前八个核苷酸中，其决定了该miRNA及其靶基因间的结合专一性及效率。根据链接到SangermiRBase::Sequences网站(http://microma.sanger.ac.uk/)数据库的“TARGETSCAN”(http://www.targetscan.org/vert_42/)及“PICTAR-VERT”(http://pictar.bio.nyu.edu/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi？)程序的预测，其对抗几乎相同的细胞基因，包括在人类及小鼠中超过445个保守性的基因。此外，mir-302也与mir-93、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373，及mir-520家族成员共有某些重叠的靶基因。大多数的这些靶基因是发育信号及转录因子，其与早期胚胎形成期间的谱系专一性细胞分化的初始和/或促进作用有关(Lin等人，(2008b)RNA 14：2115-2124)。许多这些靶基因也是熟知的癌基因。因此，mir-302家族的功能更可能抑制发育信号及分化相关转录因子的整体生成，而非如先前的iPS方法是在某些胚胎信号传递路径上建立转录刺激。此外，由于许多这些靶发育信号及分化相关的转录因子是癌基因，mir-302家族也可如肿瘤抑制子般作用，以防止正常ES细胞再生偏差而形成肿瘤。换句话说，本发明提供一 种用于生成不含肿瘤的类ES多能性细胞方法。例如，类胰岛素生长因子(IGF)是用于专对神经元细胞谱系的分化的潜在发育信号，这些信号是经由Ras/Raf/有丝分裂原激活蛋白质激酶(MAPK)路径或经由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt的信号传导路径。相同的信号传递路径也与许多肿瘤/癌症转形相关，例如：脑瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌，及皮肤黑色素癌。本发明人发现IGF受体(IGFR)-Ras/PI3K信号传递路径中超过十八个成员是mir-302家族的强力靶，这表示在哺乳动物卵母细胞及ES细胞中有极严密的封锁以防止神经元细胞分化。在许多其它各种细胞谱系上也观察到类似的mir-302家族抑制效应。根据上述证据，本发明人相信mir-302家族是正常ES细胞的维持与再生的主要调节子，其可能能够将已分化的体细胞重新编程为均质的类ES状态。 

为测试mir-302家族的功能，本发明人已根据天然内含子miRNA生物合成机制(图1A)开发出第二型RNA聚合酶驱动(Pol-II-driven)的miRNA表达系统，并顺利地使用此系统体外地及体内地产生天然miRNA家族以及人造shRNA(图1B)。广义而言，该内含子是基因的非编码序列，其包含读框内含子(in-frameintron)、5’端非转译区(5’-UTR)及3’端非转译区(3’-UTR)。我们先前的研究已证实有效成熟的miRNA可得自哺乳动物基因的这些内含子区域，称之为内含子微型核糖核酸(intronic miRNA)(Lin等人，(2003)Biochem Biophys Res Commun.310：754-760；Lin等人，(2005)Gene 356：32-38)。因为约有50％的哺乳动物miRNA是存在蛋白质编码基因的这些内含子内，故内含子miRNA表达是哺乳动物中常见的现象(Rodriguez等人，(2004)Genome Res.14：1902-1910)。如图1A所示，内含子miRNA生物合成是仰赖新生的第二型RNA聚合酶介导的pre-mRNA转录及内含子剪接/切除之间的偶合交互作用，其是发生在靠近基因组核染质周围纤丝的某些细胞核区域内(Ghosh等人，(2000)RNA 6：1325-1334；Lin等人，(2008a)Frontiers in Bioscience 13：2216-2230)。这些miRNA是在其宿主基因(pre-mRNAs)的前体转录物内通过第二型RNA聚合酶(Pol-II)转录，并通过剪接体及其它核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)核酸内切酶剪接以形成成熟的miRNA(Lin等人，2003；Danin-Kreiselman等人，(2003)Mol Cell 11：1279-1289)；然而，Drosha可能不需要此种程序(Ruby等人，(2007)Nature 448：83-86)。结果，内含子miRNA 生物合成是通过多个细胞内监测系统严密调控，包括：第二型RNA聚合酶(Pol-II)转录、RNA剪接、外体加工及无义介导RNA降解(NMD)。换句话说，该类miRNA基因沉默效应子是由细胞内机制释放，该机制选自RNA剪接、外体加工、无义介导RNA降解、及其组合。由于这种高度细胞内监测，可避免在其它shRNA/siRNA表达系统中所发现的RNA过饱和问题，因而造成对靶基因更有效、靶向更专一且更安全的基因沉默效应(Lin等人，2008a)。 

通过模仿该天然内含子miRNA路径(图1A)，本发明人发明一种新颖内含子miRNA表达系统来转录红移萤光蛋白质(RGFP)的重组转基因，称之为SpRNAi-RGFP，其包含可产生内含子miRNA和/或类shRNA基因沉默效应子的人造/人工的能够剪接的内含子(SpRNAi)。该SpRNAi在该SpRNAi-RGFP基因的pre-mRNA内通过Pol-II共同转录，并通过RNA剪接切除。接着，进一步将所剪接的SpRNAi加工成成熟的基因沉默效应子，例如：天然miRNA及人造shRNA，从而对靶基因引发特定的转录后基因沉默(PTGS)效应。同时，在内含子剪接后，将该SpRNAi-RGFP基因转录物的外显子连接在一起以形成用于转译RGFP标记蛋白质的成熟mRNA，该RGFP标记蛋白质用于识别miRNA/shRNA表达。在其它实施例中，一些功能性蛋白质外显子可用来代替RGFP以提供额外的基因功能，例如：用于体细胞重新编程的胚胎干(ES)细胞基因标记。换句话说，该基因沉默效应子可经由转录后基因沉默、转译抑制、RNA干扰，和/或无义介导降解诱导细胞内基因沉默效应。由于目前在脊椎动物中所发现超过1000种天然miRNA种类的功能尚不清楚，并且仍不断地识别出更多新的miRNA，本发明的内含子miRNA表达系统可作为用来在体内及体外地测试这些miRNA功能的有力工具。 

该SpRNAi内含子包含数个保守的核苷酸组成，其包含：5’端剪接位(SEQ.ID.NO.4)、分支点基序(BrP；SEQ.ID.NO.6)、多嘧啶串(PPT；SEQ.ID.NO.7及SEQ.ID.NO.8)，及3’端剪接位(SEQ.ID.NO.5)。此外，发夹型miRNA或shRNA前体是插在该5’端剪接位及该分支点基序之间。此部分的内含子通常在RNA剪接及加工期间形成一套马索(lariat)结构。此外，该SpRNAi的3’端包含多重转译停止密码子区域(T密码子)，以增加内含子RNA剪接及NMD加工的准确性。 当T密码子在细胞质mRNA中出现时，此T密码子信号活化该NMD系统以降解该细胞中所累积的任何未结构化的RNA。然而，会保留高度结构化的shRNA及前体miRNA(pre-miRNA)以供Dicer进一步地酶切来分别形成成熟的siRNA及miRNA。对于转基因表达而言，我们在RGFP基因(SEQ.ID.NO.22)的DraII限制位(第208个核苷酸)中人工地并入SpRNAi。此形成了重组的SpRNAi-RGFP转基因。酶切具DraII切位的RGFP在每一端产生具有三个内凹核苷酸的AG-GN核苷酸切口，其在SpRNAi插入后将分别形成5’端剪接位及3’端剪接位。因为此内含子插入中断了RGFP蛋白质的完整性，其可通过内含子剪接来恢复，因此能通过在这些感染细胞中出现的红色RGFP来判定该内含子miRNA/shRNA的释放及该RGFP mRNA的成熟。该RGFP基因也包含多个外显剪接促进子(ESE)以增加RNA剪接的准确性及效率。 

在较佳的具体实施方式中，本发明是可诱导的miRNA/shRNA表达系统(图2A及2B)，其改善体内及体外的miRNA/shRNA表达水平的控制。此种改善不仅适用于较安全的代替易发生肿瘤的反转录病毒感染的电穿孔法/显微注射法来进行转基因传送，同时也避免了在这些转染细胞中RNA过度累积的可能性。根据此种改善，本发明人已成功地产生各种mir-302转导多能性干(mirPS)细胞株，其源自正常表皮皮肤细胞(mirPS-hpESC)、正常毛囊细胞(mirPS-hHFC)的人类原代培养，与癌症乳腺癌MCF7(mirPS-MCF7)、前列腺癌PC3(mirPS-PC3)及皮肤黑色素癌Colo 829(mirPS-Colo)细胞。如图2A及2B所示，本发明人首先将人造mir-302家族pre-miRNA/shRNA构建体(图3B)并入SpRNAi-RGFP转基因的内含子插入位(即：MluI-PvuI限制/克隆位)，然后将该SpRNAi-RGFP转基因插进强力霉素(Dox)-可诱导pTet-On-tTS载体的多重克隆位(即：XhoI-ClaI限制位)，因而形成pTet-On-tTS-mir302s转基因载体(图3A)。换句话说，该重组核酸组合物(如SpRNAi、SpRNAi-RGFP等)包含可药物诱导的基因表达载体。此外，该SpRNAi-RGFP也可并入基因表达载体中，该载体选自质粒、病毒载体、反转座子、及其组合。该SpRNAi-RGFP转基因是以370个碱基对(bp)同源区域为侧翼，该同源区域是用来重组插入该宿主细胞基因组的靶位。在转基因传送方面，pTet-On-tTS-mir302s载体(10-30μg)与这些宿主细胞(200-2000)在低渗性pH缓冲 液(400μl；有盖试管(Eppendorf))中混合，且在400-450伏特下实行电穿孔100微秒(μsec)以将该转基因传送进这些宿主细胞基因组内。在72小时后，使用FACS流式细胞计数仪及anti-RGFP及anti-Oct3/4单株抗体两者以分离并收集转基因mirPS阳性细胞(图3C)。此新颖mir-302家族转基因方法的成功率超过91％，其远高于所发现的原先iPS方法的0.002％-2％的成功率。该人造mir-302家族的所有序列是根据Sanger miRBase::Sequences程序的序列数据库而化学合成。pTet-On-tTS载体编码CMV驱动tTS抑制子基因以活化该转基因的TRE-CMV启动子。当出现强力霉素(Dox)时，tTS的抑制功能则经Dox消除，因此表达出SpRNAi-RGFP转基因及其编码的mir-302家族。 

在另一较佳具体实施方式中，本发明提供一种基因工程方法，其用来建构包含至少一个所需的插入片段的人工/人造SpRNAi内含子，该插入片段是用来产生mir-302家族或类mir-302的miRNA、shRNA和/或反义RNA基因沉默效应子。该SpRNAi是通过连接用于RNA剪接的合成寡核苷酸元素而形成，所述合成寡核苷酸元素为例如：5’端剪接位、BrP、PPT、3’端剪接位，及一些接头寡核苷酸。寡核苷酸合成器可化学合成并连接这些元素。换句话说，该内含子(如：SpRNAi)是通过化学合成方法来合成。在其它实施方式中，这些元素的连接可通过酶限制及接合来实现。换句话说，该内含子(如：SpRNAi)亦可通过核苷酸重组方法来形成。所得的内含子(如：SpRNAi)可直接用来转染至感兴趣的这些细胞内或是进一步地并入宿主基因中以与该基因转录物(pre-mRNA)共同表达。因此，目前发明的重组核苷酸组合物进一步地包含重组内含子，其编码至少一个例如mir-302的RNA基因沉默效应子。一般而言，这些用于内含子插入的方法包括酶限制/克隆、同源DNA重组、转座子并入、跳跃基因整合、反转录病毒感染，及其组合。该宿主基因选自萤光蛋白质(GFP)标记基因、胚胎干(ES)细胞标记基因、萤光酶、lac-Z报告基因、病毒基因、转座子、跳跃基因、人工重组基因及天然细胞基因。换句话说，该重组核酸组合物进一步包含多个外显子，其选自萤光蛋白质标记基因、萤光酶基因、lac-Z报告基因、胚胎干细胞标记基因、病毒基因、细菌基因、细胞标记基因、跳跃基因、转座子、及其组合。在不受限 制下，本发明较佳使用用于指示mir-302家族表达的修饰红萤光蛋白质(RGFP)基因。 

在一方面，该SpRNAi内含子包含5’端剪接位，其与5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或GU(A/G)AGU基序(SEQ.ID.NO.38)(即：5’-GTAAGAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.37)、5’-GTAAGAGT-3’(SEQ.ID.NO.39)、5’-GTAGAGT-3’(SEQ.ID.NO.40)以及5’-GTAAGT-3’(SEQ.ID.NO.41))同源，而其3’端是3’端受体剪接位，该3’端受体剪接位与GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG基序(即：5’-GATATCCTGC AG-3’(SEQ.ID.NO.42)、5’-GGCTGCAG-3’及5’-CCACAG-3’))同源。换句话说，该重组核酸组合物的内含子包含5’端供体剪接位、内含子插入位、分支点基序、多嘧啶串，及3’端受体剪接位。此外，分支点序列位于这些5’端及3’端剪接位之间，其包含与5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)基序同源的基序，例如：5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’。换句话说，该分支点基序包含该SEQ.ID.NO.6序列或与该SEQ.ID.NO.6序列同源。该分支点序列的腺核苷“A”核苷酸在几乎所有的剪接体内含子中通过细胞(2’-5’)寡腺苷合成酶及剪接体形成一部分的(2’-5’)连接套马索内含子RNA。此外，多嘧啶串是位于接近该分支点及3’端剪接位之间，其包含与5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)或5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)基序同源的高T或C含量序列。符号“m”及“n”表示其≥1的多个重复；更佳地，m的数量等于1～3且n的数量等于7～12。符号“-”是指在该序列中可被略过的核苷酸。也有一些接头核苷酸序列用来连接所有这些合成的内含子组成。根据37CFR 1.822中关于用于核苷酸和/或氨基酸序列资料的符号及格式的准则，符号W是指腺嘌呤(A)或胸嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号K是指鸟嘌呤(G)或胸嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号S是指胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，符号Y是指胞嘧啶(C)或胸嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号R是指腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，且符号N是指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。 

在另一方面中，表达各种内含子基因沉默效应子的多个转基因和/或载体可用来实现对多个靶基因的基因沉默。或者，多个基因沉默效应子可由内含子插入片段产生。换句话说，该内含子插入位包含至少一个与mir-302同源的基因 沉默效应子。例如：已报导在斑马鱼中的anti-EGFP含pre-miRNA内含子的异位表达产生两个不同长度的miRNA，称之为miR-EGFP(282/300)及miR-EGFP(280-302)，这表示该SpRNAi的插入片段可产生多个基因沉默效应子(Lin等人，2005)。在某些例子中，内含子基因沉默效应子可与靶基因转录物(即：mRNA)杂合以形成用来引发二级RNA干扰效应(RNAi)的双链siRNA。因为这些基因沉默效应子不断地由该转基因载体制造，其将纾解有关体内快速RNA降解的疑虑。此策略的优点是经由该载体型转基因转染或病毒感染的稳定传送，其提供可靠的长期基因沉默效力。此外，本发明可在特定RNA启动子的控制下生产RNAi相关的基因沉默效应子(包括：miRNA、shRNA及siRNA)，该特定RNA启动子选自第二型RNA聚合酶(Pol-II)、病毒聚合酶、第三型RNA聚合酶(Pol-III))，及四环素反应元件控制RNA聚合酶(TRE)启动子。这些病毒启动子是类Pol II RNA启动子，其是自巨细胞病毒(，CMV)、反转录病毒长终端区(LTR)、B型肝炎病毒(HBV)、腺病毒(AMV)及腺相关病毒(AAV)中分离而得。例如：慢病毒LTR启动子足以提供超过每一细胞5×10⁵个拷贝的pre-mRNA转录物。也可在该病毒聚合酶启动子的前端插入药物敏感抑制子(即：tTS)以控制这些基因沉默效应子的转录率。该抑制子可用化学药物或抗生素来抑制，这些化学药物或抗生素选自G418、四环素、强力霉素、新霉素、安比西林、卡那霉素及其衍生物等等。换句话说，目前发明的重组核酸组合物的表达可用一类药物抗生素衍生物来调节，例如：四环素衍生物例如：强力霉素是四环素衍生物之一。 

依据本发明，所需内含子RNA插入片段是通过细胞内机制来切除并释放，然后对特定基因靶引发所需要的基因沉默效应，该特定基因靶与该RNA插入片段具有高度互补性；而该宿主基因转录物的这些外显子被连接在一起以形成用来产生具所需要蛋白功能的成熟mRNA，这些报导或标记蛋白质可选自红/绿萤光蛋白质(RGFP/EGFP)、胚胎基因标记、萤光酶、β半乳糖苷酶(lac-Z)及其衍生物。该报导/标记蛋白的出现可用于识别在这些转染细胞中这些内含子基因沉默效应子的数量水平及位置，以及有助于确认所得基因沉默效应。或者，以该外显子连接形成的成熟mRNA可用在常规的基因治疗以代替受损或遗失 的基因功能，或增加特定基因表达。在另一方面，这些基因沉默效应子(与mir-302同源)也可包含反义RNA、核糖酶、短暂小分子RNA(stRNA)、非编码小分子RNA(tncRNA)、Piwi交互作用RNA(piRNA)、双链RNA(dsRNA)、siRNA、shRNA、miRNA，及其前驱物(即：pri-/pre-miRNA)。这些内含子基因沉默效应子的使用是用来将不想要的靶基因沉默的有力工具，这些靶基因选自外源基因、致病转基因、病毒基因、突变基因、癌基因、疾病相关非编码RNA基因与许多其它类型的蛋白质编码以及非编码细胞基因。 

