公开/公告号CN101970464A
专利类型发明专利
公开/公告日2011-02-09
原文格式PDF
申请/专利权人 鲁普莱希特-卡尔斯-海德堡大学;
申请/专利号CN200980103167.8
申请日2009-01-26
分类号C07K14/02(20060101);A61K39/29(20060101);A61K38/16(20060101);
代理机构31210 上海市华诚律师事务所;
代理人傅强国
地址 德国海德堡市
入库时间 2023-12-18 01:52:15
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-01-21
授权
授权
2011-03-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K14/02 申请日:20090126
实质审查的生效
2011-02-09
公开
公开
技术领域
本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS衍生肽，该preS衍生肽来源于HBV preS共有序列并且其N末端优选被酰基化以及其C末端可选地被修饰。这些HBV的疏水性修饰的preS衍生肽是非常有效的HBV进入抑制剂以及HDV进入抑制剂，因此适用于HBV和/或HDV感染的抑制、原发HBV和/或HDV感染的预防以及(慢性)乙型肝炎和/或丁型肝炎的治疗。本发明进一步涉及包含这些HBV的疏水性修饰的preS衍生肽的药物和疫苗组合物。
背景技术
现今，大约20亿人携带HBV血清标记。他们中的大约4亿是被HBV慢性感染的。根据疾病控制中心(CDC)，如果他们没有接受适当的治疗(1)，15-25％的慢性HBV感染的人在十年内有发展成肝细胞癌(HCC)的倾向。HBV相关的肝细胞癌(HCC)预测性很差并且因此HBV被世界卫生与健康组织(WHO)归类为最重要的天然存在的人致癌因子。尽管有预防疫苗，在未来的十年中感染的人数仍将上升，这是由于世界人口的增加和在贫穷国家中预防的限制。
在工业国家，HBV基本上是通过肠胃外的途径传播。90-95％的被急性感染的、有免疫能力的个体清除病毒，因此获得了终生的免疫防护。他们当中大约5-10％的人发展成乙型慢性肝炎(在德国300,000-500,000人)。相反，在高流行区域，特别是在中非和东亚，传播的主要模式是垂直地从母亲至儿童。令人遗憾的是，没有完全免疫能力的儿童的感染导致了90-98％的慢性疾病过程。因此乙型肝炎相关的肝细胞癌在这些国家中的许多中是最普通的恶性肿瘤。
当前被认可的治疗乙型慢性肝炎病毒(HBV)感染的治疗方案，或者是针对已经建立感染后的病毒基因组的复制步骤(Lamivudine，Adefovir，Entecavir)或者是作为免疫系统的调节剂(干扰素α)。令人遗憾的是，只有10-25％的病人在这种治疗上保留着持久的病毒反应，尤其反映了核苷酸抗性突变体的快速选择。尽管预防性疫苗的有效性，但发展新的以迄今为止不受影响的复制步骤如病毒进入为靶点的治疗方法仍是极为重要的。
病毒进入的特异性抑制是吸引人的治疗概念，以便控制和最终消除急性和慢性感染。对于HIV，通过由36个氨基酸组成的gp41蛋白衍生肽(Fuzeon)，防止了病毒和细胞膜的融合(2)，成功地实现对病毒进入的干扰。
尽管预防疫苗和逆转录酶(RT)抑制剂的有效性，全世界HBV感染的人数和HBV相关的死亡人数(当前每年大约500,000人)还在增加。大约三分之二的原发性肝癌可归因于持续的HBV感染(3)。
目前治疗遵循两个策略：(i)干扰素(IFNα)治疗调节针对HBV的免疫反应并显示了直接抗病毒效果，这在大约30％的被治疗的病人中导致长时间的临床益处，但没有根除病毒；(ii)病毒逆转录酶抑制剂的给药抑制病毒复制并且在一年的治疗后伴随着显著的生物化学和组织的改进。然而，长时间的治疗与抗性病毒株的出现是相关的(4)。
HBV是哺乳动物和鸟类的小包膜DNA病毒家族的原型(5)。HBV的包膜包括三种称为L(大的)、M(中等的)、以及S(小的)蛋白(参见图1A)。它们共有具有四个跨膜区的C-末端S结构域。M和L蛋白带有另外的N末端延伸的55个氨基酸(preS2)和取决于基因型的107或118个氨基酸(preS1)(参见图1B)。在病毒粒子中，L、M和S的化学计量比是大约1∶1∶4，同时非常充足分泌的非传染性的亚病毒微粒(SVPs)几乎唯一地包含S蛋白以及仅仅微量的L蛋白(6)。在合成期间，L的preS1结构域被豆蔻酰基化并且被移位通过内质网(ER)。该修饰对于HBV的感染性是必需的(7，8)。
HBV感染早期情况的研究被限制，因为直到最近既没有细胞培养系统也没有小动物模型(9)。HBV易感染的HepaRG细胞系的发展促进了HBV进入的系统研究并且导致了包膜蛋白衍生的进入抑制剂的发现(10)。
此外，至今为止还没有针对HDV感染的有效治疗，HDV是一种利用HBV包膜蛋白进入肝细胞中的卫星拟病毒(satellite virusoid)(15，17，20)。在本领域中需要提供针对HDV感染的有效治疗。
因此，本发明的目的是提高方法和手段用于抑制、预防和/或治疗HBV感染和现有技术存在的其他HBV相关的疾病，并且因此本发明的目的是提供改进的方法和手段，允许有靶点的和有效的抑制、预防和/或治疗HBV感染和HBV相关的疾病。
本发明的进一步的目标是提供方法和手段用于抑制、预防和/或治疗HDV感染和HDV相关的疾病。
发明内容
根据本发明，通过提供HBV的疏水性修饰的preS衍生肽来实现这个目标。
上述疏水性修饰的preS衍生肽的通式如下：
Hm-P-Rn，
P是所述的preS衍生肽并且包含HBV preS共有序列的氨基酸序列或者其变体。
H是所述preS衍生肽P的疏水性修饰，其是P的N末端并且选自酰基化和疏水性部分的添加；其中m至少是1。
R是上述preS衍生肽P的可选的C末端修饰(即n是0或至少是1)。
根据本发明，此外通过提供药物组合物来实现这个目标，该药物组合物包含至少一种此处说明的HBV的疏水性修饰preS衍生肽和可选择的药学上可接受的载体和/或赋形剂。
根据本发明，此外通过提供本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽和/或各自的药物组合物用于疾病的诊断、预防和/或治疗来实现这个目标。
根据本发明，此外通过提供本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合物用于抑制HBV和/或HDV感染、用于预防HBV和/或HDV原发感染和/或用于治疗乙型肝炎和/或丁型肝炎来实现这个目标。
根据本发明，此外通过使用本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合物用于可抑制HBV和/或HDV感染的药物的研制、用于预防HBV和/或HDV原发感染和/或用于治疗(慢性)乙型肝炎和/或(慢性)丁型肝炎来实现这个目标。
根据本发明，此外通过抑制HBV和/或HDV感染的方法、预防HBV和/或HDV原发感染和/或治疗(慢性)乙型肝炎和/或(慢性)丁型肝炎的方法来实现这个目标，上述方法通过利用本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合物来实现上述功能。
根据本发明，此外通过提供疫苗组合物来实现这个目标，该疫苗组合物包含至少一种此处说明的HBV的疏水性修饰preS衍生肽和可选择的药学上可接受的载体和/或赋形剂。
具体实施方式
在下面对本发明进行更详细的描述之前，应理解本发明并不限于此处描述的特定的方法、流程和试剂，因为这些可能会改变。也应理解此处使用的术语只是为了描述特定的实施方式，并不是想限制本发明的范围，本发明只是被附后的权利要求限制。除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有的含义应当与本领域中的技术人员通常理解的一样。为了本发明，此处引用的所有参考文献全部并入此处以供参考。
HBV的疏水性修饰的preS衍生肽
如上所述，本发明提供了乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS衍生肽。
HBV的包膜包括三种称为L(大的)、M(中等的)、S(小的)的蛋白(参见图1A)。它们共有具有四个跨膜区的C-末端S结构域。M和L蛋白带有另外的N末端延伸的55个氨基酸和取决于基因型的107或118个氨基酸(preS2和preS1)(参见图1B)。
