一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法。本发明提供一种利用miRNA海绵技术建立转基因小鼠，外源基因构件包括心肌特异启动子、miR-328海绵及转录终止信号，该小鼠心肌miR-328被敲减近50％，由于miR-328参与心律失常的发生，该小鼠模型适于抗心律失常药物的筛选。由于该方法基于转基因小鼠，因此，该模型能够稳定表达“海绵”以稳定敲减miRNA，同时能够遗传。该小鼠表型稳定了，适于后续功能研究。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法。

背景技术

人类疾病绝大多数源于基因表达的异常。近年，发现了一类具有基因表达转录后水平调节作用的小分子非编码RNA，称为“微小RNA(microRNA，miRNA)”。通常，miRNA通过与特定mRNA的3′非翻译区(UTR)结合，导致mRNA降解或以mRNA为模版的翻译过程受到抑制，从而达到负向调节某一基因表达的作用。miRNA功能的研究对于进一步揭示疾病的发生发展具有重大意义。

在研究某一具体miRNA时，常常采用“失功能”的策略，如“敲减”(Knockdown，KD)，即通过某种方法使细胞或动物体内特定miRNA含量减少，再通过观察细胞等出现的表型，分析该miRNA的功能。目前，比较常用的方法是采用人工合成的miRNA抑制剂或拮抗剂(如AMO等)对细胞进行转染或对动物进行静脉注射。但其应用具有明显的不足：成本较高，需要反复注射，其中，较为突出的是作用时间短和无法传代。有实验表明，细胞转染miRNA抑制剂后，最多可作用7天。这显然无法满足某些疾病研究的要求。无法传代更是制约了一些胚胎发育的研究。

miR-328可能参与心律失常的发生，在我们前期研究中，建立了miR-328过表达的转基因小鼠，结果表明miR-328过表达后，小鼠极易出现心律失常。

发明内容

本发明主要是解决现有技术所存在的不足。即：作用时间短和无法传代。细胞转染miRNA抑制剂后，最多可作用7天，无法满足某些疾病，如：肿瘤、代谢等研究的要求，无法传代更是制约了一些胚胎发育的研究等的技术问题；本发明提供了一种能够建立可稳定遗传的心肌特异的miRNA敲减动物模型，为后续的心律失常研究及药物筛选提供动物模型，该模型具有可稳定遗传，具有对抗致心律失常因素的效果，对机体是长期作用的一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法。

本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：

一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，构建心脏特异miR328敲减质粒；

步骤2，在上述心脏特异miR328敲减质粒的基础上，建立miR-328转基因小鼠模型。

在上述的一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法，所述的步骤1中，具体的操作步骤如下：

步骤1.1、选取miRBase上小鼠mature-miR328序列，根据碱基互补原则设计其反义序列，并在第9-12个碱基处人为突变为不互补碱基；

步骤1.2、将六个拷贝该反义序列串联，每个拷贝之间由“aatt”连接，将该序列经Sal I和Hind Ⅲ酶切，并连接入含有心肌特异启动子alph-MHC启动子的pBluescript载体；

步骤1.3、连接产物转化入感受态细胞DH5α，建立重组质粒pBluescript-S-miR328。

在上述的一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法，所述的步骤2中，具体的操作步骤如下：

步骤2.1、以SpeⅠ双酶切步骤1.3中所完成的重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件，该构件包括心肌特异启动子α-MHC、S-328和转录终止信号；

步骤2.2、选取B6雌性小鼠将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养，将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓的ICR的输卵管壶腹部，待ICR小鼠分娩，得到子代小鼠。

在上述的一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法，它还包括一个提取与筛选gDNA的步骤，其操作步骤如下：将步骤2.2中子代小鼠的小鼠尾尖置于消化液中，加入PCI、异丙醇，以70％乙醇溶液冲洗沉淀，加入170uL1×TE，震荡混匀，以gDNA为模板，用S-328筛选引物扩增转基因片段。