因为一些天然pre-miRNA的径环结构太大且/或太复杂，无法配合该SpRNAi-RGFP转基因，本发明人通常使用人造重设tRNA^met环(即5’-(A/U)UCCAAGGGGG-3’)(SEQ.ID.NO.43)来代替这些天然pre-miRNA环。该tRNA^met环显示出能如同天然miRNA般经由相同的Ran-GTP及Exportin-5传送机制有效地协助将人造重设的miRNA自细胞核输出至细胞质(Lin等人，(2005)Gene 356：32-38)。有利的是，本发明目前使用一对人造改善pre-mir-302环，包含：5’-GCTAAGCCAG GC-3’(SEQ.ID.NO.1)及5’-GCCTGGCTTA GC-3’(SEQ.ID.NO.2)，其提供与天然pre-miRNA相同的细胞核输出效率，但不会干扰tRNA输出。并且，此改善加强了mir-302a-mir-302a^*及mir-302c-mir-302c^*双链体的形成，其可增加mir-302家族的整体功能及稳定度。这些新颖pre-miRNA环的设计是通过mir-302b/mir-302a的tRNA^met环与短径环的组合来修正，其在胚胎干细胞中高水平地表达而在其它分化组织细胞中不表达。因此，在mir-302家族中使用这些重组/人造/人工pre-miRNA/shRNA环将不会干扰我们身体中的天然miRNA路径，因而细胞毒性更小且更加安全。 

mir-302pre-miRNA家族的基因群是通过合成的mir-302同源物的杂合及链接/接合来形成，其在5’端至3’端方向上包含四个部分：mir-302a、mir-302b、mir-302c及mir-302d pre-miRNA(图3B)。所有这些人造重设的mir-302miRNA/shRNA分子在其前十七个核苷酸中具有完全相同的5’端(如：5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3))。以下列出用于mir-302pre-miRNA基因群的DNA重组的合成寡核苷酸：包括：正义mir-302a，5’-GTCCGATCGT CCCACCACTT AAACGTGGAT GTACTTGCTT TGAAACTAAA GAAGTAAGTG CTTCCATGTT TTGGTGATGGATCTCGAGCT C-3’(SEQ.ID.NO.29)；反义mir-302a，5’-GAGCTCGAGATCCATCACCA AAACATGGAA GCACTTACTT CTTTAGTTTCAAAGCAAGTA CATCCACGTT TAAGTGGTGG GACGATCGGA C-3’(SEQ.ID.NO.30)；正义mir-302b，5’-ATCTCGAGCT CGCTCCCTTCAACTTTAACA TGGAAGTGCT TTCTGTGACT TTGAAAGTAAGTGCTTCCAT GTTTTAGTAG GAGTCGCTAG CGCTA-3’(SEQ.ID.NO.31)；反义mir-302b，5’-TAGCGCTAGC GACTCCTACT AAAACATGGAAGCACTTACT TTCAAAGTCA CAGAAAGCAC TTCCATGTTAAAGTTGAAGG GAGCGAGCTC GAGAT-3’(SEQ.ID.NO.32)；正义mir-302c，5’-CGCTAGCGCT ACCTTTGCTT TAACATGGAG GTACCTGCTGTGTGAAACAG AAGTAAGTGC TTCCATGTTT CAGTGGAGGCGTCTAGACAT-3’(SEQ.ID.NO.33)；反义mir-302c，5’-ATGTCTAGACGCCTCCACTG AAACATGGAA GCACTTACTT CTGTTTCACACAGCAGGTAC CTCCATGTTA AAGCAAAGGT AGCGCTAGCG-3’(SEQ.ID.NO.34)；正义mir-302d，5’-CGTCTAGACA TAACACTCAAACATGGAAGC ACTTAGCTAA GCCAGGCTAA GTGCTTCCATGTTTGAGTGT TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.35)；及反义mir-302d，5’-ATGACGCGTC GAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCCTGGCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TATGTCTAGA CG-3’(SEQ.ID.NO.36)(Sigma-Genosys，St.Louis，MO)。或者，可使用人造重设的shRNA来代替mir-302pre-miRNA基因群以简化内含子插入，所述人造重设的shRNA是通过合成的正义mir-302家族，5’-GTCCGATCGT CATAAGTGCTTCCATGTTTT AGTGTGCTAA GCCAGGCACA CTAAAACATGGAAGCACTTA TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.27)与反义mir-302家族，5’-ATGACGCGTC GATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCCTGGCTTAGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TGACGATCGG AC-3’(SEQ.ID.NO.28)的杂合来形成。换句话说，这些较佳的基因沉默效应子之一是通 过SEQ.ID.NO.27与SEQ.ID.NO.28.杂合形成的重组核酸序列。该mir-302shRNA与所有天然的mir-302成员具有超过91％的同源性，并靶向人类相同的细胞基因。关于该mir-302pre-miRNA/shRNA的内含子插入，由于该重组SpRNAi-RGFP转基因的插入位在其5’端及3’端分别与PvuI及MluI限制/克隆位侧翼链接，该前体插入片段可通过各种pre-miRNA/shRNA插入片段简单地移除及取代(如：mir-302pre-miRNA/shRNA)，其具有与这些PvuI及MluI限制位的相配的粘性末端。通过改变针对各种基因转录物的这些内含子的插入片段，本发明的内含子mir-302家族表达系统可用作体外及体内地诱导靶基因沉默的有力工具。对于长度确认及转基因纯化而言，该mir-302插入SpRNAi-RGFP构建体(10ng)是通过聚合酶链式反应(PCR)与一对寡核苷酸引物(即：5’-CTCGAGCATGGTGAGCGGCC TGCTGAA-3’(SEQ.ID.NO.23)及5’-TCTAGAAGTTGGCCTTCTCG GGCAGGT-3’(SEQ.ID.NO.24))来扩增，扩增条件是：94℃、52-57℃及之后在68℃各执行一分钟，共执行25-30个循环。所得的PCR产物(～900-1100bp)在2％琼脂糖凝胶上层析，然后以凝胶提取试剂盒(Qiagen，CA)来提取及纯化。在确认该DNA序列后，该纯化的插入mir-302的SpRNAi-RGFP转基因经进一步地插入pTet-On-tTS载体的限制/克隆位(即：XhoI-ClaI位)，以形成用于细胞内表达的pTet-On-tTS-mir302s转基因表达载体(图3A)。可使用选自以下的方法来实现将该pTet-On-tTS-mir302s转基因载体传送进哺乳动物细胞内：脂质体/化学转染法、电穿孔法、基因枪穿透法、转座子/反转座子插入法、跳跃基因整合、显微注射，及反转录病毒/慢病毒感染。为避免随机转基因插入及细胞变异的风险，本发明人较佳地使用与同源重组配合的电穿孔法以将该pTet-On-tTS-mir302s转基因载体传送进感兴趣的宿主细胞。例如：该SpRNAi-RGFP转基因是以370碱基对(bp)同源区域为侧翼，以用来重组插入靠近LOC727977所在区域的3’端邻近处的人类染色体6中，在此区域不编码已知的基因。已检测到在此单一位置中精确地插入SpRNAi-RGFP(图4A)。因此在Dox存在时，该SpRNAi-RGFP转基因及其编码的mir-302家族的表达完全取决于该pTet-On-tTS载体的TRE-CMV启动子的活化。本发明人已在人类正常体细胞及癌症体细胞两者中测试了此种可诱导mir-302家族表达的新颖方法，这些体 细胞包含：正常表皮皮肤细胞、正常毛囊细胞、癌症乳腺癌MCF7、前列腺癌PC3，及黑色素癌Colo细胞。换句话说，该哺乳动物细胞可重新编程为多能性类干细胞状态，该哺乳动物细胞选自人类细胞、正常体细胞、患病体细胞、肿瘤或癌症细胞、人类毛囊细胞、人类皮肤细胞及其组合。所得的这些mir-302转导的多能性干(mirPS)细胞在相同的基因组位置处全都仅携带该SpRNAi-RGFP转基因的一或二个共存的重复序列(concomitant copies)(图4A)，这表示该整个mir-302浓度可影响这些mirPS细胞的存活。我们也已观察到mir-302家族及其标记RGFP mRNA的表达程度将随着Dox浓度提高而增加(图4B)。整个mir-302浓度必须表达到超过30倍但低于50倍，以触发将该体细胞重新编程为类ES多能性干细胞。由于在毛囊及皮肤细胞中极低的表达率(仅增加约16倍)，所以目前由Pol-III或CMV启动子驱动的可得的直接(外显)siRNA/shRNA表达系统无法起作用。这可能是因为该天然mir-302基因群的样板太短且是结构化的，以致无法通过Pol-III或CMV启动子直接地转录。因此，本发明提供一种通过限定的药物(即：Dox)可诱导机制在体外及体内地控制mir-302家族的表达程度，这可作为除了细胞内监测系统外的第二道防线。在本发明的这些mirPS细胞中检测会到由RNA累积或过饱和所造成的细胞毒性。 

本发明已采用该可诱导转基因表达系统的新颖设计及策略，称之为如先前提及的pTet-On-tTS-mir302s，并将其用于在人类体细胞/癌症细胞中转基因表达mir-302家族(mir-302s)的这些成员或同源物，因而可将这些体细胞/癌症细胞重新编程成类胚胎干(ES)细胞的多能性状态。在较佳具体实施方式中，本发明提供一种用于使用可药物诱导的重组核酸组合物的方法，该组合物可被传送、转录及加工成人类细胞中的类mir-302miRNA/shRNA分子/同源物，因而对在这些细胞中的mir-302靶向的发育及分化相关基因诱导特定的基因沉默效应，该方法包含以下步骤：a)提供：i)细胞基质，其表达mir-302家族靶向的多个发育及分化相关基因，及ii)重组核酸组合物，其可转录编码多个非编码mir-302miRNAs/shRNAs或其同源物的分离RNA，该多个非编码mir-302miRNAs/shRNAs或其同源物通过细胞内机制依次被加工成成熟的mir-302miRNAs/shRNAs或其同源物，因而能抑制在该细胞基质中的这些靶基因的功能； b)以该重组核酸组合物来处理该细胞基质，其是在使在该细胞基质中的这些靶基因功能受抑制的状况下处理。更佳的是，该可药物诱导的重组核酸组合物是Tet-On载体，其包含插入有重组mir-302家族基因群(mir-302s；SEQ.ID.NO.29-SEQ.ID.NO.36的杂合)或人造重设mir-302shRNA同源物(即：SEQ.ID.NO.27及SEQ.ID.NO.28的杂合)的SpRNAi-RGFP转基因。该细胞基质可用体外、离体和/或体内任一种方式表达该mir-302miRNA/shRNA及其靶基因。之后，将该细胞基质重新编程或转形成类ES状态，其不仅呈现标准ES细胞标记，如：Oct3/4、SSEA3、SSEA4、Sox2、Nanog、及LIN-28，并且包含高度去甲基化基因组，其类似经过干细胞重新编程的接合子基因组。 

应用此发明，本发明人已在七个方面收集了证据表明成功地实现mir-302诱导多能性干(mirPS)细胞生成：第一，已生成源自相同细胞类型的两个同族系的mirPS细胞株；其一是来自人类正常毛囊细胞(hHFC)，而另一个是来自癌症黑色素癌Colo细胞，两者都可体外地形成胚状体(图5A-5C)。第二，已使用这些mirPS转录组的微型核糖核酸(miRNA)微矩阵及RNA印迹分析法证实mir-302家族的表达提高(图6A-6B)。第三，已检测到该标准胚胎干(ES)细胞标记的表达提高，包含：Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2及Nanog(图6B、8B-8C及图9B)。第四，已观察到整体的基因组DNA去甲基化，其类似经过该重新编程程序后的接合子基因组的状态(图7A-7C)。第五，这些mirPS细胞的全基因组的基因表达模式已显示出与人类ES WA01(H1)及WA09(H9)细胞的模式有超过86％的高相似度(图8A及图9A)。第六，将这些mirPS细胞衍生的胚状体(EB)体内移植至免疫功能不足的SCID-beige小鼠中可形成类畸胎瘤组织囊肿，其包含所有三个胚胎生殖层(外胚层、中胚层及决定性的内胚层)(图10)。然而，不像畸胎瘤，这些组织囊肿相对于其周围组织形成极佳且清楚的边界。并且，这些囊肿在小鼠中的生长在移植后约2.5周时中止。这看来似乎是有一种自我调节的机制可体内地限制这些mirPS衍生EB细胞的随机生长。最后，通过在体外使用各种荷尔蒙和/或生长因子处理可使mirPS细胞的分化引导形成各种体细胞的及生殖系组织细胞类型，例如：神经元前体(neuronal progenitor)、软骨细胞、成纤维细胞及类精原细胞原生细胞(spermatogonia-like primordial cell)(图11A-11O)。此外，本发明 人已成功地使用电穿孔型转基因传送来形成这些mir-302所诱导的mirPS细胞株，其避免反转录病毒感染及细胞突变的风险(图2A及图2B)。这些发现提供了微型核糖核酸(miRNA)诱导干细胞生成的强力证据，其中mir-30家族的异位表达不仅能将成人体细胞及癌症细胞两者都重新编程为类ES多能性状态，而且能在无饲养层细胞培养条件下维持这些类ES mirPS细胞的再生及多能性。由于mir-302家族的功能可以91％-93％的高成功率将正常及癌症组织细胞两者都重新编程为类ES多能性干细胞，此新颖发明的这些发现可在干细胞及癌症治疗两者中提供有利的应用。 

由以上发现可知，本发明人还得知mir-302不仅能大幅度地抑制细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白D1及D2的表达以减弱细胞增殖及迁移，而且能抑制MECP2及MECP1-p66的活动以诱导基因组DNA的整体去甲基化(图8B-8C及图9B)。众所周知细胞周期蛋白E依赖性CDK2是进入细胞周期S期所必须的，且CDK2的抑制可导致G1期检验点停滞，其中细胞周期蛋白D1在响应DNA损害时可超越G1期停滞。根据比原则，mir-302对CDK2及细胞周期蛋白D1的抑制暗示一种事实：mirPS细胞具有极慢的分裂率。如图5A及图5C中所示，mirPS细胞的平均细胞周期是约20-24小时，其远慢于其体细胞/癌症对等物的平均细胞周期(每细胞周期约4-6小时)。肿瘤/癌症细胞无法以如此低的细胞增殖率生存。通过控制该细胞周期率，mir-302也可影响细胞的存活。因此，此癌症-干细胞周期转换的结果对癌症治疗有极大的好处。此外，对MECP2及MECP1-p66活动的抑制与图7A-7C的结果一致，其显示将恶性癌症细胞后天重新编程成良性mirPS细胞。可以想象，从患者所得的这些mirPS细胞可进一步帮助修补癌症的组织伤害。通过抑制基因组印记及细胞命运决定所必要的细胞基因，mir-302家族不仅能将分化体细胞/癌症细胞重新编程为类ES多能性状态，同时也能在无饲养层细胞培养条件下保持此类ES状态。此外，由于CDK2，细胞周期蛋白D1及D2的抑制也可减弱肿瘤/癌症细胞的这些细胞增殖及迁移率，mir-302家族扮演了对抗肿瘤细胞生长及形成的强力肿瘤抑制子的角色(Lin等人，2008b)。mir-302家族的此肿瘤抑制子特征可能有助于生成用于临床移植、干细胞及癌症治疗上的无肿瘤诱导多能性干细胞。根据我们目前的发现，mir-302 诱导mirPS细胞重新编程的机制较这些转录因子诱导iPS细胞的机制更加安全、清楚及可理解。 

总而言之，本新颖发明的mir-302家族表达系统提供一种安全且有力的用于新颖的类ES多能性干细胞生成(特别是源自身体毛囊细胞的原代培养，因为毛发较容易取得)的工具。由于内含子miRNA路径是以多个细胞内监测系统(例如：mRNA转录、RNA剪接、外体加工及NMD)严密调控，因此该路径较常规的siRNA/shRNA路径更加有效及安全(Lin等人，2008a)。本发明具有至少五个有益的突破。第一，mir-302表达转基因可代替在这些先前的仅从少数病人体细胞生成更具同源性的类ES多能性干细胞的iPS方法中所用的所有四个大型转录因子基因，这可改善病人的免疫系统的干细胞纯度及兼容性。第二，因为该mir-302表达转基因的总长度相对较小(约1千个碱基)，本方法的转基因传送率与iPS方法中的最大传送率2％相较是极高的(成功率超过91％)。第三，该mirPS细胞的生成及培养完全在无饲养层细胞状况下进行，避免了饲养层细胞抗原污染的风险。第四，本发明未使用癌基因，此避免了细胞变异及肿瘤形成的风险。最后，本发明人使用电穿孔法代替反转录病毒感染来传送单个mir-302表达转基因，此避免了随机反转录病毒插入该宿主细胞基因组的风险，其常会引起插入突变。事实上，mir-302已显示是强力的肿瘤抑制子，其甚至可将各种肿瘤/癌症细胞重新编程为类ES多能性干细胞(优先权为Lin等人拥有的美国专利申请号12/149,725)。总结来说，这些优点解决了这些iPS方法的三个主要问题，其避免了反转录病毒感染、癌基因突变及不确定的肿瘤发生的风险。 