因此，根据本发明的术语HBV的“preS衍生”肽指的是具有与HBV的L蛋白N末端延伸段(preS1)相对应的氨基酸序列的肽，优选地，该“preS衍生”肽具有与种类和基因型A至H以及卷毛猴(WMHBV)、黑猩猩以及大猩猩乙型肝炎病毒的共有序列相对应的氨基酸序列，但是该“preS衍生”肽还包括其变体，优选N末端和/或C末端截断型变体、氨基酸置换变体。
SEQ ID NO.1显示种类和基因型A至H以及卷毛猴(WMHBV)的HBV preS共有氨基酸序列。
参见图2中排列，显示HBV preS共有序列(Consensus)和八种HBV基因型(A-H)以及卷毛猴HBV(WMHBV)preS序列含有2-48位点氨基酸。注意基因型A、B、C、E、F、G和H在它们的N-末端具有高达11个另外的氨基酸。
本申请中的HBV“基因型C”的氨基酸序列指的是人工序列，它与HBV基因型C相对应或与其相等，正如基因库ABV02850.1中所示，只是本发明基因型C中的位点46(根据下面描述的编号)是赖氨酸(K)，代替了基因库序列中的谷氨酰胺(Q)；本申请中HBV基因型C序列可以被称为“HBV基因型C Q46K”。参见SEQ ID NOs.4、12、21-27。
图2也显示了HBV preS共有序列的氨基酸残基的编号，将在整个说明书中被参照：
氨基酸残基位点1是基因型D(以前被描述为亚型ayw，参见SEQ ID NO.5)的蛋氨酸(Met1)，而氨基酸残基位点(-11)是基因型C(SEQ ID NO.4)的蛋氨酸(Met(-11))。在体内，Met1或者Met(-11)分别被细胞的蛋氨酰氨肽酶切断并且被随后转移的来自于豆蔻酰-CoA的豆蔻酰残基修饰，该豆蔻酰残基通过N-豆蔻酰转移酶分别转移至氨基酸残基位点2甘氨酸(Gly2)或者氨基酸残基位点(-10)甘氨酸(Gly(-10))。基因型D的N-末端氨基酸残基是天然氨基酸甘氨酸(Gly2)并且根据由L的基础开放阅读框(Underlying Open Reading Frame)的密码子开始的相应编号被编号为2(或者基因型C的Gly(-10))。
HBV preS共有序列也包括基因型A、B、C、E、F、G和H的另外的N-末端氨基酸(被指定在“-”位置)。因此，全部HBV preS共有序列包含位点(-11)至48。
因此，上述的编号与SEQ ID NO.1中氨基酸的实际编号之间存在差异，比如：
Met(-11)，残基编号(-11)，在SEQ ID NO.1中被列为氨基酸残基1；
Gly(-10)，残基编号(-10)，在SEQ ID NO.1中被列为氨基酸残基2；
Met1，残基编号1，在SEQ ID NO.1中被列为氨基酸残基12；
Gly2，残基编号2，在SEQ ID NO.1中被列为氨基酸残基13；
Gly48，残基编号48，在SEQ ID NO.1中被列为氨基酸残基58。
SEQ ID NO：1HBV preS共有序列(位点(-11)至48)
(-11)-M GGWSS TPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFRA NSNNP DWDFN PNKDH WPEAN KVG-48
SEQ ID NO：2HBV基因型A
(-11)-M GGWSS KPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DWDFN PVKDD WPAAN QVG-48
SEQ ID NO：3HBV基因型B
(-11)-M GGWSS KPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFKA NSENP DWDLN PHKDN WPDAN KVG-48
SEQ ID NO：4人工氨基酸序列，与HBV基因型C相对应，除了46位点上是赖氨酸(K)而不是谷氨酰胺(Q)以外；Q46K
(-11)-M GGWSS KPRQG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DWDFN PNKDH WPEAN KVG-48
SEQ ID NO：5HBV基因型D
1-MGQNL STSNP LGFFP DHQLD PAFRA NTANP DWDFN PNKDT WPDAN KVG-48
SEQ ID NO：6 HBV基因型E
(-10)-MGLSW TVPLE WGKNI STTNP LGFFP DHQLD PAFRA NTRNP DWDHN PNKDH WTEAN KVG-48
SEQ ID NO：7HBV基因型F
(-11)-M GAPLS TTRRG MGQNL SVPNP LGFFP DHQLD PLFRA NSSSP DWDFN TNKDS WPMAN KVG-48
SEQ ID NO：8HBV基因型G
(-10)-MGLSW TVPLE WGKNL SASNP LGFLP DHQLD PAFRA NTNNP DWDFN PKKDP WPEAN KVG-48
SEQ ID NO：9HBV基因型H
(-11)-M GAPLS TARRG MGQNL SVPNP LGFFP DHQLD PLFRA NSSSP DWDFN TNKDN WPMAN KVG-48
SEQ ID NO：10WMHBV
1-MGLNQ STFNP LGFFP SHQLD PLFKA NAGSA DWDKN PNKDP WPQAH DTA-48
对于SEQ ID NOs.2-10参见基因库登录号：
HBV基因型A 基因库AAT28684.1
HBV基因型B 基因库AAU01950.1
HBV基因型C 基因库ABV02850.1(其中位点46是赖氨酸(K)(如同在SEQ IDNO.4中)而不是谷氨酰胺(Q)(在ABV02850.1中)。
HBV基因型D 基因库AAR19337.1
HBV基因型E 基因库ABS31101.1
HBV基因型F 基因库ABK19774.1
HBV基因型G 基因库AAF34735.1/AF160501_3
HBV基因型H 基因库AAM09052.1
WMHBV 基因库AAC16905.1
根据本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽的通式如下：
Hm-P-Rn，
其中
P是所述preS衍生肽；
H是P的所述疏水性修饰；
R是P的C末端修饰；
m至少是1；
n是0或者至少是1。
根据本发明的HBV的preS衍生肽，P，包含：
-如SEQ ID NO.1所示的HBV preS共有序列的氨基酸序列，SEQ ID NO.或者
-其变体。
“变体”优选是N-末端和/或C-末端截断型变体、氨基酸置换或缺失变体、或延长变体。此外，变体还包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含被修饰的氨基酸、非天然的氨基酸或者拟肽类或另外的可以模拟肽主链/结构的化合物。
优选的，变体选自SEQ ID NO.1的N-末端和/或C-末端截断型变体；氨基酸置换或缺失变体；包含被修饰的氨基酸、非天然的氨基酸或者拟肽类或另外的可以模拟肽主链/结构的化合物的变体。
根据本发明，疏水性修饰的preS衍生肽的变体包含SEQ ID NO.1的至少10或20个连续的氨基酸，并且可以由SEQ ID NO.1的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48个或更多的氨基酸或它的变体组成。
N-末端和/或C-末端截断型变体优选包含SEQ ID NO.1的至少48个连续的氨基酸(优选残基2至48)，更优选的是SEQ ID NO.1的至少17个连续的氨基酸(优选残基5至21)或SEQ ID NO.1的至少20个连续的氨基酸(优选残基2至21)。
术语“变体”也指的是在不同病毒种类、菌株或者嗜肝DNA病毒种类的亚型中发现的同源序列，如HBV菌株α1、HBV菌株LSH(黑猩猩分离菌)、卷毛候HBV(WMHBV)或者选自下组的菌株：HBV基因型A至H，以及此处描述的HBV基因型C，Q46K(如SEQ ID NO.4)。
术语“变体”也指的是与SEQ ID NO.1至少有50％序列同一性的同源序列，或者此处公开的任何其他氨基酸序列，优选具有70％，更优选80％，更进一步优选90％或者95％的序列同一性。