在上述的一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法，它还包括一个总RNA的提取与RT-PCR的步骤，其具体的操作步骤如下：按Trizol试剂说明进行总RA提取，按逆转录试剂说明进行逆转录获得cDNA，以S-328筛选引物对其表达进行分析。

在上述的一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法，所述的步骤1.2中，SalⅠ和Hind Ⅲ酶切上述六拷贝序列与pBluescript载体3h，CIP对载体去磷酸化1h，纯化后，经T4连接酶将二者连接，连接产物转化入感受态细胞DH5α，涂板，次日，观察菌落生长情况，挑取菌落进行测序，确定重组质粒pBluescript-miR328。

在上述的一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法，所述的步骤2.1中，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件的步骤包括：用SpeⅠ酶切构建的质粒10ug，电泳将显微注射片段与载体片段分开，将凝胶中6000bp的显微注射片段进行回收，用Qiangen胶回收试剂盒对其进行纯化；纯化后的片段浓度为200ng/uL；所述的调整显微注射用转基因构件时，使其转基因构件浓度至1ng～2ng/uL。

在上述的一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法，所述步骤2.2中，选取B6雌性小鼠为首日13时，注射PMSG 5IU/只；隔日12时注射HCG 5IU/只，并与雄性B6小鼠合笼，同时将发情雌性ICR小鼠与结扎输精管的ICR雄性小鼠合笼，第四日将见栓B6小鼠颈椎离断处死，仰卧位开腹，剪取输卵管近卵巢端0.5cm置于生理盐水中，将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养，并于第四日13时进行显微注射；并将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓的ICR的输卵管壶腹部，3周后，ICR小鼠分娩，乳鼠生后3w用耳标为其编号，并剪取0.5cm尾尖进行外源基因在基因组整合的鉴定。

在上述的一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法，将小鼠尾尖置于0.5mL消化液中，55℃消化3h；加入等体积PCI，1.5×10⁴rpm离心10min，上清移入新管，加0.4mL异丙醇，翻转，离心5min；以70％乙醇溶液冲洗沉淀，离心后晾干；加入170uL1×TE，震荡混匀。

在上述的一种心脏特异microRNA敲减小鼠模型建立的方法，将所述的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，观察外源转基因是否整合入基因组中。

因此，本发明具有如下优点：能够建立一种可稳定遗传的心肌特异的miRNA敲减动物模型，为后续的心律失常研究及药物筛选提供动物模型，该模型具有可稳定遗传，具有对抗致心律失常因素的效果，对机体是长期作用

附图说明

附图1是显微注射用转基因构件示意图，其中转基因构件S-328序列分别为：Mmu：小鼠成熟miR-328序列，AMO：反义序列，Sponges：含突变的反义单元，Sponges-miR-328：miR-328敲减构件；

附图2是转基因小鼠与野生型小鼠心肌组织miR-328含量的比较示意图；

附图3是为心电图测定示意图(电刺激小鼠产生房颤情况)。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例：

1、pBluescript-S-miR328质粒的构建

选取miRBase上小鼠mature-miR328序列，根据碱基互补原则设计其反义序列。将六个拷贝该反义序列串联，每个拷贝之间由“aatt”连接。将该序列经SalⅠ和Hind Ⅲ酶切，并连接入含有心肌特异启动子alph-MHC启动子的pBluescript载体。连接产物转化入感受态细胞DH5α，次日晨挑取7个菌落，进行测序鉴定。测序结果表明，7个质粒全部与预期吻合。成功建立重组质粒pBluescript-S-miR328。

2、miR-328转基因小鼠的建立

以SpeⅠ双酶切上述重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件。该构件包括心肌特异启动子α-MHC、S-328和转录终止信号。调整该构件的浓度至1ng～2ng/uL。