本发明除了生成类ES多能性细胞株的一般功能外，本发明的可能应用进一步包含用于以下方面的方法：维持无饲养层细胞及无肿瘤ES细胞培养状况、避免癌症细胞分化及转化、分离纯或同源干细胞群、成人干细胞株的体外克隆及纯化、体外导引干细胞分化成纯身体组织，以及开发使用所得的类ES多能性干细胞进行移植及干细胞治疗。本发明也可用来作为研究干细胞功能及机制，或提供用于针对特定用途而改变干细胞的特性的组合物及方法的工具。在其它具体实施方式中，本发明的这些类ES多能性干细胞可由正常及癌症体细胞以及哺乳动物(例如：人类、猴、狗、猫、大鼠及可能是小鼠)的成年干细胞 生成。 

附图简要说明 

具体参照附图，这些附图用于说明的目的而不是限制本发明，说明如下： 

图1A-B描述内含子miRNA生物发生及其相对的基因沉默效应的机制。(图1A)将内含子miRNA转录成前体信号RNA(pre-mRNA)的一部分，其包含蛋白质编码的外显子及非编码内含子。将这些内含子从pre-mRNA中剪接出来，并将一些它们的二级结构进一步切割成能够诱导靶基因沉默的小型类miRNA分子，而这些外显子被结合在一起以形成成熟的mRNA以供标记蛋白质合成。(图1B)将预先设计的内含子miRNA转基因转染到Tg(actin-GAL4：UAS-gfp)品种斑马鱼的实施例显示：对靶绿色EGFP表达具有强力的基因沉默效应(＞80％的抑制，左边第4列)，然而其它非靶插入片段则没有影响，包括(从第1列至第5五列)：不含miRNA的空内含子(1)，其是具有对抗HIV-p24(2)或整联蛋白β1(3)的pre-miRNA插入片段的内含子，以及具有anti-EGFP pre-miRNA插入片段但无功能5’端剪接位的内含子(5)。将该anti-EGFP pre-miRNA插入红移萤光标记(RGFP)基因的5’近端内含子区域。RNA印迹分析法(右图)显示成熟的miRNA家族仅由该pre-miRNA-插入RGFP的这些剪接产物生成，而非该空RGFP(-)或该有缺陷的RGFP(Δ)，这表示在内含子miRNA生物发生中需要RNA剪接。 

图2A及2B描述使用包含SpRNAi-RGFP转基因的修饰Tet-On载体(即：pTet-On-tTS-mir302s)的构建及策略，以表达mir-302s pre-miRNA基因群或shRNA。一种电穿孔型转基因传送方法是用来将该表达mir-302 SpRNAi-RGFP的转基因转染入靶体细胞/癌症细胞。 

图3A-3C显示将人类正常毛囊hHFC细胞及癌症黑色素癌Colo细胞重新编程为类ES多能性干(mirPS)细胞，其使用预先设计的Tet-On mir-302-表达转基因的电穿孔型转染。(图3A)在Tet-On可诱导载体(即：pTet-On-tTS-miR302s)中的重组mir-302-表达转基因(即：SpRNAi-RGFP)的构建体。该SpRNAi-RGFP转基因是以370碱基对(bp)同源区域为侧翼，其用来重组插入人类细胞基因组的靶位。(图3B)该mir-302pre-miRNA基因群(mir-302s)的构建体，其作为该SpRNAi-RGFP 转基因的内含子的一部分并入。(图3C)使用FACS流式细胞仪选出阳性mir-302-转导的mirPS细胞，该流式细胞仪通过抗RGFP标记的抗体来分选细胞。目前本发明的转基因传送的成功率经测量约为91％-93％。 

图4A-4B显示在该mirPS细胞基因组的Tet-On mir-302-表达SpRNAi-RGFP转基因的整合，其造成在各种强力霉素(Dox)浓度的控制下的这些mir-302家族成员(mir-302s)的可诱导表达。(图4A)由不同mirPS细胞株分离的基因组DNA的定量PCR(qPCR；左图)分析，其显示所有的mirPS细胞仅携带该转基因的一或两个伴随拷贝，其中在原hHFC及Colo细胞(对照组)中未检测到转基因。萤光原位杂交(FISH；右图)实验进一步地显示该转基因被插进这些人类基因组的特定位置中。此种限制的转基因插入暗示整体mir-302表达的浓度可影响mirPS细胞的存活。(图4B)对应于该Dox浓度的该可诱导mir-302s表达的RNA印迹分析及柱形图展示。 

图5A-5C显示将人类正常毛囊(hHFC)及癌症黑色素癌Colo细胞重新编程为类ES多能性干(mirPS)细胞的变化。(图5A)在这些mir-302-转导细胞(即：mirPS-hHFC及mirPS-Colo细胞)中的形态及细胞增殖率的改变。在具强力霉素(Dox)诱导的mir-302-转导细胞中发现类ES圆形细胞形状及极慢的细胞再生率。(图5B)源自这些mirPS细胞的胚状体(EB)的形成以及经导引分化成具阳性Tuj1和/或ABCA2标记的神经元前驱细胞。(图5C)在有限稀释后，由单一mirPS细胞形成EB的时程变化图。这些细胞周期估计约为20-24小时。 

图6A-6B显示mir-302s转染及ES标记表达间的相关性。(图6A)整体miRNA表达的微矩阵分析，其显示全部的mir-302家族成员(mir-302s)在用Dox诱导的mirPS细胞中高度表达，而在这些原始的体细胞中不表达(n＝3，p＜0.01)。(图6B)RNA印迹及蛋白质印迹分析显明用Dox诱导的这些mirPS细胞表达了丰富的ES细胞标记，包括：Oct3/4(Oct4)、SSEA-3、SSEA-4、Sox2及Nanog，但表达较少的Klf4(n＝4，p＜0.01)，这与在人类ES WA01-H1及WA09-H9细胞中观察到的细胞标记极为相似。 

图7A-7D显示在各种mirPS细胞株中的基因组DNA去甲基化的型式。(图7A)HpaII酶切显示在mirPS细胞中全基因组范围内的整体CpG甲基化的丧失。 (图7B)Oct3/4启动子的9,400碱基对调节区域中的未甲基化的ACGT位经亚硫酸氢盐修饰为AUGT位，其显示在所有mirPS细胞中未甲基化的ACTG(或AUCT)位的显著增加。(图7C)亚硫酸氢盐DNA测序，其显示侧翼链接Oct3/4启动子的起始位的详细甲基化示意图。黑色圆圈及白色圆圈分别表示这些甲基化及未甲基化的胞嘧啶位。(图7D)与mirPS-PC3细胞的起始转移性癌症PC3细胞相较，mirPS-PC3细胞的迁移能力的丧失。 

图8A-8B显示在Colo、mirPS-Colo及人类ES WA01-H1(H1)与WA09-H9(H9)细胞间的全基因组基因表达分析。(图8A)使用人类基因组GeneChipU133A&B plus 2.0Array(Affymetrix)比较改变的基因表达样式，其显示在mirPS-Colo与H1(89％)以及H9(86％)间的高相似度，但与癌症型Colo(53％)细胞较不相似。白点表示与该稳定表达基因(绿点)相较的高度可变基因。(图8B)微矩阵识别分化表达基因的功能性基因群，其证明在mirPS细胞中检测到：ES细胞标记的显著增加与黑色素癌癌基因、发育信号以及mir-302-靶细胞增殖与DNA甲基化基因的显著减少，其极为类似H1及H9细胞中所检测到的现象(n＝4，p＜0.01)。图8C显示RNA印迹及蛋白质印迹分析，其确认在mirPS-Colo细胞中mir-302s、人类ES细胞标记及预测的mir-302靶基因的表达样式间的相关性，这与人类ES H1及H9细胞中的表达样式类似，除了Klf4的表达以外(n＝3，p＜0.01)。 

图9A-9B显示在hHFC、mirPS-hHFC及人类ES WA01-H1(H1)与WA09-H9(H9)细胞间的全基因组基因表达分析。(图9A)使用人类基因组GeneChip U133plus 2.0Array(Affymetrix)比较改变的基因表达样式，其显示在mirPS-hHFC与H1(96％)以及H9(91％)间的高相似度，但与hHFC(47％-56％)体细胞较不相似。(图9B)蛋白质印迹分析，其确认在mirPS-hHFC细胞中mir-302s、人类ES细胞标记及预测的mir-302靶基因的这些表达样式间的相关性，这与人类ES H1及H9细胞中的这些表达样式类似，除了Klf4及Klf5的表达以外。所列出的mir-302靶基因包括：十七个转录调节子、一个组蛋白去乙酰酶(HDA4)、两个甲基CpG-结合蛋白(MECP1-p66及MECP2)，以及三个细胞周期检验点蛋白质(CDK2、细胞周期蛋白D1及D2)。 

图10显示源自在雌性假性怀孕免疫功能不足SCID-beige小鼠的子宫或腹腔中的mirPS移植物的类畸胎瘤原生组织(n/总＝6/6)。这些已分化组织包含所有三个胚胎生殖层：外胚层、中胚层及内胚层，此是在苏木精及曙红(H&E)染色后以其截然不同的细胞形态来判定。显微镜照片是以Nikon TE2000系统在200x放大倍率下拍摄。 

图11A-11O显示mirPS细胞的导引多能性。分别由上至下用DHT、TGF-β1及BMP4在免疫功能不足的小鼠中离体处理，将该mirPS细胞诱导分化成类精原细胞(图11A-11E)、成纤维细胞(图11F-11J)及软骨细胞(图11K-11O)组织细胞。该免疫功能不足的裸鼠是用于体内环境模仿移植治疗。由左至右显示的显微照片表明：使用微分干涉差的苏木精染色(图11A、11F、11K)、以转基因mir-302标记RGFP标计的明视野(红色)(图11B、11G、11L)、以4，6-二脒基-2-苯基吲哚标计的第一组织标记的免疫染色法(蓝色DAPI)(图11C、11H、11M)、以萤光素标示的第二组织标记的免疫染色法(绿色EGFP)(图11D、11I、11N)，以及所有三个萤光标记的合并(图11E、11J、11O)。在这些RGFP-明视野中的小窗口中显示在高放大倍率(600x)下的分化mirPS细胞的形态。 

具体实施方式

尽管现将参考附图描述本发明的特定具体实施方式，但应理解的是这些具体实施方式仅作为举例的方式，且仅仅说明少数的许多可能特定的具体实施方式，其可代表本发明的原理的应用。对于本领域的技术人员来说，各种改变及修正皆属于随附权利要求所进一步定义的本发明的精神、范畴及构想内是显而易见的。 

本发明提供一种新颖核酸组合物及转基因方法，其使用可诱导重组类微型核糖核酸(miRNA)小发夹型核糖核酸(shRNA)将哺乳动物体细胞/癌细胞的基因及行为特征重新编程成类胚胎干(ES)细胞多能性状态。换句话说，本发明提供一种方法，其将至少一哺乳动物细胞重新编程为至少一多能性类干细胞。该方法包含以下几个步骤：提供至少一种细胞基质，其表达多个由mir-302所靶向的细胞基因；提供至少一种重组核酸组合 物，其可被传送、转录及加工成与该细胞基质中mir-302同源的至少一个基因沉默效应子；及在mir-302所靶向的这些细胞基因受抑制的条件下，以该重组核酸组合物处理该细胞基质。不同于原先shRNA的设计，本发明的shRNA可包含类似于天然mir-302(pre-mir-302)的错配茎臂(stem-arm)。另外，本发明的shRNA亦可包含一改良的pre-mir-302径环，如：5’-GCTAAGCCAG GC-3’(SEQ.ID.NO.1)及5’-GCCTGGCTTA GC-3’(SEQ.ID.NO.2)，其可提供与天然pre-miRNA相同的核输出效率，且不会干扰tRNA输出。换句话说，该基因沉默效应子包含与SEQ.ID.NO.1序列或SEQ.ID.NO.2序列同源的序列。在未受限于任何特定理论下，此种重新编程是针对于新发现的mir-302-介导基因沉默机制，其可由能够表达mir-302家族基因群(mir-302s)或mir-302-同源shRNA的重组转基因的转染来触发。 

在一种较佳具体实施方式中，本发明的转基因表达的设计是基于天然内含子miRNA生物发生的路径(图1A)。本发明人设计了一种新颖核酸组合物，其表达编码红移萤光蛋白质(RGFP)的重组转基因，即：SpRNAi-RGFP，其包含能够通过细胞内RNA剪接及加工机制制造内含子miRNA和/或类shRNA基因沉默效应子的能够人造/人工剪接的内含子(SpRNAi)(Lin等人，2003，2006a、2006b)。实施例1描述用来设计及构建该SpRNAi内含子及SpRNAi-RGFP转基因的操作程序。该SpRNAi在该SpRNAi-RGFP基因的前体转录物(pre-mRNA)内通过哺乳动物第二型RNA聚合酶(Pol-II)共同转录，并通过RNA剪接/加工切除。之后，进一步将所剪接的SpRNAi加工成成熟的基因沉默效应子，如：天然miRNAs及人造shRNAs，以对靶基因引发特定的转录后基因沉默(PTGS)效应。在此例中，本发明生成一种重组mir-302s和/或一种与该mir-302s同源的shRNA。同时，在内含子剪接后，将该SpRNAi-RGFP基因转录物的外显子连接在一起以形成成熟的RGFP mRNA，用来转译成用于识别所需miRNA/shRNA表达的红色萤光标记蛋白质。或者，可使用一些功能性蛋 白质外显子来代替RGFP以提供额外的基因功能，如：ES细胞标记基因Oct4、Sox2、Nanog、LIN-28、SSEA3及SSEA4。 

在另一中较佳具体实施方式中，本发明提供一种用来将哺乳动物体细胞/癌细胞转重新编程为类ES多能性干细胞的新颖方法(图2A及图2B)，其使用分离的可药物诱导的核酸组合物，该组合物可被传送、转录及加工成哺乳动物细胞中的类mir-302miRNA/shRNA分子/同源物；因此在这些细胞中的mir-302所靶向的发育及分化相关基因中诱导特定的基因沉默效应，该方法包含以下步骤：a)提供细胞基质，其表达多个由mir-302家族所靶向的发育及分化相关基因，及b)提供重组核酸组合物，其能够转录编码多个非编码mir-302miRNAs/shRNAs或其同源物的分离的RNA，其可通过细胞内机制依次被加工为成熟的mir-302miRNAs/shRNAs或其同源物，因此能抑制在该细胞基质中的这些靶基因的功能；c)在该细胞基质中的这些靶基因功能受抑制的条件下，以该重组核酸组合物处理该细胞基质。更佳地是，该可药物诱导的重组核酸组合物是Tet-On载体，其包含插入有重组mir-302家族基因群(mir-302s；SEQ.ID.NO.29-SEQ.ID.NO.36的杂合物)或人造重设mir-302shRNA同源物(即：SEQ.ID.NO.27及SEQ.ID.NO.28的杂合物)的SpRNAi-RGFP转基因。换句话说，该重组核酸组合物包含可药物诱导的基因表达载体。此外，该重组核酸组合物可包含基因表达载体，该载体选自质粒、病毒载体、反转座子、及其组合。另外，重组核酸组合物包含Tet-On或Tet-Off基因表达载体。该细胞基质可以体外、离体或体内的方式表达该mir-302miRNA/shRNA及其靶基因。实施例2及3描述用于mir-302miRNA/shRNA构建体及转基因传送的操作程序。 

本发明人利用细胞内剪接体、外体及NMD系统的优点来催化内含子mir-302miRNA/shRNA因子从该SpRNAi-RGFP转基因中释放。在实施例1及图2A与图2B中分别描述了通过在该SpRNAi的数个snRNP辨识位上的细胞内剪接体成分的序列DNA重组[例如：snRNPs U1、U2及U4/U6.U5tri-snRNP所需的结合基序，其包含：5’端剪接位(SEQ.ID.NO.4)、 分支点基序(BrP；SEQ.ID.NO.6)、多嘧啶串(PPT；SEQ.ID.NO.7或SEQ.ID.NO.8)、及3’端剪接位(SEQ.ID.NO.5)]，用来将合成snRNP辨识元件组装到SpRNAi内含子以及将此人工重组的SpRNAi并入到分离可诱导RGFP基因中以形成该SpRNAi-RGFP转基因的方法。此外，该SpRNAi进一步包含内含子插入位，其位于用来克隆及表达重组mir-302miRNA/shRNA因子的5’端剪接位及BrP基序之间。实施例2及图3B描述重组mir-302家族基因群(mir-302s)或人造重设mir-302shRNA同源物的构建体。实施例3及图3C描述将该重组mir-302s miRNA/shRNA转染到感兴趣的细胞中，以及阳性转基因细胞的筛选。换句话说，该多能性类干细胞是选择性地使用mir-302微型核糖核酸或Oct3/4作为标记来分离。实施例4-12描述用来评估将哺乳动物体细胞/癌细胞重新编程为类ES多能性细胞的测验。图4至图11显示这些测验的结果。 