因此，根据本发明的优选的疏水性修饰的preS衍生肽中，P包含SEQ ID NO.1的变体，其具有不同病毒种类、菌株或者亚型的氨基酸序列或者其变体，优选具有HBV基因型或卷毛猴HBV(WMHBV)的氨基酸序列。
优选地，P包含选自SEQ ID NOs.2至10的氨基酸序列或者其变体(参见图2)。
在根据本发明的疏水性修饰的preS衍生肽的优选实施方式中，P包含SEQ ID NO.1的变体，其具有选自下组的氨基酸序列：
如SEQ ID NO.1中显示的HBV preS共有序列的氨基酸残基2至21、
氨基酸残基5至21、
氨基酸残基5至15或
氨基酸残基9至15(参见[SEQ ID NO.15])。
更加优选地，P不包含在SEQ ID NO.1的残基9至22上的氨基酸置换和/或缺失，例如通过删除残基17至22。
更加优选地，P不包含在SEQ ID NO.1的残基9至15上的氨基酸置换和/或缺失。
更加优选地，NPLGFFP基序[SEQ ID NO.15](对应于SEQ ID NO.1的残基9至15)没有被中断或者被修饰，例如通过D-氨基酸来取代残基11-15。
更加优选地，根据本发明的疏水性修饰的preS衍生肽中，P包含SEQ ID NO.1的变体，其具有选自下组的氨基酸序列：
共有序列的氨基酸残基2至48 [SEQ ID NO.11]；
基因型C的氨基酸残基2至48 [SEQ ID NO.12]；
基因型C的氨基酸残基2至21 [SEQ ID NO.13]；
基因型C的氨基酸残基5至21 [SEQ ID NO.14]；
基因型C的氨基酸残基9至15 [SEQ ID NO.15]；
基因型D的氨基酸残基2至48 [SEQ ID NO.16]；
基因型D的氨基酸残基5至48 [SEQ ID NO.17]；
基因型D的氨基酸残基2至33 [SEQ ID NO.18]；
基因型D的氨基酸残基5至33 [SEQ ID NO.19]；
基因型D的氨基酸残基2至21 [SEQ ID NO.20]；
基因型D的氨基酸残基9至15 [SEQ ID NO.15]。
因此优选地，P包含选自SEQ ID NOs.11至20的氨基酸序列SEQ ID NOs.或者其变体。
对于P的优选的氨基酸序列，参见下述，表1-7，附图和实施例。
SEQ ID NO.1的“变体”也包括具有氨基酸缺失、氨基酸置换(例如通过其他氨基酸或通过等构物(具有与蛋白质氨基酸相似的结构和空间相似性的被修饰的氨基酸)的保守或非保守的替换)、氨基酸添加或等构物添加的变体或者“类似物”，，只要在肽浓度低于10μM，和优选低于1μM下，序列能引起70％的HBV感染的抑制。
保守的氨基酸置换典型地涉及在相同种类的氨基酸中的置换。这些种类包括：例如
-具有不带电荷的极性侧链的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；
-具有碱性侧链的氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
-具有酸性侧链的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；以及
-具有非极性侧链的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
本发明的疏水性修饰的preS衍生肽优选可被修饰以便具有增加的免疫原性。例如，这种增加的免疫原性指的是增加免疫接种后引发的抗体范围，或者允许产生能够压制不同病毒株感染的抗体。
在另一个实施方式中，本发明的疏水性修饰的preS衍生肽优选可被修饰以便降低它们的免疫原性。这种疏水性修饰的preS衍生肽在治疗应用以便抑制体内HBV感染上特别有用，同时避免或限制了副作用。
因此，优选地通过置换和/或缺失修饰的基序是承担免疫原性的序列，如B细胞表面抗原和/或T细胞表面抗原以及此外的抗体识别基序。
HBV的B细胞表面抗原优选是SEQ ID NO.1的氨基酸残基20至23，基序DPAF；共有序列(SEQ ID NO.1)和基因型C(SEQ ID NO.4)的氨基酸残基26至32，基序NSNNPDW；或者基因型D(SEQ ID NO.5)的NTANPDW。
在优选的实施方式中，SEQ ID NO.1的氨基酸残基20至23被修饰，优选通过氨基酸置换，和/或氨基酸残基26至32被修饰，优选通过氨基酸置换和/或缺失。
优选地，SEQ ID NO.1的氨基酸残基20至23(基序DPAF)通过丙氨酸氨基酸置换被修饰，优选地变成基序APAF。
优选地，SEQ ID NO.1的氨基酸残基26至32通过丙氨酸氨基酸置换被修饰，优选地变成基序NANAPDW或者NAAAPDW。
在优选的实施方式中，P包含选自SEQ ID NOs.21至28的氨基酸序列SEQ ID NOs.或者其变体。
参见下述，表2、7和各个附图和实施例。
在更加优选的实施方式中，P包含选自下组的氨基酸序列：
SEQ ID NO.11(共有序列的残基2至48)，
SEQ ID NO.12(基因型C的残基2至48)，
SEQ ID NO.13(基因型C的残基2至21)，
SEQ ID NO.4(基因型C的残基(-11)至48)，以及
SEQ ID NO.20(基因型D的残基2至21)。
PreS衍生肽P的疏水性修饰(H)是P的N-末端。
“N-末端”指的是N-末端的疏水性修饰，即各自的第一个氨基酸残基(如Gly2)，但是也包括在接近N-末端上的疏水性修饰，如各自的氨基酸残基(-4)、(-3)、(-2)、
(-1)、1、2或3或4。因此，疏水性修饰可以进一步通过在接近P的N-末端的位点连接疏水性部分来获得。
根据本发明，上述的HBV的preS衍生肽的疏水性修饰是将疏水性部分添加到肽上。
此外，m至少是1，即用至少1个疏水性部分或者基团修饰。
在本发明的优选实施方式中，m是1、2、3、4或更多。亦即，P可以用一个以上疏水性部分或者基团修饰，例如2个。疏水性部分或者基团相互之间可以是相同的或者不同的。
根据本发明，上述的HBV的preS衍生肽的疏水性修饰是选自：
-酰基化；
-疏水性部分的添加。
酰基化优选选自用羧酸、脂肪酸和具有亲脂性侧链的氨基酸的酰基化。
优选脂肪酸是饱和的或者不饱和的脂肪酸，支链的或者无支链的脂肪性，优选具有8至22个碳原子(C8至C22)。
更加优选的，酰基化的疏水性修饰选自用豆蔻酰(C14)、棕榈酰(C16)或者硬脂酰(C18)的酰基化。
优选疏水性部分的添加选自胆固醇、胆固醇的衍生物、磷脂、糖脂、甘油酯、类固醇、神经酰胺、异戊二烯衍生物、金刚烷、法尼醇、脂肪基、多环芳烃化合物的添加。
疏水性部分的连接优选通过共价键进行，其可以通过氨基甲酸酯、酰胺、醚、二硫化物或者任何其他的在本领域技术人员能力之内的连接来完成。
因此，本发明的疏水性修饰，优选的酰基化的preS衍生肽优选是脂肽类，因为它们的N-末端的亲脂性或者疏水基团/部分。
对于优选的疏水性修饰的preS衍生肽，参见表1和2。
本发明的更加优选的疏水性修饰的preS衍生肽如下所述：
-P包含自SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.20的氨基酸序列以及
-H是用豆蔻酰(C14)或者硬脂酰(C18)、优选用硬脂酰(C18)酰基化的疏水性修饰。
因此，本发明更加优选的疏水性修饰的preS衍生肽是如下：
肽的名称 氨基酸序列 疏水性修饰
HBVpreS/2-48硬脂酰(共有序列) SEQ ID NO.11 硬脂酰(C18)
HBVpreS/2-48豆蔻酰(共有序列) SEQ ID NO.11 豆蔻酰(C14)
HBVpreS/2-48硬脂酰(C) SEQ ID NO.12 硬脂酰(C18)
HBVpreS/2-48豆蔻酰(C) SEQ ID NO.12 豆蔻酰(C14)
HBVpreS/2-21硬脂酰(C) SEQ ID NO.12 硬脂酰(C18)
HBVpreS/(-11)-48硬脂酰(C) SEQ ID NO.4 硬脂酰(C18)
HBVpreS/(-11)-48豆蔻酰(C) SEQ ID NO.4 豆蔻酰(C14)
HBVpreS/2-21硬脂酰(D) SEQ ID NO.20 硬脂酰(C18)
其中(C)指的是HBV基因型C Q46K。
基因型C序列的优选实施方式
在本发明的非常优选的实施方式中，根据本发明的疏水性修饰的preS肽P包含来源于基因型C的氨基酸序列。
本发明的来源于基因型C的疏水性修饰的preS衍生肽比相应的基因型D更加有效地抑制HBV感染。参见图3和表3.