首日13时选取B6雌性小鼠，注射5IU PMSG；隔日12时注射5IU HCG，并与雄性B6小鼠合笼。同时将发情雌性ICR小鼠与结扎输精管的ICR雄性小鼠合笼。第四日将见栓B6小鼠颈椎离断处死，仰卧位开腹，剪取输卵管近卵巢端0.5cm置于生理盐水中。将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养。13时进行显微注射。

将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓的ICR的输卵管壶腹部，术中注意操作轻柔和保温。3周后，ICR小鼠分娩。乳鼠生后3w用耳标为其编号，并剪取0.5cm左右尾尖进行外源基因在基因组整合的鉴定。

3、gDNA的提取与筛选

将小鼠尾尖置于0.5mL消化液中，55℃消化3h。加入等体积PCI，1.5×10⁴rpm离心10min，上清移入新管，加0.4mL异丙醇，翻转，离心5min。以70％乙醇溶液冲洗沉淀，离心后晾干。加入170uL1×TE，震荡混匀。

以gDNA为模板，用S-328筛选引物扩增转基因片段。

PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，观察外源转基因是否整合入基因组中。

4、总RNA的提取与RT-PCR

按Trizol试剂说明进行总RNA提取，按逆转录试剂说明进行逆转录获得cDNA。以S-328筛选引物对其表达进行分析。

5、northern blot

图2为miR-328敲减小鼠与野生型小鼠心肌组织miR-328含量的比较示意图，图中表明(以U6做内参照，敲减小鼠心肌组织内成熟miR-328明显低于野生型心肌miR-328)

6、心电图测定

结合表1，心电图测定示意图中表明miR-328敲减小鼠可对抗致心律失常的因素。电刺激10秒后，KD小鼠出现房颤，在应用维拉帕米后，房颤加重，(n＝10)。

另外，本发明还有这样一些技术特征：

A.构建pBluescript-S-miR328质粒时，SalⅠ和Hind Ⅲ酶切上述

六拷贝序列

与pBluescript载体3h，CIP对载体去磷酸化1h，纯化后(5ug产物)，经T4连接酶将二者连接，连接产物转化入感受态细胞DH5α(50uL)，涂板，次日，观察菌落生长情况，挑取(7个菌落)菌落进行测序，确定重组质粒pBluescript-miR328；

B.利用含SalⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的六拷贝序列：

gtcgacacggaagggcctcagggccagaattacggaagggcctcagggccagaattacggaagg

gcctcagggccagaattacggaagggcctcagggccagaattacggaagggcctcagggccaga

attacggaagggcctcagggccagaagctt

gtcgac：SalⅠ位点

aagctt：Hind Ⅲ

aatt：链接区

上述序列含六个与成熟miR-328不完全互补的反义序列，在体内可以“吸附”miR-328，有如“海面”。所以，我们又将该敲减策略成为“海绵”(Sponges，SP或S)策略。

C.电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件的步骤包括：

用SpeⅠ酶切构建的质粒10ug，电泳将显微注射片段与载体片段分开，将凝胶中6000bp的显微注射片段进行回收，用Qiangen胶回收试剂盒对其进行纯化。纯化后的片段浓度为200ng/uL，调整显微注射用转基因构件的浓度至1ng～2ng/uL；

D.首日13时选取B6雌性小鼠，注射PMSG 5IU(国际单位)/只；隔日12时注射HCG 5IU/只，并与雄性B6小鼠合笼，同时将发情雌性ICR小鼠与结扎输精管的ICR雄性小鼠合笼，第四日将见栓B6小鼠颈椎离断处死，仰卧位开腹，剪取输卵管近卵巢端0.5cm置于生理盐水中，将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养，13时进行显微注射；

E.将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓的ICR的输卵管壶腹部，3周后，ICR小鼠分娩，乳鼠生后3w用耳标为其编号，并剪取0.5cm尾尖进行外源基因在基因组整合的鉴定；

F.将PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，观察外源转基因是否整合入基因组中。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。