能表达类mir-302miRNA或shRNA的可诱导SpRNAi-RGFP转基因表达系统的设计及建构

本发明使用可诱导Tet-On/Off内含子miRNA/shRNA表达系统，即pTet-On-tTS-miR302s(图3A)，用以在强力霉素诱导的控制下并通过细胞内内含子miRNA生物发生的机制来触发类mir-302基因沉默效应子的转基因表达(图1A)。实施例1及2描述了pTet-On-tTS-miR302s的建构。当pTet-On-tTS-miR302s表达载体转染到感兴趣的细胞中后，其转录TRE-Pol-II-驱动重组转基因，即SpRNAi-RGFP，其包含能够生成内含子基因沉默效应子的能够人工剪接的内含子(SpRNAi)(图3A及图3B)，如类发夹型miRNA及shRNA。实施例1中显示通过序列接合几个合成的DNA序列的基因工程，将SpRNAi并入到红移萤光蛋白质基因(RGFP)中。SpRNAi包含前体miRNA或shRNA插入片段(插入位)，其可由细胞内RNA剪接及加工机制释出，如：剪接体、外显子及NMD系统的成分，然后触发内含子RNA-介导基因沉默机制。其它能够用来携带并生成SpRNAi的RNA转录物包含：hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、smnRNA、病毒RNA、pre-microRNA及其前体与衍生物。 

如实施例1所示，合成SpRNAi并将其并入到不含内含子的红移萤光蛋白质基因(RGFP或rGFP)中，以形成SpRNAi-RGFP转基因，其是自紫点海葵(Heteractis crispa)的HcRed1色素蛋白变异而成。由于所插入的SpRNAi中断了RGFP的功能性萤光蛋白质结构，因此在成功转染的细胞或有机体中于570-nm波长下，我们可通过该红色萤光放射的再出现来确定内含子的移除及RGFP-mRNA变异(图1B)。此重组SpRNAi-RGFP转基因的建构是基于前体信使RNA(pre-mRNA)中的剪接体内含子的天然结构。SpRNAi的主要成分包含几个snRNP辨识位及接头，如：在末端中用于精确切割的5’端及3’端剪接位、用于剪接辨识的分支点基序(BrP)、用于剪接体相互作用的多嘧啶串(PPT)、用于连接各成分的接头、以及用于所需的内含子插入的一些限制位。本发明的SpRNAi包含，由5’端往3’端方向按结构依序列出：5’端剪接位、与类mir-302基因沉默效应子同源的内含子插入片段、分支点基序(BrP)、多嘧啶串(PPT)、及3’端剪接位。此外，一些转译终止密码子(T密码子)可位于接近SpRNAi的该3’端剪接位的接头序列中。 

一般而言，该5’端剪接位包含5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或GU(A/G)AGU基序或与它们同源的核苷酸序列(如：5’-GTAAGAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.37)、5’-GTAAGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’及5’-GTAAGT-3’)，而该3’端剪接位包含GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG基序或与它们同源的核苷酸序列(如：5’-GATATCCTGC  AG-3’(SEQ.ID.NO.42)、5’-GGCTGCAG-3’及5’-CCACAG-3’)。而且，分支点基序位于该5’端剪接位及该3’端剪接位之间，其包含与5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)基序同源的同源物，如：5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’。该分支点序列的腺核苷“A”核苷酸在几乎所有的剪接体内含子中通过细胞(2’-5’)寡腺苷合成酶及剪接体形成一部分的(2’-5’)连接的套马索内含子RNA。此外，多嘧啶串位于接近该分支点及该3’端剪接位之间，其包含与5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)或5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)基序同源的高T 或C含量的寡核苷酸序列。符号“m”及“n”表示多个重复，其≥1；更佳地，m的数量等于1～3且n的数量等于7～12。符号“-”是指在该序列中可被略过的核苷酸。也有一些接头核苷酸序列是用来连接所有这些内含子成分。根据37CFR 1.822中关于用在核苷酸和/或氨基酸序列资料的符号及格式的准则，符号W是指腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号K是指鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号S是指胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，符号Y是指胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号R是指腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，及符号N是指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。关于上列所有的剪接体辨识成分，去氧胸苷(T)核苷酸可用尿核苷(U)代替。 

为测试经剪接SpRNAi插入片段的功能，可将各种基因沉默效应子构建体克隆至该重组SpRNAi-RGFP转基因的内含子插入位中。该内含子插入位包含多个限制及克隆位，其可通过限制酶来辨识，这些限制酶选自AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI核酸内切酶及其组合。这些内含子插入片段是DNA模板，其可转录成高度二级结构，这些结构选自：套马索型RNA、短暂小分子RNA(stRNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹型RNA(shRNA)、微型核糖核酸(miRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、核糖酶、及正义或反义构型的前体与衍生物、或以上两者、及其组合。 

为了方便转基因传送进感兴趣的细胞或有机体中，本发明的SpRNAi-RGFP转基因较佳地被并入到能够表达的载体中，该载体选自DNA转基因、质粒、反转座子、转座子、跳跃基因、病毒载体、及其组 合。所得的这种转基因表达载体较佳地通过高效率基因传送方法引入该细胞或有机体中，该基因传送方法选自化学/脂质体转染法、电穿孔法、转座子介导DNA重组、跳跃基因插入、病毒感染、显微注射、基因枪穿透、及其组合。换句话说，该重组核酸组合物是通过基因传送方法引入该哺乳动物细胞中，该基因传送方法选自脂质体转染、化学转染、转基因DNA重组、病毒感染、转座子插入、跳跃基因插入、显微注射、电穿孔法、基因枪穿透、及其组合。该载体可进一步包含至少一个病毒、Pol-II、或Pol-III启动子、或其组合，用以表达该SpRNAi-RGFP转基因。更佳地是，以电穿孔法将该转基因并入到Tet-On/Off载体中并转基因地传送入靶细胞内，如实施例3所示。此外，该载体可包含：用以增加真核细胞的转译效率的Kozak共有转译初始位、该SpRNAi-RGFP转基因下游的多个SV40聚腺苷酸化信号、用来在原核生物细胞内增殖的pUC复制起始点、用来将该SpRNAi-RGFP构建建体并入在到该载体中的至少两个限制位、用来在表达SV40T抗原的哺乳动物细胞中复制的任选的SV40复制起始点、以及用来在具有复制能力的原核生物细胞中表达抗生素抗药性基因的任选的SV40早期启动子。换句话说，该重组核酸组合物选自四环素反应元件、病毒或第二型RNA聚合酶(Pol-II)启动子、或以上两者、Kozak共有转译起始位、聚腺苷酸化信号、多个限制/克隆位、及其组合。此外，该重组核酸组合物选自pUC复制起始点、用来在具有复制能力的原核生物细胞中表达至少一种抗生素抗药性基因的SV40早期启动子、用来在哺乳动物细胞中复制的任选的SV40复制起始点、及其组合。该抗生素抗药性基因的表达可用来作为选择标记，其可用来分离具该转基因表达的阳性克隆。这些抗生素选自盘尼西林G、安比西林、新霉素、巴龙霉素(paromycin)、卡那霉素、链霉素、红霉素、斯派克霉素(spectromycin)、霍火霉素(phophomycin)、四环素、利福霉素、两性霉素B、庆大霉素、氯霉素、头孢霉素、泰乐霉素、及其组合。 

已在Tg(actin-GAL4：USA-gfp)品种斑马鱼中体内地测试使用该SpRNAi-RGFP转基因的内含子miRNA/shRNA的表达以靶向其绿色 EGFP基因表达的策略。如实施例6及图1B中所示，表达人工重组anti-EGFP pre-miRNA插入片段(第4列)的SpRNAi-RGFP质粒的脂质体转染，在EGFP上显示极强的基因沉默效应(＞80％基因敲除)，然而在下列指出的自左列至右列的这些插入片段中并未观察到其它沉默效应：(1)空白载体对照(Ctl)；(2)靶向HIV-p24的pre-miRNA插入片段(模拟)；(3)不具有发夹型环状结构的反义EGFP插入片段(反义(anti))；及(5)反向的pre-miRNA序列，其与该anti-EGFP pre-miRNA完全互补(miR^*)。并且，在非靶基因上并未检测到任何效应，如：标记RGFP及管家β-肌动蛋白基因，其暗示这种内含子miRNA-介导基因沉默具有高度靶向专一性。另外，通过RNA印迹分析法(图1B，右方)，我们观察到小型内含子基因沉默效应子的生成仅源自该设计的SpRNAi-RGFP基因转录物(左列)，而非源自不含内含子的RGFP的天然转录物(中列)或不含功能性5’端剪接位的缺陷性SpRNAi-RGFP构建体的转录物(右列)，而经剪接的RGFP外显子被连接在一起以形成用来转译该标记红色萤光蛋白质的成熟RNA。 

重组mir-302家族基因群及类mir-302shRNA同源物的设计及建构

因为一些天然pre-miRNA的发夹型环状结构太大和/或太复杂而不适合用于该SpRNAi-RGFP转基因，所以本发明人设计了修饰的tRNA^met环(即：5’-(A/U)UCCAAGGGGG-3’)(SEQ.ID.NO.43)来代替这些天然pre-miRNA环。该tRNA^met环显示能如同天然miRNAs一样通过相同的Ran-GTP及输出蛋白(Exportin)-5传送机制有效地促进将人造重设的miRNA自细胞核输出至细胞质(Lin等人，2005)。有利地是，本发明目前使用一对人造改良的pre-mir-302环，包含：5’-GCTAAGCCAG GC-3’(SEQ.ID.NO.1)及5’-GCCTGGCTTA GC-3’(SEQ.ID.NO.2)，其提供与天然pre-miRNAs相同的核输出效率，且不会干扰tRNA输出。并且，此改良加强了mir-302a-mir-302a^*及mir-302c-mir-302c^*双链体的形成，其可稳定mir-302家族的整体功能。这些新颖pre-miRNA环的设计是以tRNA^met环及mir-302b/mir-302a的短径环的结合来修饰，其在胚胎干细胞中而非 在其它分化组织细胞中高度表达。因此，在mir-302家族中使用这些人造/人工pre-miRNA环将不会干扰我们身体中的天然miRNA路径，因而细胞毒性较少且更加安全。 

这些mir-302a、mir-302b、mir-302c及mir-302d的成熟序列分别为’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUGG UGA-3’(SEQ.ID.NO.10)、5’-UAAGUGCUUC  CAUGUUUUAG  UAG-3’(SEQ.ID.NO.11)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3’(SEQ.ID.NO.12)、及5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.13)。这些mir-302家族基因沉默效应子在其前十七个核苷酸中具有高度保守的5’端区域(100％同源性)，其与5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)完全相同。换句话说，该基因沉默效应子包含与SEQ.ID.NO.3同源或互补、或既同源又互补的序列。在设计与这些mir-302序列同源的序列中，胸腺嘧啶(T)可用来代替尿嘧啶(U)。 

如实施例2中所述，家族mir-302pre-miRNAs的基因群是以合成的mir-302同源物的杂合及连接/接合来形成，其从5’端至3’端方向包含四个部分：mir-302a、mir-302b、mir-302c及mir-302d pre-miRNA(图3B)。所有这些人造重设的mir-302miRNA/shRNA同源物在其前十七个核苷酸中具有完全相同的5’端[例如：5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)]。或者，我们可使用人造重设的mir-302shRNA来代替mir-302pre-miRNA基因群以促进内含子插入。该重设的mir-302shRNA是通过合成的正义mir-302家族，5’-GTCCGATCGT CATAAGTGCTTCCATGTTTT AGTGTGCTAA GCCAGGCACA CTAAAACATGGAAGCACTTA TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.27)及反义mir-302家，5’-ATGACGCGTC GATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCCTGGCTTAGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TGACGATCGG AC-3’(SEQ.ID.NO.28)的杂合来形成。此重设的mir-302shRNA与所有天然的mir-302成员分享超过91％的同源性，并靶向人类中相同的mir-302-靶基因。 

将可诱导的mir-302-表达SpRNAi-RGFP转基因传送进人类正常毛囊(hHFC)及癌症黑色素癌Colo细胞的原代培养中

由于该重组SpRNAi-RGFP转基因的内含子插入位在其5’端及3’端分别以PvuI及MluI限制/克隆位为侧翼，故该初级插入片段可容易地通过各种pre-miRNA/shRNA插入片段(例如：mir-302pre-miRNA/shRNA)移除及取代，所述的pre-miRNA/shRNA插入片段具有与所述的PvuI及MluI限制位相配的粘性末端。通过改变针对各种基因转录物的内含子的插入片段，该内含子miRNA/shRNA表达系统可用作体外及体内地诱导靶向基因沉默的有力工具。在实验中，首先将该mir-302pre-miRNA/shRNA插入该SpRNAi-RGFP转基因中，然后将该转基因并入到该pTet-On-tTS载体的该克隆位(即：XhoI-ClaI位)内，以形成pTet-On-tTS-miR302s转基因表达载体(图3A)。其后，将该pTet-On-tTS-mir302载体(10-30μg)与这些宿主细胞(200-2000)在低渗性pH缓冲液(400μl；微型离心管(Eppendorf))中混合，且在400-450伏特下实行电穿孔100微秒(μsec)以将该转基因传送进这些宿主细胞基因组内。在72小时后分离并收集基因阳性转基因细胞，使用FACS流式细胞仪通过anti-RGFP及anti-Oct3/4单株抗体来筛选(图3C)。此新颖mir-302s转基因方法的成功率经测量超过91％。因为该SpRNAi-RGFP转基因是以同源区域为侧翼而重组插入至不包含基因的特定基因组位(图4A)，故该SpRNAi-RGFP转基因所编码的mir-302miRNA/shRNA效应子的表达全依取决于pTet-On-tTS载体的TRE-CMV启动子的Dox诱导活化。该pTet-On-tTS载体包含CMV驱动的tTS抑制剂基因以去活化该转基因的TRE-CMV启动子。当强力霉素(Dox)存在时，tTS的功能被Dox抑制住，因此表达出该SpRNAi-RGFP转基因及其编码的mir-302家族(图4B)。 

在不含饲养层细胞培养条件下将人类正常及癌症体细胞重新编程成类ES状态

如实施例1-2及图3A-3B所述，我们已设计并建构可诱导的SpRNAi-RGFP转基因，其编码人造连接的mir-302a-mir-302b-mir-302c- mir-302d(mir-302s)pre-miRNA或重设的类mir-302shRNA[例如：类发夹型序列，包含5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.9)]，然后测试该转基因以用来沉默各种体细胞及癌细胞(如人类正常毛囊细胞(hHFC)及癌症黑色素癌Colo细胞)中的发育及分化相关靶基因。 

如图2A及图2B中所示的程序，本发明人分别将该重组的mir-302spre-miRNA基因转基因传送入hHFC细胞内，以及将该重设的mir-302shRNA同源物(SEQ.ID.NO.9)基因转基因传送入Colo细胞内。换句话说，该基因沉默效应子是重组的类发夹的RNA，其包含与SEQ.ID.NO.9同源的序列。在以Dox诱导异位mir-302表达后，所有这些mir-302转导/诱导多能性干(mirPS)细胞株的形态从纺锤形转形为圆形(下方图)，这表示它们不仅可能会丧失迁移的能力，还可能具有类似ES细胞生长的极慢的细胞再生率(图5A)。流式细胞仪分析比较细胞周期阶段的DNA含量(上方图；实施例7)进一步显示：在mirPS细胞的有丝分裂细胞群体减少超过67％，这暗示这些细胞增殖率远低于其身体/癌症来源的细胞的增殖率。平均地，这些细胞群体在不含饲养层细胞的培养条件下每20-24小时分裂一次，所述培养条件包括在37℃及5％CO₂下，在DMEM/F12或RPMI1640/B27培养液中，这些培养液补充成分为10％炭吸附胎牛血清(FBS)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5ng/ml活化素、5ng/ml头发生素(Noggin)、3ng/ml bFGF、以及0.5μM Y-27632与0.5μMGSK-3抑制剂XV的等量混合物(即：mirPS细胞培养基)。换句话说，可在DMEM/F12或RPMI 1640/B27培养液中不含饲养层细胞培养这些多能性类干细胞，该培养液的补充成分为10％炭吸附FBS、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5ng/ml活化素、3ng/ml bFGF、以及0.5μM Y-27632与0.5μMGSK-3抑制剂XV的等量混合物。流式细胞仪图表的第一(左)及第二(右)峰值表示在该整个测试细胞群体中休眠的G0/G1及有丝分裂M期的细胞群体的含量。在该mir-302s转染后，该有丝分裂细胞群体(M期)在hHFC中自41％减少到11％，且在Colo细胞中自36％减少到11％，然而在以空 SpRNAi-RGFP载体及Dox(+Dox)或不含Dox的mir-302表达SpRNAi-RGFP载体(+mir-302s-Dox)转染后，其细胞形态或细胞增殖率皆不会有明显的改变。根据这些发现，我们展示异位mir-302s表达能将正常及癌症人类体细胞重新编程为类ES细胞的形态及细胞分裂率。 