如上所述，本申请中的HBV“基因型C”的氨基酸序列指的是人工序列，其与基因库ABV02850.1中所示的HBV基因型C相对应或相同，除了在本发明的基因型C中位点46(根据如下所述的编码)是赖氨酸(K)而不是基因库序列中的谷氨酰胺(Q)；本申请中的HBV基因型C序列也可以称作“HBV基因型C Q46K”。参见SEQ ID NOs.4、12、21-27。
如上所述的用于HBV preS共有序列的相同的编号被用于基因型C序列的氨基酸残基的编号(参见图2)，比如：
Met(-11)，残基号码(-11)，在SEQ ID NO.4中被列为氨基酸残基1；
Gly(-10)，残基号码(-10)，在SEQ ID NO.4中被列为氨基酸残基2；
Met1，残基号码1，在SEQ ID NO.4中被列为氨基酸残基12；
Gly2，残基号码2，在SEQ ID NO.4中被列为氨基酸残基13，并且在SEQ ID NO.12中被列为氨基酸残基1；
Gly48，残基号码48，在SEQ ID NO.4中被列为氨基酸残基58，并且在SEQ ID NO.12中被列为氨基酸残基47。
SEQ ID NO：12氨基酸序列，与HBV基因型C的位点2至48相对应，除了在位点46上是赖氨酸(K)而不是谷氨酰胺(Q)；Q46K
2-GTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DWDFN PNKDH WPEAN KVG-48
P可以优选地选自下组：
SEQ ID NO.12 (基因型C的残基2至48)，
SEQ ID NO.4 (基因型C的残基(-11)至48)，
SEQ ID NO.13 (基因型C的残基2至21)，
SEQ ID NO.14 (基因型C的残基5至21)，以及
SEQ ID NO.15 (基因型C的残基9至15)。
在基因型C序列的优选的实施方式中，乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS衍生肽的通式如下：Hm-P-Rn，
其中优选地
P是preS衍生肽或者其衍生物，该preS衍生肽包含SEQ ID NO.12的氨基酸序列或者至少10个连续氨基酸的该序列的N-或/和C-末端截断型变体，其衍生物包含被修饰的氨基酸、非天然的氨基酸或拟肽类；
H是preS衍生肽P的疏水性修饰，其是P的N-末端，并且选自酰基化和疏水性部分的添加；
R是上述preS衍生肽P的C-末端修饰；
m至少是1；以及
n是0或者至少是1。
本发明的优选的肽对于HBV和/或HDV感染的抑制、急性HBV和/或HDV感染的预防、和/或乙型肝炎和/或丁型肝炎的治疗是特别有效的。
优选地，P包含SEQ ID NO.12(基因型C的残基2至48)的氨基酸序列，或由其组成。
同样优选地，P包含SEQ ID NO.12的氨基酸序列的变体，其中变体包含SEQ ID NO.12的至少10个连续的氨基酸残基(优选残基9至18)，更加优选15个或20个，并且可以由SEQ ID NO.12的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或更多的氨基酸残基组成。
优选地，包含于P中的SEQ ID NO.12的连续的氨基酸残基选自：
基因型C的氨基酸残基9至15 [＝SEQ ID NO.15]；
基因型C的氨基酸残基2至15，
基因型C的氨基酸残基9至18，
基因型C的氨基酸残基2至18，
基因型C的氨基酸残基2至20，
基因型C的氨基酸残基2至21 [＝SEQ ID NO.13]，
基因型C的氨基酸残基5至21 [＝SEQ ID NO.14]，
基因型C的氨基酸残基2至25，
基因型C的氨基酸残基2至30，
基因型C的氨基酸残基2至35，
基因型C的氨基酸残基2至40，
基因型C的氨基酸残基2至45，
基因型C的氨基酸残基2至46，或者
基因型C的氨基酸残基2至48 [＝SEQ ID NO.12]。
在一个实施方式中，P包含SEQ ID NO.12的各个剩余的氨基酸残基，称作：
基因型C的氨基酸残基16至48，
基因型C的氨基酸残基19至48，
基因型C的氨基酸残基21至48，
基因型C的氨基酸残基22至48，
基因型C的氨基酸残基26至48，
基因型C的氨基酸残基31至48，
基因型C的氨基酸残基36至48，
基因型C的氨基酸残基41至48，
基因型C的氨基酸残基46至48，或者
基因型C的氨基酸残基47至48，
它们或者与SEQ ID NO.12的各个氨基酸残基相同，或者是它们的衍生物，
其中衍生物包含至少一种修饰，所述修饰选自下组：氨基酸置换、氨基酸缺失、被修饰的氨基酸、非天然的氨基酸或者拟肽类，
其中至少一种修饰是1、2、3、4、5或更多的修饰。
优选的氨基酸置换如此处所描述。
更优选地，P包含选自下组的氨基酸序列：
-包含SEQ ID NO.12的氨基酸残基2至15、以及与其相邻的SEQ ID NO.12的氨基酸残基16至48的衍生物的氨基酸序列；
-包含SEQ ID NO.12的氨基酸残基2至20和与其相邻的SEQ ID NO.12的氨基酸残基21至48的衍生物的氨基酸序列；
-包含SEQ ID NO.12的氨基酸残基2至25和与其相邻的SEQ ID NO.12的氨基酸残基26至48的衍生物的氨基酸序列；
-包含SEQ ID NO.12的氨基酸残基2至30和与其相邻的SEQ ID NO.12的氨基酸残基31至48的衍生物的氨基酸序列；
-包含SEQ ID NO.12的氨基酸残基2至35和与其相邻的SEQ ID NO.12的氨基酸残基36至48的衍生物的氨基酸序列；
-包含SEQ ID NO.12的氨基酸残基2至40和与其相邻的SEQ ID NO.12的氨基酸残基41至48的衍生物的氨基酸序列；以及
-包含SEQ ID NO.12的氨基酸序列的氨基酸序列；
其中衍生物包含至少一种修饰，所述修饰选自下组：氨基酸置换、氨基酸缺失、被修饰的氨基酸、非天然的氨基酸或者拟肽类，
其中至少一种修饰是1、2、3、4、5或更多的修饰。
在基因型C序列的优选实施方式中：
-P包含选自SEQ ID NO.12的氨基酸序列SEQ ID NO.或者相应的被描述的变体/衍生物/修饰，
-H是用豆蔻酰(C14)或者硬脂酰(C18)、优选用豆蔻酰(C14)酰基化的疏水性修饰。
豆蔻酰基化的修饰在体内和药物应用上是优选的，这是由于它的高安全性，如没有硬脂酰基团的副作用(固有的免疫反应等等)。
因此，本发明的更加优选的疏水性修饰的preS衍生肽是下述：
HBV preS/(-11)-48豆蔻酰(C) [SEQ ID NO.4]
HBV preS/2-48豆蔻酰(C) [SEQ ID NO.12]
HBVpreS/2-21豆蔻酰(C) [SEQ ID NO.13]
HBVpreS/5-21豆蔻酰(C) [SEQ ID NO.14]
HBVpreS/9-15豆蔻酰(C) [SEQ ID NO.15]
最优选
HBVpreS/2-48豆蔻酰(C) [SEQ ID NO.12].