源自各种mirPS细胞的胚状体的形成

所有这些mirPS细胞皆能形成源自人类胚胎干(ES)细胞的胚状体(EB)的紧密细胞群落(图5B)。换句话说，这证明本发明所重新编程的这些多能性类干细胞可形成胚状体。当以胰蛋白酶EDTA及胶原蛋白酶IV的混合物分离这些类EB细胞，然后在仅具有10％FBS补充成分的RPMI 1640培养液中培养这些类EB细胞后，这些类EB细胞会分化成神经元祖细胞，其中有许多这些神经元祖细胞表达神经元标记Tuj1和/或ABCA2。在有限稀释及进一步在该不含饲养层细胞的DMEM/F12培养液(补充成分为10％炭吸附FBS、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5ng/ml活化素、3ng/ml bFGF、以及0.5μMY-27632与0.5μM GSK-3抑制剂XV的等量混合物)中培养后，每个mirPS细胞可继续形成用来传代培养和/或移植/植入测验的纯胚状体(图5C)。鉴于这些类ES干细胞特性，我们接着在这些mirPS细胞中检验mir-302s及ES细胞标记的表达，并与人类ESWA01-H1及WA09-H9细胞作比较。 

在mirPS细胞中的mir-302s表达的微型核糖核酸(miRNA)微矩阵分析

为确认这些mirPS细胞中的转基因mir-302表达，我们实行实施例9中所述的微型核糖核酸(miRNA)微矩阵分析。如图6A所示，miRNA微矩阵分析显示，与原始体细胞(对照组)相较，在Dox处理(100μM)后所有mir-302成员的表达率(最右下方，白色方圈)在这些mirPS-hHFC细胞中明显地增加。mir-302s在mirPS细胞中的表达程度与Dox诱导的浓度成比例对应(图4B)，如RNA印迹法所确定。在mirPS-Colo细胞中也观察到相同的结果(Lin等人，2008b)。在早期EB阶段，使用mirVana^TM miRNA分离试剂盒(Ambion Inc.，Austin，TX)自每一种细胞株分离出多个小型RNA。这些分离的小型RNA的纯度及品质是使用3.5％甲醛-琼脂糖凝胶 电泳及光谱仪测量(Bio-Rad，Hercules，CA)来评估，然后立刻送交至LCSciences(San Diego，CA)进行微矩阵分析。在Cy3及Cy5强度影像(蓝背景)中，当信号强度自第1级增加至第65,535级时，对应的色彩由蓝色转变成绿色、黄色，再到红色。在Cy5/Cy3比的影像(黑背景)中，当Cy3级高于Cy5时，色彩为绿色；当Cy3级等于Cy5级时，色彩为黄色；及当Cy5级高于Cy3级时，色彩为红色。由于在天然mir-302家族成员及本发明的人造重设mir-302pre-miRNA/shRNA因子之间的这些成熟RNA序列分享极高的同源性(＞91％)，此结果表示这些重设mir-302因子可取代天然mir-302s的功能。 

根据此结果，我们还发现mir-302表达的提高可进一步地增加一些其它miRNA的表达，如：mir-92、mir-93、mir-200c、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373、mir-374、及整个mir-520家族成员。根据对这些miRNAs的预测的靶基因的分析，使用链结至Sanger miRBase::Sequences网站(http://microrna.sanger.ac.uk/)的“TARGETSCAN”(http://www.targetscan.org/vert_42/)及“PICTAR-VERT”(http://pictar.bio.nyu.edu/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi？)程序展示mir-302与这些miRNA分享超过400个靶基因，这表示这些miRNA在维持干细胞多能性与再生方面亦可能扮演了重要的角色。这些保守的靶基因包括但不限于：RAB/RAS-相关癌基因的成员、ECT相关癌基因、多形性腺瘤基因、E2F转录因子、类细胞周期蛋白D结合Myb转录因子、HMG-box转录因子、Sp3转录因子、类转录因子CP2蛋白质、NFkB活化蛋白基因、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、MAPK相关激酶、SNF相关激酶、肌球蛋白轻链激酶、TNF-α-诱导蛋白基因、DAZ相关蛋白基因、LIM相关同位序列基因、DEAD/H box蛋白基因、叉头盒蛋白基因、BMP调节子、Rho/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子、IGF受体、内皮素受体、左右决定因子、细胞周期蛋白、p53可诱导核蛋白基因、类RB 1、RB结合蛋白基因、最大结合蛋白基因(Max-bindingprotein genes)、免疫识别的c-MIR细胞调节子、类Bcl2凋亡促进子、原钙粘附蛋白(protocadherins)、整合蛋白β4/β8、抑制素、锚蛋白、SENP1、 NUFIP2、FGF9/19、SMAD2、CXCR4、EIF2C、PCAF、MECP2、组蛋白乙酰转移酶MYST3、核RNP H3、以及许多细胞核受体与因子。大多数的这些基因与肿瘤/癌症的胚胎发育和/或肿瘤发生高度相关。 

标准人类ES标记表达的识别，即：Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2及Nanog

如图6B及9B所示，这些mirPS细胞强烈表达许多标准人类ES细胞标记，如：Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2及Nanog，然而在原始体细胞(hHFC对照组)中未检测到任何这些标记，且这些体细胞是用空SpRNAi-RGFP载体及强力霉素(hHFC+Dox)或是用不含强力霉素的mir-302s载体(mirPS-Dox)转染。如RNA及蛋白质印迹分析法所确定的mRNA及蛋白质含量，这些ES标记的表达型式极类似于人类ESWA01-H1及WA09-H9细胞的表达型式。这些结果表示mir-302s的异位表达能将成人体细胞/癌细胞转化为类ES多能性干细胞，其呈现许多标准人类ES标记。在mirPS-Colo细胞中也观察到相同的结果(图8C)。 

Oct3/4(也称为Oct-3或Oct-4)是这些POU转录因子中的一个，其主要并高度地表达在全能的胚胎干及生殖细胞中(Scholer等人，(1989)EMBO J.8：2543-2550；Rosner等人，(1990)Nature 345：686-692)。Oct3/4临界水平的表达对于维持干细胞自我再生及多能性是必需的。Oct3/4的下调导致胚胎干细胞分化进入分歧发育程序。SSEA蛋白、SSEA-1、SSEA-3及SSEA-4起初是以单克隆抗体来识别，这些单克隆抗体识别在着床前期阶段的鼠科动物胚胎及畸胎癌干细胞的表面上的乳系及球系糖脂类，但不能辨识在其分化衍生物上的乳系及球系糖脂类(Solter等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：5565-5569)。未分化的灵长类胚胎干(ES)细胞、人类胚胎癌(EC)及ES细胞全都表达SSEA-3及SSEA-4，但不表达SSEA-1(Thomson等人，(1998)Science 282：1145-1147)。SSEA-3及SSEA-4是在卵子生成期间合成，并主要呈现在卵母细胞、接合子及早期分裂期胚胎的这些膜中(Shevinsky等人，(1982)Cell 30：697-705)。在维持多能性方面，Sox2具有如核心转录因子core transcription factor的功能， 但此功能并非专对胚胎干细胞(Boyer等人，(2005)Cell122：947-956)。因此，根据此种认知，这些mirPS细胞很可能呈现这些人类ES标记的所有特性。 

基因组DNA去甲基化(重新编程)的评估

后天修饰的改变特别强调ES细胞的另一种独特的功能：基因组去甲基化(Hochedlinger等人，(2006)Nature 441：1061-1067)。为了将一细胞重新编程成其ES状态，许多胚胎基因需要通过DNA去甲基化来再次活化，如：Oct3/4。为了评估在这些mirPS细胞中的此种后天效应，我们首先以Hpall消化整个基因组，Hpall是对CpG甲基化敏感的限制酶，并仅切割未甲基化的CCGG位而非甲基化的CCGG位。图7A显示来自体细胞对照组的消化的DNA片段，其大小比来自这些mirPS细胞的消化DNA片段大两倍，这表示整个mirPS细胞基因组是高度去甲基化的。使用亚硫酸氢盐-基因组PCR及测序来进一步评估Oct3/4基因启动子区域中(Takahashi及Yamanaka，2006)。亚硫酸氢盐可将所有未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶。因为未甲基化的ACGT位会被改变成AUGT位，ACGT-切割限制酶无法切开在这些mirPS细胞基因组中的分离区域(图7B)。由该亚硫酸氢盐DNA测序来显示的详细的去甲基化映像图进一步展示在这些mirPS细胞中该Oct3/4基因启动子区域的甲基化位丧失超过90％，其类似在这些人类ES WA09-H9细胞中所发生的状况(图7C)，这表示的确发生全基因组重新编程的事件以再活化该Oct3/4基因表达。实施例8显示上述的CpG去甲基化实验。 

在确定Oct3/4基因启动子中的这些去甲基化位的实验中，我们首先以亚硫酸氢盐(CpGenome DNA modification kit，Chemicon，CA)处理这些分离的基因组DNA，其将所有未甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶，然后使用聚合酶链式反应来分离Oct3/4 5’-上游启动子区域(长模板PCR延伸试剂盒，Roche，IN)。其后，以多种切割ACGT的限制酶的等量混合物(每种限制酶5U)来收集并消化PCR产物，这些切割ACGT的限制酶包含：AclI(AACGTT)、BmgBI(CACGTC)、PmlI(CACGTG)、SnaBI(TACGTA)及 HpyCH4IV(ACGT)。因为在此区域中的这些未甲基化的ACGT位是以亚硫酸氢盐改变成AUGT位，其无法用这些切割ACGT的限制酶来切开，故图7B的结果指出在该对照组hHFC、PC3及Colo细胞中超过四个甲基化ACGT位被改变成在对应的mirPS细胞中的去甲基位。因此，该Oct3/4基因启动子的此mir-302-介导去甲基化可能有助于这些mirPS细胞中的Oct3/4基因表达的再活化。 

源自转移性癌症的所述mirPS细胞的迁移能力的丧失

人类ES细胞不会迁移。在源自快速转移性癌症细胞株的这些mirPS细胞(如：mirPS-PC3细胞)中常可观察到细胞失去迁移能力。由于ES细胞倾向在一处休眠并在原位形成胚状体，此可解释为何转移性人类前列腺癌PC3细胞在异位mir-302转染后会丧失其迁移能力。在其它实施例中，mir-302可将某些细胞迁移相关基因沉默，以避免正常细胞迁移及癌细胞侵入，这些细胞迁移相关基因如：微管相关蛋白质1B基因(MAP1B)、类肌动蛋白蛋白质(ACTL6A)、锚蛋白2(ANK2)、淀粉样蛋白β前体A4(APP)、肌球蛋白轻链多肽激酶(MYLK)。如图7D及实施例12中所示，转移性PC3细胞很快地随时间而迁移，然而mirPS-PC3细胞保持静止不动。在所有其它对照组中没有观察到任何形态上的改变。因此，本发明的转基因mir-302s表达足以将人类癌症细胞转形成更类似ES的细胞形态及细胞分裂率，这暗示一种在癌症治疗上极有益的利用。此结果暗示将这些mir-302传送进癌症/肿瘤细胞中的一种潜在治疗应用，其不仅可将这些恶性的癌症/肿瘤细胞重新编程为有用的类ES干细胞，也可减少癌症转移的机会。更有利的是，由于这些mirPS细胞是由病人自身的细胞生成，且因此其和病人具有免疫兼容性，故可利用这些mirPS细胞来发展一种新颖移植治疗，以修补这些癌症/肿瘤受损组织而不会有免疫排斥的风险。

使用基因微矩阵分析识别整体ES标记表达

全基因组基因图谱可提供对涉及该mir-302-介导重新编程的事件的基因变化的理解。在确认标准ES细胞标记及转基因mir-302s的共同表达后，我们进一步在该异位mir-302表达之前及之后的这些细胞中以及在这 些mirPS及其它人类ES细胞(如：WA01-H1及WA09-H9)间进行人类基因组微矩阵分析来筛选全基因组基因表达型式的变化。实施例10中显示详细的操作程序。使用Affymetrix基因微矩阵(GeneChip U133A&B及U133plus 2.0arrays)来评估超过47,000种人类基因表达型式的改变。我们首先使用相同的mirPS样本来复制这些微矩阵测试，并从这些测试中之一选择两百个最可变的基因(白点)以供进一步的比较。如图8A(mirPS-Colo)及图9A(mirPS-hHFC)所示，复制测试的整体变化少于一倍(最左侧)，这表示背景变化是极有限的。根据所有微矩阵识别的基因的分散型式，我们接着计算两组比较转录组数据库的结果间的相关系数(CC)。再提供CC率以显示在该全基因组基因表达型式中的相似性百分比，这些全基因组基因表达型式具有的临限值仅有1倍的表达量差异。在此种严谨的CC率定义下，我们发现mirPS细胞的这些基因表达型式极类似于人类ES WA01-H1(＞89％)及WA09-H9(＞86％)细胞的表达型式，然而在这些mirPS细胞及其体细胞/癌细胞来源之间仅显示低的47％-53％CC率。在人类ES及mirPS细胞间的此种强大基因相关性暗示mir-302s可能需要改变数千种细胞基因表达，其包含将体细胞/癌细胞重新编程为类ES mirPS细胞的过程。例如，如图8B所示，在这些mirPS及人类ES细胞结果中持续并同时观察到，多个ES基因表达提高以及许多个致癌、发育与mir-302靶向细胞周期相关的基因表达停止。参考图9B，就这些mirPS细胞的基因表达型式而论，也可注意到SSEA-1适度地表达在这些mirPS细胞中，而Klf4则不表达。 

图8B显示在Colo及mirPS-Colo细胞之间的一些主要分化表达基因的列表。在图8B中，我们注意到细胞周期检查点基因(即：CDK2、细胞周期蛋白D1及D2)以及DNA甲基促进子(即：MECP2及MECP1-p66)全经确认为mir-302s的强力靶。换句话说，这些多能性类干细胞表达丰富的mir-302微型核糖核酸及Oct4，但仅表达有限的CDK2、细胞周期蛋白D1、MECP1-p66及MECP2。在图8C及图9B中也观察到相同的结果。已知细胞周期蛋白E依赖性CDK2是进入S期细胞周期所必需的， 且抑制CDK2会造成G1期检查点停滞，然而，细胞周期蛋白D1在响应DNA损害时可越过G1期的停滞。根据此原则，在mirPS细胞中CDK2及细胞周期蛋白D1两者的抑制揭露一项事实：mir-302-转染癌症细胞的细胞周期可达到极慢的细胞分裂率，如图5A所示。因此，此种癌细胞-干细胞周期转换的结果对癌症治疗可有极大的好处。此外，抑制MECP2及MECP1-p66活动的结果与图7A-C的这些结果一致，这表示恶性癌症细胞后天重新编程为良性mirPS细胞。可以想象从病人处所得的这些mirPS细胞可进一步地帮助修补肿瘤/癌症的组织损害。总结来说，所有这些发现显示本发明的mir-302转基因方法可用来将人类体细胞/癌细胞的基因图谱重新编程成高度类ES表达型式，其类似人类ES细胞的表达型式。 

MirPS细胞的多能性

多能性定义ES细胞最重要的特性。经由以不同因子和/或荷尔蒙的体外操纵，人类ES细胞可分化成三层胚胎生殖层(外胚层、中胚层及决定性的内胚层)，其是所有成人组织的基础。在不进行任何处理下，将这些mirPS衍生胚状体异种移植至雌性假性怀孕免疫功能不足的SCID-beige小鼠的子宫或腹腔中可形成类畸胎瘤的组织囊肿(图10)。在其它组织位置中未观察到这些囊肿。然而，不同于畸胎瘤，这些组织囊肿会相对于其周围组织形成极佳且清楚的边界。并且，在小鼠中的这些囊肿结构的生长在移植后约2.5周时减缓。此似乎有一自我调节的机制可体内地限制这些mirPS细胞的随机生长。此种自我调节机制也可避免从这些mirPS细胞形成肿瘤，这提供了在临床试验及治疗上用来设计及培养不含肿瘤的多能性干细胞的一种手段。 

MirPS细胞分化的体外分子导引

在定义上，多能性干细胞可分化为类似源自胚胎外胚层、中胚层和/或内胚层的这些组织细胞的各种细胞类型。例如，使用各种生长因子和/或荷尔蒙体外处理，我们可导引类ES mirPS细胞分化为数种身体和/或生殖细胞系组织细胞类型，包含：神经元祖细胞(图5B)、类精原细胞(图 11A-E)、成纤维细胞(图11F-J)、及软骨细胞(图11K-O)。已利用免疫组织化学(IHC)检测来识别这些特别组织谱系的标记，其分别显示神经元特异性的Tuj1与ABCA2、生殖细胞是特异性的Dazla与EE2、成纤维细胞特异性奥体拉萨体1(atlastin1)与第一类原胶原蛋白(COL1A1)、及软骨细胞特异性原弹性蛋白与第二类原胶原蛋白(COL2A1)。换句话说，本发明所生成的多能性类干细胞可分化为类生殖细胞系细胞、类精原细胞、正常体细胞、成纤维细胞、软骨细胞、及其组合。在这些分化的mirPS细胞中没有观察到肿瘤形成的迹象。事实上，根据Sanger网站的“TARGETSCAN”及“PICTAR-VERT”程序的预测，已知许多癌基因是mir-302s靶。此外，mir-302s可压抑细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白D1与D2以避免肿瘤细胞的快速生长(Lin等人，2008b)。这些发现表示这些mirPS细胞的不含肿瘤的多能性。可以想见，可使用各种分子处理，从这些mirPS细胞中诱导出更多组织细胞类型。 

在不含饲养层细胞培养条件下体外地进行实验，显示我们已成功地导引mirPS细胞分化成三种有关的同源的体细胞类型(图11A-O及实施例11)。首先，通过以天然雄激素-二氢睪固酮(dihydrotestosterone，DHT 50ng/ml)在不含饲养层细胞培养皿中处理这些mirPS细胞六小时，然后将这些已处理的细胞(10⁵)体内移植到六周大雌性免疫功能不足的SCID-beige小鼠的子宫内，于一周后在该移植位上生成类精原细胞的一囊肿(图11A-E)。其次，通过以转形生长因子β1(TGF-β1 100ng/ml)处理这些mirPS细胞达12小时，然后再依循相同的移植程序，这些mirPS细胞分化为成纤维细胞并在仅一周内开始分泌胶原蛋白(图11F-J)。最后，通过以骨成形蛋白4(BMP4 100ng/ml)处理这些mirPS细胞达12小时，然后将这些细胞异体移植到六周大的免疫功能不足的SCID-beige小鼠的肝脏内，这些mirPS细胞分化为以钙化沉淀物围绕的软骨细胞(图11K-O)。该免疫功能不足的裸鼠是用来提供模仿移植治疗的体内环境。这些发现提供强而有力的证据：我们已成功地利用本发明的mir-302转基因方法来生成新的类ES多能性干细胞株，其可在不含饲养层细胞的条件下体外及体内地导 引成多种组织细胞类型。因此，本发明不仅能将分化后的体细胞/癌细胞重新编程成类ES状态，而且也能在不含饲养层细胞培养条件下维持类ES的再生与多能性。 

因此，利用可诱导的mir-302表达转基因，本发明提供有力的新工具及策略，其可用来生成类ES mir-302-诱导的多能性干细胞(mirPS)，特别是源自人类体细胞及癌细胞的原代培养的mirPS细胞。更佳地，这些mirPS细胞是得自人类正常毛囊，因为其较容易取得。由于该内含子miRNA生物发生路径是通过多种细胞内监测系统良好地调节，所述细胞内监测系统包括：mRNA转录的成分、RNA剪接、外体加工及NMD机制，因此本发明的内含子mir-302表达可视为比原先的Pol-III(U6/H1)驱动的siRNA/shRNA表达系统更加安全。事实上，本发明者已观察到该Pol-III驱动的表达系统倾向于过度表达mir-302，并引起细胞周期在G1期停滞及死亡。本发明在结合可药物诱导(Tet-On/Off)载体下可进一步提供一种可控制手段，其不仅可将哺乳动物体细胞/癌细胞重新编程为类ESmirPS细胞，且可导引其形成有用的正常组织细胞。因为已发现mir-302是强力的肿瘤抑制子，故本发明所生成的这些mirPS细胞没有肿瘤形成的风险。 

本发明具有至少五个有益的突破。第一，一种mir-302表达转基因可代替在这些先前的iPS方法(仅源自病人的少数体细胞)中所用的所有四种大型转录因子基因以生成更具同源性的类ES多能性干细胞，此可改善干细胞纯度及病人的免疫系统的兼容性。第二，因为该mir-302表达转基因的总长度相对地较小(约一千个碱基)，与这些先前iPS方法中的转基因传送的最高成功率2％相较，本方法的转基因传送成功率是极高的(成功率超过91％)。第三，mirPS细胞的生成及培养完全是在不含饲养层细胞的条件下进行，此避免了饲养层细胞抗原污染的风险。第四，未使用癌基因，此避免了细胞变异及肿瘤形成的风险。最后，本发明使用电穿孔法来代替反转录病毒感染以传送该单个mir-302表达转基因，此避免了随机反转录病毒插入宿主细胞基因组的风险，其通常会引起插入突变。总结 来说，这些优点解决了先前iPS方法的三个主要问题，其避免了反转录病毒感染、癌基因突变及不确定的肿瘤发生的风险。 

A.定义 

为方便理解本发明，一些术语定义如下： 

核苷酸：去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的单体单元，其包含：糖部份(戊糖)、磷酸根及含氮杂环碱基。该碱基是通过糖苷碳(该戊糖的1’碳)与该糖部份连接，且该碱基及糖的组合是核苷。包含与该戊糖的3’端与5’端位置结合的至少一个磷酸基的核苷是核苷酸。 

寡核苷酸：包含两个以上的去氧核糖核酸或核糖核酸的分子，其较佳地是保含超过三个，而通常超过十个的去氧核糖核酸或核糖核酸的分子。其确切长度取决于许多因素，而这些又取决于该寡核苷酸的最佳功能或用途。该寡核苷酸可用任何方式生成，包含：化学合成、DNA复制、反转录、或其组合。 

核酸：核苷酸的聚合物，其可为单链或双链。 

核苷酸相似物：嘌呤或嘧啶核苷酸，在结构上与A、T、G、C或U不同但足够相似，因此可在核酸分子中取代正常核苷酸。 

核酸组合物：核酸组合物是指多核苷酸，如：去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，其可以单链或双链分子结构的形式存在。 

基因：核酸，其总核苷酸序列编码RNA和/或多肽(蛋白质)。基因可以是RNA或DNA。 

碱基对(bp)：双链DNA分子中的胸腺嘧啶(T)与腺嘌呤(A)，或鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)的配对。在RNA中，尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶(T)。一般来说，该配对是透过氢键实现。 

前体信使核糖核酸(pre-mRNA)：基因的初级核糖核酸转录物，其经由细胞内机制在真核细胞中以第二型RNA聚合酶(Pol-II)机器产生，该机制称为转录。pre-mRNA序列包含：5’端非转译区、3’端非转译区、外显子、及内含子。 

内含子：基因转录物序列的一部分或多个部分，其编码非蛋白质读框，如：框内(in-frame)内含子、5’端非转译区(5’-UTR)及3’端非转译区(3’-UTR)。 

外显子：基因转录物序列的一部分或许多部分，其编码蛋白质读框。 

信使核糖核酸(mRNA)：pre-mRNA外显子的组装，其在以核内剪接体机器除去内含子之后形成，并作为用于蛋白质合成的编码蛋白质的RNA。 

cDNA：与mRNA序列互补的单链DNA，且其不含任何内含子序列。 

正义核酸：核酸分子，其序列顺序及组成与同源的mRNA相同。以“+”、“s”或“正义”符号来表示此正义核酸构形。 

反义核酸：与各自的mRNA分子互补的核酸分子。以“-”符号来表示此反义核酸构形，或是在DNA或RNA的前加上“a”或“反义”，例如：“aDNA”或“aRNA”。 

5’端：在连续核苷酸的5’端位置处缺少一个核苷酸的一端，其中，一个核苷酸的5’端羟基通过磷酸二酯链接连接至另一个核苷酸的3’端羟基上。在该端可以有其它基，如一或多个磷酸根。 

3’端：连续核苷酸的3’端位置处缺少一个核苷酸的一端，其中，一个核苷酸的5’端羟基是通过磷酸二酯链接连接至另一个核苷酸的3’端羟基上。在该端可以有其它基，通常是羟基。 

模板：能以核酸聚合酶复制的核酸分子。根据不同的聚合酶，模板可为单链、双链或部分双链。合成后的拷贝是与该模板、或双链模板的至少一条链或部分双链模板中的至少一条链互补。RNA与DNA皆以5’端到3’端的方向合成。核酸双链体的两链总是排列在一起，使得这些两链的5’端位于该双链体的相对端上(必要的话，这些两链体的3’端亦然)。 

核酸模板：双链DNA分子、双链RNA分子、杂合分子(如：DNA-RNA或RNA-DNA杂合物)、或单链DNA或RNA分子。 

保守性：若核苷酸序列与预选(参考的)序列的完全互补物非随机地杂交，则该核苷酸序列与所述预选(参考的)序列是保守的。 

互补：用于指通过碱基对原则关联的多核苷酸(即：核苷酸的序列)。例如：序列“A-G-T“与序列”T-C-A“及”T-C-U“互补。互补可以发生在两链DNA之间、DNA链与链RNA之间、或是在两条RNA链之间。互补可以是“部分”或“完全”或是“整体”的。仅当一些核酸碱基是根据这些碱基配对原则相配对时才会发生部分互补。完全或整体互补则是当这些碱基在这些核酸链之间完全相配时才会发生。在核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效率及强度有重大的影响。此对于扩增反应特别重要，且对于依赖于核酸间的结合的检测方法也很重要。互补率是指在该核酸的一条链中错配碱基数与全部碱基数之比。因此，50％的互补率意指一半的碱基错配，而另一半的碱基相配对。即使核酸的两链的碱基数不同，核酸的两链也能互补。在此情况下，互补发生于较长能够与较短链的碱基配对的长链碱基部分与较短链的碱基之间。，该较长碱基与较短碱基成对。 

同源：意指多核苷酸序列，其与基因或mRNA序列相似。例如：核酸序列可能部分或完全与特定基因或mRNA序列同源。同源也可用相似核苷酸数与全部核苷酸数的比率所定的百分比表示。 

互补碱基：当DNA或RNA形成双链配置时正常配对的核苷酸。 

互补核苷酸序列：在单链分子的DNA或RNA中的核苷酸序列，其与在另一条单链上的核苷酸序列完全互补，以在这两链之间通过随后的氢键合专一地杂交。 

杂交：在核苷酸序列之间双链体的形成，其充分互补以通过碱基配对形成复合体。其中引物(或剪接模板)与靶(模板)“杂交”，因此复合体(或杂合物)充分稳定以提供DNA聚合酶引发DNA合成所需的启动功能。在有竞争性抑制的两条互补多核苷酸之间存在专一的(即：非随机的)相互作用。 

转录后基因沉默：在mRNA降解或转译抑制阶段下的靶基因敲除或敲低效应，其通常以外来/病毒DNA转基因或小型抑制性RNA来触发。 

核糖核酸干扰(RNAi)：一种在真核细胞中的转录后基因沉默机制，其可用小RNA分子触发，如：微型核糖核酸(miRNA)、小发夹型RNA(shRNA)及小干扰核糖核酸(siRNA)。这些小RNA分子通常可作为基因沉默子，其干扰细胞内基因的表达，包含对这些小RNA的完全或部分互补。 

非编码RNA：不能通过细胞内转译机制合成肽或蛋白质的RNA转录物。 

微型核糖核酸(MicroRNA，miRNA)：能够与该miRNA部分互补的靶基因转录物结合的单链RNA。MiRNA通常长约17到27个寡核苷酸，并能依照在该miRNA与其靶mRNA之间的互补程度来直接降解其细胞内的mRNA靶，或抑制其靶mRNA的蛋白质转译。几乎能在所有真核细胞中发现天然的miRNAs，其对抗病毒感染，并允许在动植物发育期间调节基因表达。 

前体微核糖核酸(Pre-miRNA)：类发夹型单链RNAs，其包含用来与细胞内RNaseIII核糖核酸内切酶相互作用的茎臂及径环区域，以产生一或多个微型核糖核酸(miRNAs)，其能够沉默与这些微型核糖核酸序列互补的靶基因。pre-miRNA的茎臂结构可形成完全(100％)或部分(错配)的杂合双链体，而其径环结构连接至该茎臂双链体的一端以形成圆形或发夹型环状构型。 

小干扰核糖核酸(siRNA)：短双链核糖核酸，其是具有约18到25个完全配对的碱基对的核糖核苷酸双链体，并能够降解具有几乎完全互补程度的靶向基因转录物。 

小发夹型或短发夹型RNA(shRNA)：单链核糖核酸，其包含成对的部分或完全相配的茎臂核苷酸序列，该序列是以不配对的环状寡核苷酸分隔而形成类发夹型结构。许多天然miRNAs是源自类发夹型RNA前体，即：前体微核型糖核酸(pre-miRNA)。 

载体：能于不同基因环境中移动或滞留的重组核酸组合物，如：重组DNA(rDNA)。一般来说，另一种核酸分子是在此操作性地连接。该载 体能于细胞中自动复制，在这种情况下，该载体及所连接的片段也被复制。一种优选的载体类型是游离基因，即：能够在染色体外复制的核酸分子。较佳的载体是能够自动复制及表达核酸的那些载体。能够引导编码一个或多个多肽和/或非编码RNA的基因的表达的载体在此称为“表达载体“。特别重要的载体能够使用反转录酶所制造的mRNAs来克隆cDNA。 

顺反子：在DNA分子中的核苷酸序列，其编码氨基酸残基序列并包含上游及下游DNA表达控制元件。 

启动子：核酸，其由聚合酶分子所辨识(或与其结合)并引发合成。针对本发明的目的，启动子可以是已知的聚合酶结合位、增强子等，以及可通过所需聚合酶引发合成的任何序列。 

抗体：肽或蛋白质分子，其具有预选的保守结构域结构，该结构编码可结合预选配体的受体。 

B.组合物 

重组核酸组合物，其用来表达分离的mir-302因子并然后在哺乳动物细胞中诱导mir-302介导基因沉默，该重组核酸组合物包含： 

a)重组转基因，其中该转基因编码与mir-302家族的成员同源的重组非编码RNA；及 

b)能够表达的载体，其中该载体可用来传送并表达哺乳动物细胞中的重组转基因。 

上述的重组转基因进一步包含： 

a)多个外显子，其中这些外显子可连接以形成具有所需功能的基因转录物；及 

b)至少一个内含子，其中该内含子包含重组mir-302同源物，并可经由细胞内RNA剪接及加工机制来切除这些外显子。 

上述的重组转基因的内含子进一步包含： 

a)用于剪接体结合的5’端供体剪接位； 

b)与该mir-302家族的成员同源的基因沉默效应子插入片段； 

c)用于剪接体辨识的分支点基序； 

d)用于剪接体相互作用的多嘧啶串； 

e)用于剪接体结合的3’端受体剪接位；及 

f)多个接头，其用来在5’端至3’端方向连接每一个这些上述成分。 

较佳地，该基因沉默效应子编码与5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)同源的核酸组合物。该5’端供体剪接位是包含5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或GU(A/G)AGU基序或与它们同源的核苷酸序列(如：5’-GTAAGAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.37)、5’-GTAAGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’及5’-GTAAGT-3’)，而该3’端受体剪接位是包含GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG基序或与它们同源的核苷酸序列(如：5’-GATATCCTGC AG-3’(SEQ.ID.NO.42)、5’-GGCTGCAG-3’及5’-CCACAG-3’)。此外，分支点序列是位于该5’端剪接位及该3’端剪接位之间，其包含与5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)同源的基序，如：5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’。另外，多嘧啶串是位于接近该分支点及3’端剪接位之间，其包含与5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)或5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)同源的高T或C含量序列。符号“m”及“n”表示多个重复，其≥1；更佳地，m的数量等于1～3且n的数量等于7～12。符号“-”是指在该序列中可被略过的核苷酸。根据37CFR 1.822中关于用于核苷酸和/或氨基酸序列资料的符号及格式的准则，符号W是指腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号K是指鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号S是指胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，符号Y是指胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号R是指腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，及符号N是指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。关于上列所有的剪接体辨识成分，去氧胸苷(T)核苷酸可用尿核苷(U)代替。 

C.方法 

一种用来将哺乳动物细胞重新编程为多能性干细胞的方法，其使用能够对由mir-302所靶向的基因诱导特定基因沉默效应的重组核酸组合物，该方法包含以下步骤： 

a)提供：i)细胞基质，其表达多个由mir-302所靶向的发育及细胞分化相关基因，及ii)重组核酸组合物，其能够被传送、转录并加工成与该细胞基质中的mir-302同源的非编码RNA； 

b)在该细胞基质中的mir-302-靶基因功能受抑制的条件下，以该重组核酸组合物处理该细胞基质。 

更佳地是，该重组核酸组合物是能够表达重组转基因的可药物诱导的Tet-On或Tet-Off载体，其编码重组mir-302家族基因群(pre-mir-302s；SEQ.ID.NO.29-SEQ.ID.NO.36的连接杂合物)或人造重设的mir-302shRNA同源物(SEQ.ID.NO.27及SEQ.ID.NO.28的杂合物)。该细胞基质可用体外、离体或体内的方式来表达pre-mir-302s/mir-302shRNA及其靶基因。 

实施例 

以下实施例是作为举例说明本发明的某些较佳具体实施例及方面，其不应视为限制本发明的范畴。 

在以下揭示公开的试验部分中，所用的简称如下：M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μm(微摩尔)；mol(摩尔(量))；pmol(皮摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；℃(摄氏度)；cDNA(DNA的拷贝或互补)；DNA(去氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(去氧核苷酸三磷酸)；RNA(核糖核酸)；PBS(磷酸盐缓冲液)；NaCl(氯化钠)；HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸)；HBS(HEPES缓冲盐溶液)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)；及ATCC(美国菌种培养中心，American Type CultureCollection，Rockville，MD)。 