上述的preS衍生肽P的C-末端修饰(R)优选是具有能防止降解，如体内降解的部分的修饰。
“C-末端”指的是在C末端的修饰，即相应的最后的氨基酸残基，但是也包括接近C-末端的修饰，如倒数第二个氨基酸残基、倒数第三个氨基酸残基或更多氨基酸残基(比如一种D-氨基酸的引入，防止载体被酶降解，比如通过羧肽酶作用)。
本领域的技术人员将能根据各种应用选择相应的合适的部分。
优选的可以防止降解的部分，选自酰胺、D-氨基酸、被修饰的氨基酸、环状氨基酸；天然的和合成的聚合物，如PEG、聚糖。
在一个实施方式中，P与肽或者蛋白融合，肽或者蛋白优选选自白蛋白和人IgGs的Fc结构域。
融合优选是P的C-末端。
此外，n是0或者至少是1，即C-末端的修饰(R)是可选的。
优选地，n是1。
在本发明进一步的实施方式中，n是1、2、3、4或更多。亦即，P的C-末端或者其接近位点可以被一个以上的部分或者基团修饰，例如2个。该部分或者基团相互之间可以是相同的或者不同的。
在本发明的一个实施方式中，H和/或R通过连接物或隔离物与P连接。
连接物或间隔物对于本领域的技术人员是已知的，例如聚丙氨酸、聚甘氨酸、碳水化合物、(CH2)n基团。
因此，本领域的技术人员将能根据各种应用选择相应的合适的连接物或者间隔物。
在优选的实施方式中，根据本发明的疏水性修饰的preS衍生肽带有标记或者标签，其优选地选自荧光染料、放射性同位素和对比剂。
优选的放射性同位素是131I，125I，99mTc，18F，68Ga，111In，90Y，177Lu。
优选的荧光染料是Alexa染料、罗丹明和荧光素的衍生物、Cy-染料。
优选的对比剂是钆(Gd)复合体、超磁性铁(supramagnetic Fe)复合体和粒子、包含高原子序数的原子的化合物，即用于计算机层析成像术(CT)的碘、微泡和载体例如包含这些对比剂的脂质体。
本发明的肽可以通过各种易于为本领域的技术人员所知的步骤来制备，一般是通过合成化学步骤和/或基因工程步骤制备。
合成化学步骤更为特别地包括固相顺序(sequential)及分组(block)合成(11)。固相的顺序步骤可以利用已建立的自动化方法比如通过使用自动化肽合成器来实行。在这个步骤中，α-氨基保护的氨基酸被连接至树脂支持物上。使用的树脂支持物可以是常规地在本领域中使用的用于(多)肽的固相制备的任何合适的树脂，优选为与聚氧化乙烯共聚合的聚苯乙烯以便提供位点用于与初始引入的o-氨基保护的氨基酸形成酯。本发明者运用的此优选方法已经被清楚地描述(参见比如12)。氨基酸被一个接一个地(逐步的)引入。与引入一个氨基酸相对应的每次合成循环包括脱保护步骤、连续的洗涤步骤、与活化的氨基酸的连接步骤和随后的洗涤步骤。这些步骤的每一步继之以过滤。用于连接的反应试剂是经典的用于(多)肽合成的反应试剂，如二环己基碳二亚胺、羟基苯并三唑、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(卡特缩合剂)和叠氮磷酸二苯酯。在树脂上合成多肽之后，在苯甲醚、乙二硫醇或者2-甲基吲哚存在的条件下，通过用强酸如三氟乙酸进行处理，将多肽从树脂上分离出来。然后通过经典的纯化技术，尤其是通过HPLC，来纯化化合物。
本发明的肽也可以通过连接被选择性地保护的(多)肽段来得到，这种连接如在溶液中被实现。
肽还可以通过本领域中的技术人员所熟知的基因工程技术来生产。真核表达系统，例如杆状病毒系统，是特别合适的。根据这个步骤，蛋白质在感染了重组体杆状病毒的昆虫细胞中被表达，此重组体杆状病毒包含编码异源蛋白质的核酸序列并调节核酸序列，如启动子。一些细胞系可用于重组体杆状病毒感染，例如来自于美式培养物保藏所的细胞系Sf-9(CRL 1711)。在真核表达系统如大肠杆菌中的表达，也是特别合适的。
肽的疏水性部分的引入可以通过各种易于为本领域的技术人员所知的步骤来完成，包括合成的和基因工程方法。
可供选择的，肽和/或融合肽(即疏水性修饰的肽)可以通过被稳定转染的真核细胞系如CHO和其他细胞系来产生，这些细胞系是本领域中为人所熟知的并且通常被用于产生疫苗等等。由于N-末端47-preS1氨基酸促进豆蔻酰基化蛋白质/肽的分泌的固有特性，生物活性的疏水性修饰的肽可以从细胞培养的上清液中提取出来。
本发明的疏水性修饰的preS衍生肽的特征
本发明的疏水性修饰的preS衍生肽是多功能的肝炎病毒进入抑制剂并且还呈现亲肝性/肝趋性，即它们以肝为靶点。肝趋性尤其在图11中被显示。
上述亲肝性被进一步的公开在本发明者的相应的美国临时专利申请中，标题是：“乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰preS衍生肽和它们作为载体应用于将化合物特定的传送给肝”，此专利是在同一天申请的并且被全部并入此处以供参考。
本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽是非常合适的和有效的HBV进入抑制剂，并且是HDV的进入抑制剂，或者在体外(如通过防止HBV颗粒与肝细胞的结合和/或内化)或者在体内。
正如附图和实施例所显示的，本发明的疏水性修饰的preS衍生肽有高抑制活性，即它们以极低的剂量有效地抑制HBV和/或HDV感染。更优选的实施方式的IC50值的范围是0.01至500nM，优选0.025至50nM，更优选0.05至25nM。参见表1。
本发明的来源于基因型C的疏水性修饰的preS衍生肽比相应的基因型D的preS衍生肽更加有效地抑制HBV感染。
此外，本发明的疏水性修饰的preS衍生肽可以被加工成不含有免疫原性的抗原表位，但是仍然呈现强抑制活性，如在其序列中不包含免疫原性抗原表位、但仍具有约8nM的IC50值的HBVpreS/2-21硬脂酰。
本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽也可以交叉防止HBV基因型C和D，因为来源于基因型C的肽(如HBVpreS/2-21硬脂酰(C)或者HBVpreS/2-48豆蔻酰(C))可以抑制HBV基因型D的进入。
药物和疫苗组合物
如上所述，本发明提供一种药物组合物，其包含至少一种此处描述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽和可选择的药学上可接受的载体和/或赋形剂。
根据本发明的药物组合物包含：
-至少一种此处描述的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽；
-此处描述的结合物；以及
-可选择的药学上可接受的载体和/或赋形剂。
根据本发明的药物组合物非常好的适用于此处描述的所有使用和方法。
如上所述，本发明提供一种疫苗组合物，其包含至少一种此处描述的HBV的疏水性修饰preS衍生肽和可选择的药学上可接受的载体和/或赋形剂。
根据本发明的疫苗组合物非常好的适用于此处描述的使用和方法。
“药学上可接受的载体或者赋形剂”指的是任何媒介物(vehicle)，在其中或者利用它们可以配制根据本发明的药物或者疫苗组合物。它包括盐溶液如磷酸盐缓冲盐水。通常，稀释剂或者载体是根据给药的模式和途径以及标准药学工作规范来选择的。
医疗应用
如上所述，本发明提供了本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽和/或相应的药物组合物的首次医疗使用。
因此，根据本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物是合适的并且因此被提供用于诊断、预防和/或治疗疾病。
如上所述，本发明进一步提供本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽和/或相应的药物组合物用于某些疾病的诊断、预防和/或治疗。
在优选的实施方式中，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合物被提供用于抑制HBV和/或HDV感染、用于预防HBV和/或HDV原发感染和/或用于治疗乙型肝炎和/或丁型肝炎，优选用于治疗乙型慢性肝炎和/或丁型慢性肝炎。
在优选的实施方式中，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合物用于药物研制，该药物用于抑制HBV和/或HDV感染、用于预防HBV和/或HDV原发感染和/或用于治疗乙型肝炎和/或丁型肝炎。