实施例1 

包含SpRNAi重组RGFP基因(SpRNAi-RGFP)的构建体

以下列出用来生成包含正义、反义或发夹型EGFP插入片段的SpRNAi内含子的合成寡核苷酸：正义N1，5’-GTAAGAGGATCCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GA-3’(SEQ.ID.NO.14)；反义N1，5’-CGCGTCTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGC GATCGG-ATCC  TCTTAC-3’(SEQ.ID.NO.15)；正义N2，5’-GTAAGAGGATCCGATCGCTT GAAGAAGATG GTGCGCTCCT GA-3’(SEQ.ID.NO.16)；反义N2，5’-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGCGATCGGATCC TCTTAC-3’(SEQ.ID.NO.17)；正义N3，5’-GTAAGAGGATCCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GTTAACTTGAAGAAGATGGT GCGCTCCTGA-3’(SEQ.ID.NO.18)；反义N3，5’-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGT TAACTTGAAGAAGATGGTGC GCTCCTGCGA TCGGATCCTC TTAC-3’(SEQ.ID.NO.19)；正义N4，5’-CGCGTTACTA ACTGGTACCTCTTCTTTTTT TTTTTGATAT CCTGCAG-3’(SEQ.ID.NO.20)；反义N4，5’-GTCCTGCAGG ATATCAAAAA AAAAAGAAGA GGTACCAGTTAGTAA-3’(SEQ.ID.NO.21)。从SEQ.ID.NO.14-SEQIDNO.21所列出的所有序列在其5’端都是磷酸化的。 

此外，两个RGFP外显子是通过Drall限制酶切割红色萤光RGFP基因(SEQ.ID.NO.22)的第208个核苷酸(nt)位来生成。该5’端RGFP外显子进一步地以T₄ DNA聚合酶来使端点钝化。涉及新颖红移萤光色素蛋白质基因的RGFP是通过自紫点海葵(BD Biosciences，CA)分离的HcRed1色素蛋白质的第69个氨基酸(a.a.)位插入额外的天门冬氨酸来生成，其造成较少的聚集以及在波长570-nm发射几乎两倍强度的的红外线萤光。 

正义N1与反义N1、正义N2与反义N2、正义N3与反义N3、以及正义N4与反义N4的杂合分别以下列步骤实行：将每一种正义及反义(1∶1)序列的互补混合物加热至94℃两分钟，然后置于70℃的1倍PCR缓冲 液(例如：50mM Tris-HCl，pH 9.2，25℃；16mM(NH₄)₂SO₄；1.75mMMgCl₂)中10分钟。之后立即在1小时期间内，通过把N1+N4、N2+N4或N3+N4(1∶1)杂合的混合物从50℃分别逐渐地冷却至10℃，以进行N1、N2或N3杂合物与N4杂合物的序列连接，然后将T₄ DNA连接酶及缓冲液(Roche，IN)加进该混合物中并在12℃下一起孵育12小时。这样形成了这些SpRNAi内含子。其后，将这两个RGFP外显子加进该反应中(1∶1∶1)，并相应地调整T₄DNA连接酶及缓冲液以在12℃下再次进行该连接反应12小时。 

对于克隆正确重组的SpRNAi插入RGFP(SpRNAi-RGFP)基因，通过一对RGFP特异性引物5’-CTCGAGCATG GTGAGCGGCC TGCTGAA-3’(SEQ.ID.NO.23)及5’-TCTAGAAGTT GGCCTTCTCG GGCAGGT-3’(SEQ.ID.NO.24)通过PCR以以下条件来扩增10ng的连接的序列：在94℃进行1分钟，在52-57℃进行1分钟，然后在68℃进行2分钟，共进行25至30个循环。将所得的PCR产物在2％琼脂糖凝胶上层析，然后使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，CA)来提取及纯化900到1100碱基对(bp)的核苷酸序列。通过测序进一步确认此～1-kb的SpRNAi-RGFP基因的组合物。较佳地，在没有内含子插入下，该SpRNAi内含子序列的正义链是5’-GTAAGTGGTC CGATCGTCGC GACGCGTCAT TACTAACTATCAATATCTTA ATCCTGTCCC TTTTTTTTCC ACAGTAGGACCTTCGTGCA-3’(SEQ.ID.NO.25)，而该SpRNAi内含子序列的反义链是5’-TGCACGAAGG TCCTACTGTG GAAAAAAAAG GGACAGGATTAAGATATTGA TAGTTAGTAA TGACGCGTCG CGACGATCGGACCACTTAC-3’(SEQ.ID.NO.26)。 

在其它实施例中，该重组SpRNAi-RGFP转基因可通过连接具有DraII切割RGFP外显子的限制片段的SEQ.ID.NO.25与SEQ.ID.NO.26的杂合物(SpRNAi)来直接制成，并依以上所示的相同操作程序处理。依此方式形成用以测试该人造重设的mir-302shRNA插入片段(编码SEQ.ID.NO.9)的SpRNAi-RGFP转基因。 

由于该重组SpRNAi-RGFP转基因在其5’端及3’端分别具有XhoI及XbaI限制位，其可容易地被克隆至具有能够粘着至这些XhoI与XbaI克隆位的粘性末端的载体中。该载体必须是能够表达的有机体或子有机体，其选自DNA转基因、质粒、跳跃基因、转座子及病毒载体。此外，由于在该内含子中的插入位是分别在其5’端及3’端以PvuI及MluI限制位为侧翼，我们可用具有能够粘着至所述PvuI及Mlul克隆位的粘性末端的另一种不同的插入序列移除并取代所述的内含子插入片段。该插入序列较佳地是类发夹型基因沉默效应子，其对靶基因具有高互补度，该靶基因选自萤光蛋白质(GFP)基因、萤光酶基因、1ac-Z基因、病毒基因、细菌基因、植物基因、动物基因及人类基因。在该基因沉默效应子及其靶基因间的互补和/或同源比率是在约30％-100％的范围内，对于发夹型shRNA插入片段的更佳的范围为35％-49％，对于正义RNA及反义RNA插入片段两者的范围为90％-100％。 

实施例2 

将所述SpRNAi-RGFP基因克隆至能够表达的载体中以及将重组的mir-302同源物插入该SpRNAi-RGFP基因中

由于该重组的SpRNAi-RGFP转基因在其5’端及3’端分别具有XhoI及XbaI限制位，其可轻易地被克隆到具备粘着至所述XhoI及XbaI限制位的相对粘性端载体中。如图3A所示，我们将该SpRNAi-RGFP转基因并入至XhoI/XbaI线性化的～6,900-bp pTet-On-tTS的质粒中，它们的重量比(w/w)为1∶1，将该混合物在50分钟内自65℃冷却至15℃，然后相应地将T₄连接酶及缓冲液加进该混合物中以在12℃下连接12小时。此形成了可诱导SpRNAi-RGFP表达载体。以RGFP特异性引物SEQ.ID.NO.23及SEQ.ID.NO.24通过PCR在以下条件下来确认该载体的组合物：94℃下进行1分钟，然后在68℃下进行2分钟，共进行30个循环，再进一步地测序。为了克隆至病毒载体中，除了使用XhoI/XbaI-线性化pLNCX2反转录病毒载体(BD Clontech)来代替之外，进行相同的限制及连接程序。由于该SpRNAi内含子的插入位在其5’端及3’端分别以PvuI及MluI限制 位为侧翼，我们可用具有能够粘着至所述PvuI及Mlul克隆位的粘性端的人造重设mir-302shRNA插入片段移除及取代anti-EGFP shRNA插入片段。该重设mir-302shRNA插入片段包含与5’-UAAGUGCUUCCAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)同源的序列，其包含：5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUAG  UGU-3’(SEQ.ID.NO.9)、5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUGG  UGA-3’(SEQ.ID.NO.10)、5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUAG  UAG-3’(SEQ.ID.NO.11)、5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUCAG  UGG-3’(SEQ.ID.NO.12)、或5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUGAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.13)。更佳地是，该重设mir-302shRNA插入片段包含5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.9)。换句话说，该基因沉默效应子包含至少一个重组RNA序列，其与SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、及其组合同源。 

以下列出用于该重组的mir-302家族pre-miRNA或该人造重设mir-302shRNA插入片段的DNA重组的合成的寡核苷酸：正义mir-302a，5’-GTCCGATCGT CCCACCACTT AAACGTGGAT GTACTTGCTTTGAAACTAAA GAAGTAAGTG CTTCCATGTT TTGGTGATGGATCTCGAGCT C-3’(SEQ.ID.NO.29)；反义mir-302a，5’-GAGCTCGAGATCCATCACCA AAACATGGAA GCACTTACTT CTTTAGTTTCAAAGCAAGTA CATCCACGTT TAAGTGGTGG GACGATCGGA C-3’(SEQ.ID.NO.30)；正义mir-302b，5’-ATCTCGAGCT CGCTCCCTTCAACTTTAACA TGGAAGTGCT TTCTGTGACT TTGAAAGTAAGTGCTTCCAT GTTTTAGTAG GAGTCGCTAG CGCTA-3’(SEQ.ID.NO.31)；反义mir-302b，5’-TAGCGCTAGC GACTCCTACTAAAACATGGA AGCACTTACT TTCAAAGTCA CAGAAAGCACTTCCATGTTA AAGTTGAAGG GAGCGAGCTC GAGAT-3’(SEQ.ID.NO.32)；正义mir-302c，5’-CGCTAGCGCT ACCTTTGCTTTAACATGGAG GTACCTGCTG TGTGAAACAG AAGTAAGTGC TTCCATGTTT CAGTGGAGGC GTCTAGACAT-3’(SEQ.ID.NO.33)；反义mir-302c，5’-ATGTCTAGAC GCCTCCACTG AAACATGGAAGCACTTACTT CTGTTTCACA CAGCAGGTAC CTCCATGTTAAAGCAAAGGT AGCGCTAGCG-3’(SEQ.ID.NO.34)；正义mir-302d，5’-CGTCTAGACA TAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCTAAGCCAGGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.35)；反义mir-302d，5’-ATGACGCGTC GAACACTCAAACATGGAAGC ACTTAGCCTG GCTTAGCTAA GTGCTTCCATGTTTGAGTGT TATGTCTAGA CG-3’(SEQ.ID.NO.36)；及正义miR-302s，5’-GTCCGATCGT CATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCTAAGCCAGGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.27)；反义mir-302s，5’-ATGACGCGTC GATAAGTGCTTCCATGTTTT AGTGTGCCTG GCTTAGCACA CTAAAACATGGAAGCACTTA TGACGATCGG AC-3’(SEQ.ID.NO.28)(Sigma-Genosys，MO)。所有这些合成序列是在连接之前以PAGE凝胶提取来纯化。换句话说，该基因沉默效应子是以SEQ.ID.NO.29、SEQ.ID.NO.30、SEQ.ID.NO.31、SEQ.ID.NO.32、SEQ.ID.NO.33、SEQ.ID.NO.34、SEQ.ID.NO.35、SEQ.ID.NO.36、及其组合的杂合物的接合链接来形成。 

该重组的mir-302家族pre-miRNA基因群是以四组mir-302a-d杂合物的连接来形成，包含：正义mir-302a与反义mir-302a、正义mir-302b与反义mir-302b、正义mir-302c与反义mir-302c、以及正义mir-302d与反义mir-302d。这些mir-302a、mir-302b、mir-302c、及mir-302d的杂合物分别以PvuI/XhoI、XhoI/NheI、NheI/XbaI、及XbaI/MluI限制酶来消化，并在35μl高压灭菌双蒸水中通过凝胶提取过滤柱(Qiagen，CA)收集在一起。之后，立即将这些混合的杂合物通过T₄DNA连接酶(Roche，20U)连接以形成mir-302家族pre-miRNA插入片段的基因群，并进一步地插入所述PvuI/MluI线性化SpRNAi-RGFP表达载体中。或者，该人造重设mir-302shRNA是通过杂合SEQ.ID.NO.27及SEQ.ID.NO.28的两个合成 的序列来制成，然后以PvuI/MluI限制酶切开以插入所述PvuI/MluI线性化SpRNAi-RGFP表达载体中。依循图2A及图2B所列的程序，包含该重组的mir-302家族pre-miRNA(即：pTet-On-tTS-mir302s)的可诱导的SpRNAi-RGFP表达载体是转基因地被传送进hHFC细胞内，然而包含该重设mir-302shRNA的载体则是被导入Colo 829细胞内。 

所述SpRNAi-RGFP表达载体可繁殖在包含100μg/ml的安比西林的E.coli DH5αLB培养液中(Sigma Chemical，St.Louis，MO)。这些繁殖的SpRNAi-RGFP表达载体是使用小量制备(mini-prep)或大量制备(maxi-prep)的质粒提取试剂盒(Qiagen，CA)来分离及纯化。对于pLNCX2反转录病毒载体，我们也可使用包装细胞株GP2-293(Clontech，CA)以制造有感染力但不能自我复制的病毒。这些转染的GP2-293细胞是在37℃及5％CO₂下于1倍的DMEM培养液中生长，该培养液的补充成分为10％炭吸附胎牛血清(FBS)，其含有4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100μg/ml硫酸链霉素及50μg/ml新霉素(Sigma Chemical，MO)。依照retro-X qRT-PCR滴定试剂盒(Clontech，CA)的操作程序，病毒滴定量在转染前经测量是超过感染复数(MOI)30。 

实施例3 

mir-302s细胞培养及转基因传送

人类癌症PC3及Colo 829细胞株是取自美国菌种培养中心(ATCC，Rockville，MD)，而hHFC及hpESC细胞是分别以胶原蛋白酶/胰蛋白酶(4∶1)分解2至10个毛囊根或来自本发明者的毛发或手臂的2mm³皮肤外殖来制备。在37℃及5％CO₂下的RPMI 1640培养液中培养这些细胞，该培养液的补充成分为10％胎牛血清(FBS)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠及100μg/ml庆大霉素(Sigma Chemical，MO)。在培养物的汇合率在70％～80％时通过以下方式进行传代：将细胞暴露在胰酶-EDTA溶液1分钟并以RPMI漂洗一次，然后将这些分离的细胞以1∶10稀释重新平板接种到新鲜的生长培养基中。为了以电穿孔法转基因mir-302s传送，该pTet-On-tTS-mir302s载体(10-30μg)与所述宿主细胞(200-2000)在低渗性 pH缓冲液(400μl；微量离心管)中混合，且电穿孔法是在400-450伏特下以100微秒将该载体传送进所述宿主细胞基因组内。在72小时后使用FACS流式细胞仪经anti-RGFP单克隆抗体来筛选细胞以分离并收集阳性转基因的mirPS细胞(图3C)。此新颖mir-302s转基因方法的成功率经测量超过91％。 

或者，为了进行反转录病毒载体传送，我们首先培养pVSV-G共转染GP2-293细胞(Clontech，CA)，其具有包含重组的mir-302家族pre-miRNA插入片段的SpRNAi-RGFP插入pLNCX2反转录病毒载体。在37℃及5％CO₂下培育36小时后，过滤(0.25μm)这些GP2-293细胞的培养基(每一种培养基10ml)，并将其直接转移到所述受测试的细胞培养物内于37℃及5％CO₂下持续培养12小时。其后，加入新鲜的mirPS细胞培养基来代替该病毒培养基，每三天置换一次。由于这些培养基包含极高滴定量的设计反转录病毒载体，几乎所有的受测细胞(99.4％-99.8％)被这些载体转基因感染，并在24小时内开始表达所述内含子插入片段及RGFP。在感染后24小时使用FACS流式细胞仪经anti-RGFP单克隆抗体(Clontech，CA)来分类细胞以分离并收集阳性转基因的mirPS细胞。 

实施例4 

RNA印迹分析法

在1％甲醛-琼脂糖凝胶上分级分离总RNAs(20μg)并转移至尼龙膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH)上。与侧翼连接在RGFP的5’端外显子之间或侧翼连接在所设计的pre-miRNA/shRNA插入片段的75-bp连接序列互补，或与靶基因转录物互补的合成的LNA-DNA探针(Sigma-Genosys，MO)是通过Prime-It II试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)在[³²P]-dATP([³²P]-dATP＞3000Ci/mM，Amersham International，ArlingtonHeights，IL)存在下以随机引物延伸来标计，并以10bp-cutoff(截断值)Micro Bio-Spin层析管柱(Bio-Rad，Hercules，CA)来纯化。杂交是在50％的新鲜配制的去离子甲酰胺(pH 7.0)、5倍Denhardt溶液、0.5％SDS、4倍SSPE及250mg/mL的变性鲑鱼精子DNA片段(18小时，42℃)的混合 物中进行。在进行自动放射照相术(autoradiography)之前将膜在2倍SSC、0.1％的SDS(15分钟，25℃)中顺序清洗两次，并在0.2倍SSC、0.1％的SDS(45分钟，37℃)中清洗一次。图4B及6B中显示这些结果。 