优选地，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物被提供用于HBV和/或HDV感染的抑制。
优选地，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物被提供用于预防HBV和/或HDV的原发感染。
优选地，HBV的任何基因型的HBV感染都被抑制或被预防。
本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽可以交叉预防HBV基因型C和D，因为来源于基因型C的肽(如HBVpreS/2-21硬脂酰(C)或者HBVpreS/2-48豆蔻酰(C))可以抑制HBV基因型D的进入。
在优选的实施方式中，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物作为HBV和/或HDV的进入抑制剂被使用/被提供。
优选地，本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物被提供用于治疗乙型肝炎和/或丁型肝炎，尤其是乙型慢性肝炎和/或丁型慢性肝炎。
本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽是非常合适的和有效的HBV进入抑制剂，并且是HDV的进入抑制剂，或者在体外(如通过防止HBV颗粒与肝细胞的结合和/或内化)或者在体内。
此外，本发明提供了一种体外抑制HBV感染肝细胞的方法，包含使用如上所述的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物。
合适的肝细胞包括人主要的肝细胞或者称作HepaRG(22)的肝癌衍生细胞系(在法国专利申请0109044中被描述的)、来自于Tupaia belangeri(23)的肝细胞，它们也是容易受到HBV感染的。
此外，如上所述，本发明提供通过利用本发明的HBV的疏水性修饰的preS衍生肽或药物组合物，用于抑制HBV和/或HDV感染的方法、预防HBV和/或HDV原发感染和/或治疗(慢性)乙型肝炎和/或(慢性)丁型肝炎的方法。
给药途径
优选地，本发明的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物的给药途径选自下组：皮下的、静脉的、口服的、鼻的、肌肉的、经皮的、吸入的、通过栓剂的。
用于鼻的给药或应用的优选实施方式是鼻喷入法。
有效治疗剂量
本发明的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物被提供以致于它们包含有效治疗剂量的上述药物组合物的上述疏水性修饰的preS衍生肽。
本发明的疏水性修饰的preS衍生肽或者药物组合物的“有效治疗剂量”指的是足以抑制HBV和/或HDV感染、预防HBV和/或HDV原发感染、治疗乙型肝炎和/或丁型肝炎和/或疫苗接种和/或体内抑制HBV和/或HDV进入的剂量。
优选的有效治疗剂量的范围是每kg体重10μg至1mg，优选地是10μg至100μg。
对于本发明的疏水性修饰的preS衍生肽作为疫苗的使用，优选的有效治疗剂量的范围是每kg体重10μg至1mg。
如果使用的疏水性preS衍生肽的IC50值是约10nM，那么优选的有效治疗剂量是每kg体重约100μg或每个病人1至5mg的范围。优选的每个病人1至5mg的有效治疗剂量可以一天给药一次或者在其他实施方式中每2-3天仅给药一次。
优选的有效治疗剂量取决于各自的应用和想要的抑制、治疗或者疫苗接种的结果。
本领域的技术人员将能确定合适的有效治疗剂量。
HBV受体的识别
本发明还涉及一种用于体外和/或体内识别肝细胞受体的方法，此方法涉及HBV的连接和/或穿透，和/或包括使用如上所述的疏水性修饰的preS衍生肽定量表达上述受体。
上述肝细胞受体可以在哺乳动物或者相应的动物模型中被识别，优选小鼠或人。
尤其是，上述方法包括如下步骤：
-将肝活组织检查或者肝细胞与本发明的疏水性修饰的preS衍生肽在如下条件下相接触一段时间：足以允许上述肽与在肝细胞表面表达的受体特异性的结合；
-检测上述肽与受体的结合；以及
-识别上述受体。
这可以根据本领域的技术人员所熟知的经典步骤来完成。比如，可以包括本发明的疏水性修饰的preS衍生肽的放射性的、酶的或者荧光标记和随后利用合适的方法检测。许多荧光物质是已知的并且可以被用作标记物。这些包括，如荧光素、罗丹明、金胺、得克萨斯红、Cy3、Cy5、DIGE-标记物。酶标记包括将酶连接至所研究的分子上，如多肽，并且可以通过任何比色法、分光光度法或者荧光分光光度法来检测。
发明者识别出能有效的阻断HBV在体外和体内的进入的HBV-preS-表面蛋白质-衍生脂肽。本发明关于这些抑制肽的生物分布(biodistribution)研究显示它们有选择性的聚集在肝上，在肝上它们结合肝细胞并被推测进入肝细胞。这种亲肝性需要肽的N-末端酰基化并且依赖于在N-末端47preS1氨基酸内的某种HBV preS基序，即在氨基酸残基2至21(或者优选最小序列的残基9至15)内的某种HBV preS基序。发明者观察到此肽序列另外含有膜转位信号，这可以促进甚至完整的融合蛋白穿过质膜的输送(未公开出版的结果)，这开启了如下可能性：将任何种类的药物特定地运输至肝细胞的质膜或者甚至有选择性进入该细胞。
本发明者已经显示HBV preS1衍生脂肽能以极低的剂量完全预防被移植的uPA-RAG-1小鼠模型中的HBV感染。此外关于这些HBVpreS衍生的进入抑制剂的药物代谢动力学研究表明了显著的亲肝性和非常高的血清稳定性(t1/2 ca.60h)和在靶器官中的长半衰期(t1/2 ca.24h)。肽的N-末端的酰基化以及某些氨基酸序列的完整性都是必须的。因此，此肽可以被用作用于肝脏的特定药物靶点的多功能载体来克服肝细胞的感染或者治疗肝细胞癌。
(参见本发明者的相应的美国临时专利申请，标题是：“乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS衍生肽和它们作为载体应用于将化合物特定的传送给肝”，此专利是在同一天申请的。)
此外本发明人证明了这个原理：WMHBV感染可以通过体内皮下注射HBV包膜蛋白衍生肽的应用来有效的被阻断。这将开启新的预防急性HBV感染和用于乙型慢性肝炎的治疗选择的前景。因为用于本发明的uPA/RAG-2/Pfp小鼠缺乏B细胞、T细胞和NK细胞，所以假定了肽对易感染的肝细胞的直接抑制作用。这可以被酰基化的preS衍生肽在肝脏上的有效的聚集、接着可能通过胆汁途径被缓慢的清除所支持。这两个特性允许以极低剂量和低频率进行皮下注射应用。假设5天内5次0.2mg/kg HBV/preS2-48豆蔻酰的注射导致预防WMHBV感染的建立，大约30倍更高活性的肽HBV/PreS2-48硬脂酰以低于7μg/kg≈13nmol/kg的剂量每天给药或者每两天给药的连续给药可能是有效的。考虑到从小鼠中获得的每体重的有效药物学剂量必须用大约10的因子纠正用于人(13)，每个人的有效剂量被预期是低于100μg/天。
用于治疗慢性HBV感染的基于核苷酸类似物的方案频繁地导致抗性突变体的选择(4，14)。这需要另一个策略和新的药物来针对HBV复制循环的不同步骤。HBV脂肽的进入抑制代表了这种方法。由于作用模式，发明者认为其对任何种类的核苷酸抗性突变体均是有效的。此外，因为肽的活性需要preS1结构域(15)中的保守序列，所以肽对任何HBV基因型均是活性的。与Fuzeon将HIV gp41蛋白质作为靶点从而允许分子内的代偿的突变的出现相反，以前的研究表明酰基化的HBV脂肽针对细胞组分来防止HBV和它的受体的相互作用(16，17)。因此，抗性突变体的出现看起来是不可能的。
用于HBVpreS衍生的脂肽的临床应用的明显的指征是预防还没有建立的HBV感染(如暴露后预防、垂直传播或者肝移植的再感染的预防)。然而，进入抑制剂在慢性感染的病人中也是有效的，如与干扰素α或者病毒RT的抑制剂相结合。因为HBV慢性感染的维持一方面取决于被免疫系统清除的感染肝细胞的动力学转换和另一方面取决于被治愈的/原初细胞的(再)感染，故在uPA嵌合系统中评估这种医疗方法的有效性从而在抗病毒治疗下(19)抑制感染的传播和抗性株的出现将是很有意义的。