实施例5 

SDS-PAGE及蛋白质印迹分析法

为了对靶蛋白质进行免疫印迹(图8C及9B)，在移除培养基之后以冰冷的PBS漂洗汇合率约～70％的分离细胞，然后用CelLytic-M裂解/提取试剂(Sigma-Aldrich，MO)裂解细胞，所述CelLytic-M裂解/提取试剂添加有蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽、TLCK、TAME及PMSF。这些细胞在室温下在震动器(shaker)上培育15分钟，之后将其刮到微量离心管内，然后在12,000xg下离心5分钟以将该细胞碎片沉淀。收集包含蛋白质的细胞裂解产物并在-70℃下储存备用。以SOFTmax软件包在E-max微量板测读仪(microplate reader，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上测量蛋白质含量。在还原(+50mM DTT)及非还原(无DTT)的条件下，将每30μg的细胞裂解产物加入SDS-PAGE样本缓冲液中，并在装载到6％-8％的聚丙烯酰胺凝胶上之前煮沸3分钟；分子量是通过与标准蛋白质(Bio-Rad，Hercules，CA)的比较来测定。根据这些标准操作程序来进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。以PAGE分离的蛋白质电转移到硝化纤维素膜上，并在室温下于Odyssey封闭试剂(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NB)中孵育2小时。然后，在该试剂中加入一抗并在4℃下孵育该混合物。使用的一抗包括：Oct3/4(1∶500，Santa Cruz)、SSEA-3(1∶500，Santa Cruz)、SSEA-4(1∶500，Santa Cruz)、Sox2(1∶500，Santa Cruz)、Nanog(1∶500，Santa Cruz)、Klf4(1∶200，Santa Cruz)、β-肌动蛋白(1∶2000，Chemicon，Temecula，CA)、及RGFP(1∶1000，Clontech)。经过一夜后，以TBS-T漂洗该膜三次，然后在室温下暴露在Alexa Fluor 680反应性染料标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1∶2,000；Invitrogen-Molecular Probes)中1小时。在再次用TBS-T漂洗三次后，使用Li-Cor Odyssey红外线成像器(Infrared Imager)及Odyssey软件第10版来进行免疫印迹的萤光扫描及影像分析。 

实施例6 

斑马鱼中的内含子RNA介导基因沉默

在转染期间，Tg(actin-GAL4：UAS-gfp)品种的斑马鱼幼鱼培养在含10ml的0.2倍不含血清RPMI 1640培养液的鱼缸中。通过将60μl的FuGene脂质体转染试剂(Roche Biochemicals，Indianapolis，IN)小心地溶解在1ml的1倍不含血清的RPMI 1640培养液中制备转染预混物。接着，如实施例1-2所示，将具有anti-EGFP pre-miRNA插入片段的SpRNAi-RGFP载体(20μg)与该预混溶液混合，然后置于冰上30分钟再直接用于在该鱼缸内的该Tg(actin-GAL4：UAS-gfp)幼鱼。在12小时的间隔中给予全部三种剂量(共60μg)。在首次转染60小时后收集样本。图1B显示该结果。 

实施例7 

流式细胞仪测验

在进行所需的实验后，将细胞用胰蛋白酶水解、沉淀，并于-20℃下将其再悬浮于1ml预冷的含的70％甲醇的PBS中固定这些细胞1小时。将这些细胞沉淀并以1ml的PBS洗涤一次。将这些细胞再次沉淀并于37℃下再悬浮于1ml的PBS溶液(含1mg/ml碘化丙啶、0.5mg/ml RNase)中30分钟。然后，在BD FACSCalibur流式细胞仪(San Jose，CA)上分析约15,000个细胞。通过绘制脉冲宽度对脉冲面积的图并圈选这些单个细胞来排除双联体细胞。使用软件包Flowjo以“Watson Pragmatic”算法来分析所收集的数据。如图5A所示，该流式细胞仪图表的第一(左)及第二(右)峰值表示在整个受测试的细胞群体中休眠G0/G1及有丝分裂M期的细胞群体的含量。 

实施例8 

DNA去甲基化测验

来自约两百万个细胞的基因组DNA是用DNA分离试剂盒(Roche)来分离，并分成两等份。一份DNA(2μg)用具有CCGG切位的限制酶HpaII来消化，然后以1％的琼脂糖凝胶电泳法来评估，以测定全基因组的去甲基化(图7A)。在亚硫酸氢盐修饰之前及之后，另一份(2μg)用于PCR克 隆该Oct3/4启动子的整个9,400碱基对(bp)5’端调节区域(NT 007592核苷酸21992184-22001688)。亚硫酸氢盐修饰是以CpGenome DNA修饰试剂盒(Chemicon，CA)来实行。对DNA作亚硫酸氢盐处理以将所有未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶，而己甲基化的胞嘧啶则仍维持为胞嘧啶。例如：将未甲基化的ACGT位(而非己甲基化的ACGT)改变成AUGT位。在亚硫酸氢盐修饰之前及之后已设计并测试了专对靶Oct3/45’端启动子区域的PCR引物，其包含：两正向引物5’-GAGGAGTTGAGGGTACTGTG-3’(SEQ.ID.NO.44)(用于亚硫酸氢盐修饰后的DNA)与5’-GAGGAGCTGA GGGCACTGTG-3’(SEQ.ID.NO.45)(用于未修饰的DNA)以及一反向引物5’-GTAGAAGTGC CTCTGCCTTC C-3’(SEQ.ID.NO.46)。对于PCR克隆，不论是已作亚硫酸氢盐处理或未作处理的这些基因组DNA(50ng)，首先在1倍PCR缓冲液中与这些引物(共150pmole)混合，再加热至94℃持续4分钟，然后立即于冰上冷却。其后，使用长模板PCR延伸试剂盒(Roche)进行25个如下的PCR循环：在92℃下进行1分钟，在55℃下进行1分钟，然后在70℃下进行5分钟。以PCR纯化试剂盒(Qiagen)收集所得的产物，且以多种具有ACGT切割位的限制酶的等量混合物(每一种5U)来消化2μg的DNA，这些限制酶包含：AclI(AACGTT)、BmgBI(CACGTC)、PmlI(CACGTG)、SnaBI(TACGTA)及HpyCH4IV(ACGT)。然后，使用3％琼脂糖凝胶电泳法来评估这些已消化的片段(图7B)。 

对于亚硫酸氢盐DNA测序分析(图7C)，我们使用定量PCR(qPCR)进一步扩增467-bp靶区域，其是以Oct3/4转录起始位(NT_007592核苷酸21996577-21997043)为侧翼。所用的引物是一正向引物5’-GAGGCTGGAG TAGAAGGATT GCTTTGG-3’(SEQ.ID.NO.47)及一反向引物5’-CCCTCCTGAC CCATCACCTC CACCACC-3’(SEQ.ID.NO.48)。将以上克隆的9,400-bp Oct3/45’端启动子区域(50ng)与这些qPCR引物(总共100pmole)混合在1倍PCR缓冲液中，加热至94℃持续2分钟，然后立即于冰上冷却。其后，使用高保真性PCR延伸试剂 盒(Roche)进行20个如下的PCR循环：在94℃下进行30秒，在68℃下进行1分钟。具有正确467-bp长度的扩增后DNA产物进一步地以3％琼脂糖凝胶电泳法来分级分离，再通过凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化，然后用于DNA测序。这些DNA甲基化位的详细图谱是通过比较用亚硫酸氢盐修饰的DNA序列中的未改变的胞嘧啶、与未用亚硫酸氢盐修饰的DNA序列中的未改变的胞嘧啶来产生。 

实施例9 

微型核糖核酸(miRNA)微矩阵分析

在汇合率为70％时，使用mirVana^TM miRNA分离试剂盒(Ambion)自每一细胞培养物中分离小RNAs。使用1％甲醛-琼脂糖凝胶电泳及光谱仪测量(Bio-Rad)来评估这些分离的小RNAs的纯度及数量，然后立刻以干冰冷冻并送往LC Sciences(San Diego，CA)进行miRNA微矩阵分析。每一种微矩阵芯片分别与标计有Cy3或Cy5的单一样本杂合，或是与标计有Cy3与Cy5的一对样本杂合。减去背景及标准化(normalization)。对于双重样本测验，进行p值计算并产生表达区别超过3倍的转录物的列表。在图6A的Cy3及Cy5强度影像(蓝背景)中，当信号强度自第1级增加至第65,535级时，对应的色彩由蓝色转变成绿色、黄色，再到红色。信号强度在23,000级上被视为基因表达中的正向信号。在Cy5/Cy3比的影像(黑背景)中，当Cy3高于Cy5级时，色彩为绿色；当Cy3级等于Cy5级时，色彩为黄色；及当Cy5级高于Cy3级时，色彩为红色。 

实施例10 

整体细胞基因表达型式的全基因组微矩阵分析

包含超过54,000个寡核苷酸探针的人类基因组GeneChip U133A&Band plus 2.0array(Affymetrix，Santa Clara，CA)用来检测在mirPS细胞中的全基因组47,000个人类基因转录物的表达型式，如图8A及9A所示。每一种样本以三份测试，并重复相同实验四次。来自每一种受测样本的总RNA是使用RNeasy离心管柱(spin columns，Qiagen)来分离。为制备用于微矩阵杂合的标计的探针，使用Superscript选择系统(Invitrogen)将 这些提取的总RNA(2μg)转换成双链cDNA，其具有合成的oligo(dT)₂₄-T7启动子引物5′-GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATAGGGAGGCGG-(dT)₂₄-3′(SEQ.ID.NO.49)。将所得的cDNAs以苯酚/氯仿提取试剂来纯化，以乙醇沉淀析出，并以0.5μg/μl的浓度下再悬浮于用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的双蒸水(ddH₂O)中。然后，进行体外转录，其包含：1μg的dsDNAs、7.5mM未标计的ATP与GTP、5mM未标计的UTP与CTP、及2mM生物素标计的CTP与UTP(生物素-11-CTP、生物素-16-UTP，Enzo Diagnostics)，以及20U的T7RNA聚合酶。反应在37℃下进行4小时，然后将所得的cRNAs以RNeasy离心管柱(Qiagen)纯化。在1％的琼脂糖凝胶上分离一部分的cRNA样本以检查长度范围，然后通过在94℃下于pH 8.0的40mM三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、100mMKOAc/30mM MgOAc中加热35分钟，将10μg的cRNAs随机分段成平均长度为50个碱基。在200μl的AFFY缓冲液(Affymetrix)中于40℃下持续地混合16小时以完成杂交。在杂交后，以200μl的6倍SSPE-T缓冲液(1倍的0.25M氯化钠/15mM磷酸钠，pH 7.6/1mM EDTA/0.005％Triton)漂洗矩阵三次，然后以200μl的6倍SSPE-T在50℃下漂洗1小时。这些矩阵另外再以0.5倍的SSPE-T漂洗两次，并以0.5倍的SSPE-T在50℃下洗涤15分钟。然后，以2μg/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(Invitrogen-Molecular Probes)及1mg/ml的乙酰化BSA(Sigma)在6倍的SSPE-T(pH 7.6)中完成染色测验。这些矩阵通过共焦扫描仪(confocalscanner，Molecular Dynamics)在7.5μm下读取。 

为识别该背景的变化，我们使用相同的样本来重复这些微矩阵测试，并选择两百个基因(图8A的白点)以作进一步的比较，所述基因稍微存在在这些测试的一侧。使用完美相配探针及错配探针之间的总平均差将这些样本信号标准化。之后，使用Affymetrix Microarray Suite 5.0版、Expression Console^TM 1.1.1版(Affymetrix)及Genesprings(Silicon Genetics)软件来分析整个全基因组基因表达型式的变化(图8A的绿点)。超过一倍(one-fold)的基因表达率的变化被视为阳性区别基因(positive differential genes)。在基因群测验中，使用外挂程序Genetrix(Epicenter Software)与Affymetrix软件配合。在每一个微矩阵中使用内部管家基因对照平均值(control average)标准化该样本的信号。在标准化后，当信号强度由第1级增加至第65,535级时，该对应的色彩由绿色转变成黑色，再到红色。在第23,000级(红色)的上的信号强度视为正向信号，因为RNA印迹分析可检测为阳性。 

实施例11 

细胞分化及免疫检测测验

除了使用不含饲养层细胞的mirPS培养基以外不进行任何处理下，将这些mirPS衍生的胚状体异种移植至六周大雌性假性怀孕免疫功能不足的SCID-beige小鼠的子宫或腹腔中可形成类畸胎瘤的囊肿(图10)。该免疫功能不足的裸鼠是用来提供模仿移植治疗的体内环境。制造该假性怀孕小鼠的方法为：在腹膜内注射1IU的人绝经期促性腺激素(HMG)两天，然后再注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)一天。为了体外分子引导干细胞分化成生殖细胞系谱系，mirPS细胞在37℃及5％CO₂下保持在含有DMEM/F12(1∶1；高葡萄糖)培养液的多鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养皿中12小时，该培养液的补充成分为10％炭吸附FBS、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5ng/ml活化素及50ng/ml的二氢睪固酮(DHT)。之后，用胰蛋白酶水解这些细胞，以1倍PBS洗涤，并用冷冻Matrige收集四个等份(每一个100μl)及一等份的100μl的1倍PBS中。之后，我们随即将这些细胞转植到六周大的免疫功能不足的SCID-beige裸鼠的后肢肌肉、腹膜、子宫、皮下颈部皮肤(含Matrigel)及尾静脉(含PBS)中。在实验处理期间以二乙醚麻醉该小鼠。一周后，仅在子宫区域发现类精原细胞。在纤维母细胞分化方面，我们在异体移植之前按照以上所示的相同程序，但使用标准不含酚红的DMEM培养液培养6小时，该培养液的补充成分为10％FBS、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5ng/ml头发生素(Noggin)及100ng/ml转化生长因子-β1(TGF-β1)。一周后在子宫中发现成纤维细胞。在软骨细胞分化方面，我们按照以上所示的相同程序， 但使用标准RPMI 1640培养液培养6小时，该培养液的补充成分为10％FBS、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠及100ng/ml骨成形蛋白4(BMP4)。仅在肝脏区域发现软骨细胞。 

在特定组织标记的免疫检测方面，组织样本是在4℃下于4％多聚甲醛中固定过夜。在将这些样品包埋石蜡中之前，先将这些样品相继地以1倍PBS、甲醇、异丙醇及四氢萘洗涤。然后在切片机上以7-10μm的厚度切割这些包埋的样本并固定在干净的TESPA涂布玻片上。然后，以二甲苯去除这些玻片的蜡并使用封片胶(mounting media；Richard AllanScientific，Kalamazoo，MI)固定在盖玻片下，再以苏木精及曙红(H&E，Sigma)染色以供形态观察用。免疫组织化学(IHC)染色试剂盒购自Imgenex(San Diego，CA)。根据制造商的建议进行抗体稀释及免疫染色法的程序。所用的一抗体包括：Tuj1(1∶500，Abcam Inc.，Cambridge，MA)、ABCA2(1∶100，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、Dazla(1∶100，Abcam)、EE2(1∶100，Santa Cruz)、奥体拉萨体1atlastin1(1∶200，SantaCruz)、COL1A1(1∶500，Santa Cruz)、COL2A1(1∶500，Santa Cruz)、弹性蛋白原(1∶200，Abcam)，及RGFP(1∶500，Clontech)。以萤光染色标计的山羊抗兔或马抗小鼠的抗体用来作为二抗(1∶2,000，Invitrogen-Molecular Probes)。在具全场扫描的100倍显微镜下观察到阳性结果，并以Metamorph影像处理程序(Nikon 80i及TE2000显微镜定量分析系统)在200倍或400倍的放大倍率下测量以作定量分析。 

实施例12 

细胞迁移测验

在96孔培养板中，我们在每一孔中将一个PC3及一个mirPS-PC3细胞放置在一起，然后记录其移动及相互作用。这些细胞都在37℃及5％CO₂下于RPMI 1640培养液中培长，该培养液的补充成分为10％炭吸附FBS、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5ng/ml活化素、5ng/ml头发生素(Noggin)、3ng/ml bFGF及0.5μM GSK-3抑制剂XV。在TE2000倒置显微镜系统(Nikon)下使用一成对的MO-188NE 3D液压式精密微操 纵器(hydraulic fine micromanipulators)来个别地分离并收集这些细胞，该微操纵器具有比色皿座(cell holder)。整个微操纵器及显微镜系统皆放置在防震桌上。每15秒记录这些相片(放大倍率400x及600x)，持续6小时。通过追踪在这些相片中的细胞移动及该细胞的形态确定该细胞迁移。如图7D所示，转移性癌症PC3细胞呈现如ATCC所述的快速纺锤体移动，其中该mirPS-PC3细胞保持在该放置位置中，其显现圆形休眠的表现型。 

实施例13 

统计分析

这些结果以平均值±标准差(mean±SE)表示。数据的统计分析是以单因素方差分析(one-way ANOVA)来进行。当主要效应明显时，使用Dunnett事后检验(Dunnett′s post-hoc test)来识别与对照组有明显差异的群。在两组处理群之间进行成对比较时，使用双尾学生t检验(two-tailed student test)。对于包含超过两组处理群的实验，则依照事后多范围检验(post-hoc multiple range test)实行变异数分析(ANOVA)。概率值p＜0.05被认定为具有统计上的意义。所有p值是由双尾检验(two-tailed test)来确定。 

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