HBVpreS衍生的脂肽也可以抑制体外HDV的感染，HDV是一种利用HBV包膜蛋白进入肝细胞中的卫星拟病毒(15，17，20)。因为到目前为止还没有有效的用于HDV的感染的治疗，故preS衍生的脂肽代表第一个有选择性的疗法用于这个经常并发的肝脏疾病。
在有免疫能力的病人中HBVpreS-衍生脂肽的应用引发细胞的和体液的免疫反应。这将有益于治疗结果，因为已知识别HBVpreS/2-48的抗原表位的抗体可以压制体外HBV感染(21)。此外，可推定天然感染中的病毒的消除需要HBVpreS-特异性免疫的成功建立。因此，除了直接干扰病毒的进入，通过肽的preS的特异性免疫应答的刺激有助于通过细胞溶解型或者非细胞溶解型免疫反应、特别是与IFNα相结合的病毒的消除。
表1 优选的疏水性修饰的preS衍生肽
Myr指的是N-末端的豆蔻酰基化；
Palm指的是N-末端的棕榈酰基化；
Stearoyl指的是N-末端的硬脂酰基化；
(C)指的是基因型C(具有Q46K，如在SEQ ID NO.4中)；
(D)指的是基因型D；
*肽显示在图中；
**最小序列。
表2优选的在免疫原性抗原表位上具有改变的疏水性修饰的preS衍生肽
Myr指的是N-末端的豆蔻酰基化；
Stearoyl指的是N-末端的硬脂酰基化；
(C)指的是基因型C(具有Q46K，如在SEQ ID NO.4中)；
(D)指的是基因型D。
表3基因型C和D的疏水性修饰的preS肽的比较抑制研究
参见图3。
其中(C)指的是HBV基因型C Q46K。
表4具有共有序列的疏水性修饰的preS肽的感染抑制研究。
参见图4。
表5C-末端缺失变体的比较抑制研究。
参见图5。
表6N-末端和C-末端缺失变体的比较抑制研究。
参见图6。
表7表明氨基酸残基9至15(最小序列)的必要性的疏水性修饰的preS肽的比较抑制研究
参见图7。
表8疏水性修饰的preS肽的比较抑制研究
Retroinverso(反转型)在C至N方向的SEQ ID NO.16中的氨基酸序列
参见图8。
表9表明氨基酸残基9至15(最小序列)的必要性的疏水性修饰preS肽进一步的比较抑制研究
参见图9。
下面的实施例和附图用于说明本发明，但并不是对本发明的限制。
附图说明
图1.HBV粒子和HBV L-、M-、S-蛋白质的图示。
(A)部分双链DNA与病毒聚合酶复合体共价连接，复合体包含末端蛋白、(TP)、逆转录酶(RT)和RNaseH。基因组被二十面体的包壳包裹，此包壳由120个核心蛋白二聚物形成。3种HBV表面蛋白L-、M-和S-被插入至ER衍生脂类双分子层中。L-和M-蛋白包含完整的S-结构域，作为膜锚着点。
(B)3种HBV表面蛋白L、M和S的结构域结构。
L-蛋白包含N-末端豆蔻酰基化的107个氨基酸的preS1结构域、55个氨基酸的preS2结构域和包含4个跨膜部分(I-IV)的S-结构域。
图2.HBV preS1共有序列。
上部分：描述了具有preS1、preS2和S-结构域的HBV的L蛋白。N-末端被豆蔻酰基化。
下面的排列显示：共有序列(Consensus)和八个HBV基因型(A-H)以及卷毛猴HBV(WMHBV)preS序列包含氨基酸2-50。注意到基因型A、B、C、E、G和H在它们的N-末端有11个另外的氨基酸，基因型F有10个另外的氨基酸残基。
在底部，显示已知的功能亚结构域。
请注意HBV基因型C指的是HBV基因型C Q46K。
图3.两种基因型C和D的豆蔻酰基化和硬脂酰基化的HBVpreS衍生肽的比较感染抑制试验。
HepaRG细胞在下述条件下被感染：没有(0nM)或有1、5、25、100、2000nM的HBVpreS/2-48豆蔻酰(D)、HBVpreS/2-48豆蔻酰(C)、HBVpreS/(-11)-48豆蔻酰(C)、HBVpreS/2-48硬脂酰(C)和HBVpreS/(-11)-48硬脂酰(C)。传染性的接种物(基因型D的HBV)和肽被温育过夜。洗涤后，细胞被维持另外的12天以便允许病毒基因表达。收集第8-12天的细胞培养上清液并且用市场上可获得的定量ELISA(酶联免疫吸附测定)分析被分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。来自于各自的未完成的感染的HBsAg值被设置为100％并且感染抑制度以未完成的感染的％给出。其中(C)或者基因型C指的是HBV基因型C Q46K。
图4.具有共有序列的豆蔻酰基化和硬脂酰基化的HBVpreS衍生肽的感染抑制试验。
HepaRG细胞在下述条件下被感染：没有(0nM)或有0.125、0.25、0.5、0.75、1nM的HBVpreS/2-48豆蔻酰(共有序列)和HBVpreS/2-48硬脂酰(共有序列)。传染性的接种物(基因型D的HBV)和肽被温育过夜。洗涤后，细胞被维持另外的12天以便允许病毒基因表达。收集第8-12天的细胞培养上清液并且用市场上可获得的ELISA分析被分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。来自于各自的未完成的感染的HBsAg值被设置被100％并且感染抑制度以未完成的感染的％给出。
图5.基因型D的C-末端删除的硬脂酰基化的HBVpreS衍生肽的比较感染抑制试验。
HepaRG细胞在下述条件下被感染：没有(0nM)或有1、5、25、100、1000nM的HBVpreS/2-48硬脂酰(D)、HBVpreS/2-15硬脂酰(D)、HBVpreS/2-21硬脂酰(D)、HBVpreS/2-26硬脂酰(D)和HBVpreS/2-33硬脂酰(D)。传染性的接种物(基因型D的HBV)和肽被温育过夜。洗涤后，细胞被维持另外的12天以便允许病毒基因表达。收集第8-12天的细胞培养上清液并且用市场上可获得的定量ELISA分析被分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。来自于各自的未完成的感染的HBsAg值被设置为100％并且感染抑制度以未完成的感染的％给出。
图6.基因型D的N-末端和C-末端删除的硬脂酰基化的HBVpreS衍生肽的比较感染抑制试验。
HepaRG细胞在下述条件下被感染：没有(0nM)或有1、5、25、100、1000nM的HBVpreS/2-48硬脂酰(D)、HBVpreS/2-33硬脂酰(D)、HBVpreS/5-33硬脂酰(D)、HBVpreS/5-48硬脂酰(D)、HBVpreS/9-33硬脂酰(D)和HBVpreS/9-48硬脂酰(D)。传染性的接种物(基因型D的HBV)和肽被温育过夜。洗涤后，细胞被维持另外的12天以便允许病毒基因表达。收集第8-12天的细胞培养上清液并且用市场上可获得的定量ELISA分析被分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。来自于各自的未完成的感染的HBsAg值被设置为100％并且感染抑制度以未完成的感染的％给出。
图7.基因型D的内部突变的硬脂酰基化的HBVpreS/2-48肽的比较感染抑制试验。
HepaRG细胞在下述条件下被感染：没有(0nM)或有1、5、25、100、1000nM的HBVpreS/2-48硬脂酰(D)、HBVpreS/2-48硬脂酰(D-AS11-15)(D)、HBVpreS/2-48硬脂酰(Ala11-15)(D)、HBVpreS/2-48硬脂酰(Δ17-21)(D)、HBVpreS/2-48硬脂酰(Ala17-21)(D)和HBVpreS/2-48硬脂酰(Ala2-9)(D)。传染性的接种物(基因型D的HBV)和肽被温育过夜。洗涤后，细胞被维持另外的12天以便允许病毒基因表达。收集第8-12天的细胞培养上清液并且用市场上可获得的定量ELISA分析被分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。来自于各自的未完成的感染的HBsAg值被设置为100％并且感染抑制度以未完成的感染的％给出。
图8.基因型D的内部突变的硬脂酰基化的HBVpreS/2-48肽的比较感染抑制试验。
HepaRG细胞在下述条件下被感染：没有(0nM)或有1、5、25、100、1000nM的HBVpreS/2-48硬脂酰(反转型)(D)和HBVpreS/2-48硬脂酰(Ala21，23，29，30)(D)。传染性的接种物(基因型D的HBV)和肽被温育过夜。洗涤后，细胞被维持另外的12天以便允许病毒基因表达。收集第8-12天的细胞培养上清液并且用市场上可获得的定量ELISA分析被分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。来自于各自的未完成的感染的HBsAg值被设置为100％并且感染抑制度以未完成的感染的％给出。
图9.基因型D的内部突变的硬脂酰基化的HBVpreS/2-48肽的进一步的比较感染抑制试验。
HepaRG细胞在下述条件下被感染：没有(0nM)或有1、5、25、100、1000nM的HBVpreS/2-48硬脂酰(Ala18)(D)、HBVpreS/2-48硬脂酰(Δ11-15)(D)、HBVpreS/2-48硬脂酰(Ser13)(D)和HBVpreS/2-48硬脂酰(Arg11)(D)。传染性的接种物(基因型D的HBV)和肽被温育过夜。洗涤后，细胞被维持另外的12天以便允许病毒基因表达。收集第8-12天的细胞培养上清液并且用市场上可获得的定量ELISA分析被分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。来自于各自的未完成的感染的HBsAg值被设置为100％并且感染抑制度以未完成的感染的％给出。
图10.用于本发明的基因型D的硬脂酰基化的HBVpreS衍生肽。
图11.本发明中的疏水性修饰的preS肽显示了体内的肝趋性。
A HBVpreS/2-48Tyr硬脂酰(D)在小鼠中的生物分布。
B HBVpreS/5-48D-Tyr硬脂酰(D)在小鼠中的生物分布。
C HBVpreS/2-33-D Tyr硬脂酰(D)在小鼠中的生物分布。
图12.通过Myrcludex B在HepaRG细胞上的HBV感染抑制，酰基化的影响。
Myrcludex B指的是HBVpreS/2-48(C)，其中(C)指的是HBV基因型C Q46K。
比较硬脂酰基化和豆蔻酰基化的HBVpreS/2-48(C)、HBVpreS/2-48豆蔻酰(C)和HBVpreS/2-48硬脂酰(C)的竞争分析试验。试验的浓度低于1nM以便没有完全的竞争。
显示的是HBeAg的测定，第7-14天p.i。反应和感染条件与图3至9中所显示的实验相同。
实施例
方法
HBV的疏水性修饰的preS衍生肽的合成
该合成如在(16)中所描述的那样进行。
细胞系和原代细胞培养。
HepaRG细胞在添加有10％胎牛血清(FCS)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、5μg/ml胰岛素和5×10-5 M氢化可的松半琥珀酸酯的William′s E培养基中生长(16)。细胞通过胰蛋白酶处理(trypsination)每两个星期传代1/5。在感染前的两至三星期通过添加2％的DMSO至维持培养基中来诱导细胞分化。培养基每2-3天被交换。
感染竞争试验。
作为传染性的接种物，HepG2克隆2.2.15(23)细胞的50倍浓缩的培养上清液被使用，因为无限制的供给和不变的品质。它是从新鲜收集的上清液中通过在6％聚乙二醇(PEG)8000存在时沉淀病毒颗粒制备的。颗粒再悬浮在含有25％的FCS的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中。等分试样在-80℃被储存。被分化的HepaRG细胞或者PHH和浓缩的感染源，在添加有4％PEG 8000(Sigma)的培养基中稀释10倍，在37℃下一起温育20小时。在温育结束时，细胞被培养基洗涤三次并且被保持在2％DMSO和5×10-5M的氢化可的松半琥珀酸酯中，并且在标明的时间处被收获。
在12孔板上进行竞争实验。大约1×106个细胞首先和化学合成的HBV衍生肽预温育30分钟，接着具有肽的细胞和病毒共温育20小时。所有的竞争系列进行至少两次并且在每种情况下均显示一个代表实验的结果(参见图3至7)。
HepaRG细胞在下述条件下被感染：没有(0nM)或者有
-1、5、25、100和2000nM的
o HBVpreS/2-48豆蔻酰(D)，
o HBVpreS/2-48豆蔻酰(C)，
o HBVpreS/(-11)-48豆蔻酰(C)，
o HBVpreS/2-48硬脂酰(C)以及
o HBVpreS/(-11)-48硬脂酰(C)；或者
-0.125、0.25、0.5、0.75和1nM的
o HBVpreS/2-48豆蔻酰(共有序列)，
o HBVpreS/2-48硬脂酰(共有序列)，
-1、5、25、100和1000nM的
o HBVpreS/2-48硬脂酰(D)，
o HBVpreS/2-15硬脂酰(D)，
o HBVpreS/2-21硬脂酰(D)，
o HBVpreS/2-26硬脂酰(D)和
o HBVpreS/2-33硬脂酰(D)；或者
-1、5、25、100和1000nM的
o HBVpreS/2-48硬脂酰(D)，
o HBVpreS/2-33硬脂酰(D)，
o HBVpreS/5-33硬脂酰(D)，
o HBVpreS/5-48硬脂酰(D)，
o HBVpreS/9-33硬脂酰(D)以及
o HBVpreS/9-48硬脂酰(D)；或者
-1、5、25、100和1000nM的
o HBVpreS/2-48硬脂酰(D)，
o HBVpreS/2-48硬脂酰(D-AS11-15)(D)，
o HBVpreS/2-48硬脂酰(Ala11-15)(D)，
o HBVpreS/2-48硬脂酰(Δ17-21)(D)，
o HBVpreS/2-48硬脂酰(Ala17-21)(D)；或者
-1、5、25、100和1000nM的
o HBVpreS/2-48硬脂酰(反转型)(D)和
o HBVpreS/2-48硬脂酰(Ala21，23，29，30)(D)；或者
-1、5、25、100和1000nM的
o HBVpreS/2-48硬脂酰(Ala18)(D)，
o HBVpreS/2-48硬脂酰(Δl1-15)(D)，
o HBVpreS/2-48硬脂酰(Ser13)(D)，
o HBVpreS/2-48硬脂酰(Arg11)(D)；或者
-50、100、150、250和1000pM(0.05、0.1、0.25和1nM)的
o HBVpreS/2-48豆蔻酰(C)和
o HBVpreS/2-48硬脂酰(C)，
其中(C)指的是HBV基因型C Q46K。
传染性的接种物(基因型D的HBV)和肽被温育过夜。洗涤后，细胞被维持另外的12天以便允许病毒基因表达。收集第8-12天的细胞培养上清液并且用市场上可获得的ELISA分析被分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。来自于各自的未完成的感染的HBsAg值被设置为100％并且感染抑制度以未完成的感染的％给出。
结果显示在图3至9中和图12中以及表3至9中。
疏水性修饰的preS衍生肽的生物分布
在雄性NMRI小鼠中研究疏水性修饰的preS衍生肽的生物分布。依照德国法律(German Law)进行所有的实验。在C-末端包含另外的Tyr残基的肽通过氯胺-T方法被131I(Amersham生物科学，Freiburg，德国)标记并且通过HPLC纯化。被标记的肽通过注射50％DMSO的溶液被皮下注射给药。在选定的时间，小鼠被杀并且用γ计数器(Canberra Packard，Rüsselsheim，德国)测定血液、心脏、肺、脾、肝、肾、肌肉和脑中含有的放射性并且被表示为每克组织被注射剂量的百分比(％ID/g)。
在从肝中提取后，疏水性修饰的preS衍生肽的稳定性评估
为了测定肝中的肽稳定性，皮下注射24小时后，将131I标记的HBVpreS/2-48豆蔻酰(D)从一片肝叶中提取出来。为了这个目的，每克冷冻肝组织1ml的水被添加至样品中。在匀浆化后，等体积的乙腈被添加并且重复匀浆化。离心(4000×g下2×10分钟)后，溶液在反相HPLC柱上被分离并且每个组分的放射性在γ粒子计数器中被定量。
在上述说明书中、在权利要求书中和/或在附图中公开的特征，可以单独地和以任何组合地，作为以其各种形式用于实现本发明的素材。
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机译： 乙型肝炎病毒（HBV）的疏水修饰过的PRES衍生肽及其作为HBV和HDV进入抑制剂的用途
机译： 乙型肝炎病毒（HBV）的疏水修饰过的PRES衍生肽及其作为HBV和HDV进入抑制剂的用途
机译： -乙型肝炎病毒HBV疏水修饰的PRES衍生肽及其作为HBV和HDV进入抑制剂
