用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子制备方法

摘要

本发明涉及用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子制备方法，首先采用硅烷偶联剂对二元荧光共振能量转移染料进行预修饰，再利用溶胶-凝胶化学原理以及溶液中作为结构导向剂的表面活性剂与硅物种的自组装行为，通过硅烷偶联剂与硅源前躯体之间的共同水解缩聚制备得到球形的介孔二氧化硅荧光纳米粒子。与现有技术相比，本发明得到的纳米粒子具有单波长激发的pH比率荧光探针功能，pH检测极限及检测范围可通过改变二元荧光共振能量转移染料之间的比例进行调控，并且由于该体系具有很好的介孔结构和生物相容性，可高容量地负载客体分子。

说明书

技术领域

本发明涉及属于先进纳米材料以及传感器技术领域，尤其是涉及一种用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子制备方法。

背景技术

化学反应的进行、细胞和细胞器的许多重要生理过程等都与pH值密切相关，因此pH值的精确测量对化学生物学研究十分重要。很多有机化合物的荧光或吸光性质随pH的变化可用来指示目标介质中酸碱性的改变，但是这种基于光学信号变化而建立的pH测定方法，很容易受光漂白、传感分子浓度、传感分子的微环境(极性、pH、温度、仪器)、发光的稳定性等因素的影响，从而在一定程度上影响准确的定性和定量，而比率荧光法则克服了以上缺点从而能获得较精确的数据，因此PH比率荧光探针的研究引起了科研工作者们的广泛兴趣。

目前的研究中，有报道采用聚合物颗粒、脂质囊泡、致密二氧化硅纳米粒子等包覆或掺杂两种染料构成PH比率探针的，但是它们一般需要采用两种激发波长来获得两种不同的荧光发射再进行比率计算，给测量带来一些不方便也会对测量的精确性产生一定的影响。荧光共振能量转移(FRET)技术是现代分析化学中广泛应用的一项重要技术，它可以实现单一波长激发下同时产生多种荧光发射。利用FRET的这一特性将可以解决前述的问题。目前已有一些采用FRET技术进行PH比率探针制备的报道。在这些报道中大部分采用量子点结合荧光染料分子制备得到pH比率探针，量子点与荧光染料分子之间可以发生荧光能量转移，因此在单一波长激发下即可获得两种不同的荧光发射，增强了两种荧光发射强度比值的准确性(Chem.Commun.2010，46，2408-2410；J.Am.Chem.Soc.2006，128，13320-13321)。但是众所周知，量子点具有很大的生物毒性，无法应用到生物体系中，这些缺点限制了它们的应用和进一步的深入研究。也有报道采用纳米水凝胶包覆FRET染料对制备得到PH比率探针(Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，4246-4249)，但是水凝胶容易团聚，并且在某些环境条件下水凝胶还容易分解，很大程度地影响测试的准确性。因此，关于寻找合适的载体结合FRET技术制备更先进的pH比率探针的研究仍是一个很具有吸引力和挑战性的研究工作。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种具有很好的介孔结构、生物相容性好、反应条件温和的用于pH比率荧光探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子，是一种掺杂了二元荧光共振能量转移(FRET)染料对的功能性纳米粒子，其粒径大小为200nm～-1μm。由于在制备过程中引入了有机荧光染料分子，因此该纳米粒子在可见光激发下可发出荧光；由于引入的两种有机荧光染料分子激发和发射光谱之间存在较大的重叠，可以构成荧光共振能量转移染料对，因此在单一波长激发下即可产生两种荧光发射；其中的一种荧光发射对pH敏感、一种对pH稳定，两者的荧光强度比值随pH值呈线性变化关系，因此该纳米粒子可用作pH比率探针；同时该纳米粒子具有很好的MCM-41介孔结构，因此该纳米粒子在进行pH值检测的同时还可以负载客体分子到达不同的pH区域。

用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子制备方法，其特征在于，该方法首先采用硅烷偶联剂对二元荧光共振能量转移染料进行预修饰，再利用溶胶-凝胶化学原理以及溶液中作为结构导向剂的表面活性剂与硅物种的自组装行为，通过硅烷偶联剂与硅源前躯体之间的共同水解缩聚制备得到球形的具有pH比率探针功能的介孔二氧化硅荧光纳米粒子。

所述的纳米粒子的pH检测极限及检测范围可通过改变二元荧光共振能量转移染料之间的比例进行调控。

所述的纳米粒子具有很好的介孔结构和生物相容性，可用于负载客体分子。

所述的客体分子包括但不限于布洛芬、地塞米松、长春碱等药物分子的客体分子，将50mg的介孔二氧化硅荧光纳米粒子加入10ml浓度为1mg/JL布洛芬的己烷溶液中，通过紫外-可见吸收光谱测得实际负载量为20％。

该方法具体包括以下步骤：

(1)将掺杂的有机荧光染料分子溶于烷基醇中，然后加入硅烷偶联剂，密封避光反应10～15h，得到预修饰有机荧光染料分子；

(2)将烷基季铵盐表面活性剂溶于二次蒸馏水中，加入碱性催化剂，搅拌10～20min后升温至65～75℃，再加入硅源及预修饰有机荧光染料分子，搅拌反应1～2min后静置2h，将得到的产品冷却至室温，再经离心分离并清洗4～7次至上层溶液无色透明，即得到用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子。

所述步骤(1)中掺杂的有机荧光染料分子的烷基醇的浓度为0.01M，掺杂的有机荧光染料分子烷基醇溶液与硅烷偶联剂的体积比为(22～23)∶1。

所述步骤(1)中掺杂的有机荧光染料分子包括具有氨基反应活性的带有异硫氰酸酯基团或琥珀酰亚胺酯基团的荧光分子，包括异硫氰酸酯荧光素(FITC)与异硫氰酸罗丹明B(RBITC)、罗丹明6G琥珀酰亚胺酯(R6G-SE)或罗丹明101琥珀酰亚胺酯(R101-SE)构成的荧光共振能量传输对；所述的烷基醇为甲醇、乙醇或异丙醇的一种；所述的硅烷偶联剂为三甲氧基胺丙基硅烷或三乙氧基胺丙基硅烷中的一种。

所述步骤(2)中的烷基季铵盐表面活性剂、碱性催化剂、硅源及预修饰有机荧光染料分子的摩尔比为550∶1400∶450∶1。

所述步骤(2)中的烷基季铵盐表面活性剂为结构式为C_nTAB；所述的碱性催化剂为氢氧化钠、氢氧化钾或浓氨水中的一种或几种，所述的硅源为硅酸钠、正硅酸乙酯或正硅酸甲酯中的一种或几种。

所述的烷基季铵盐表面活性剂为结构式中n为12～18。

所述步骤(2)中的离心分离的转速控制为10000～12000rpm。

所述步骤(2)中的清洗采用二次蒸馏水和/或无水乙醇进行清洗。

所述的用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子的介孔孔径在2.3～3nm，比表面积为900～1000m²·g^-1，孔容为0.5～0.7cm³·g^-1。

与现有技术相比，本发明通过将有机荧光染料分子掺杂介孔二氧化硅纳米粒子中致密二氧化硅核中从而制备了具有pH比率探针功能的纳米粒子，通过这种方法制备的纳米粒子具有以下优点：

(1)纳米粒子具有荧光，并且在单一波长激发下可以产生两种荧光发射；

(2)产生的两种荧光发射，其中一种可随pH值而变化，另外一种对pH值稳定，两者的比率值随pH值线性变化；

(3)具有很好的介孔结构，可以装载各种药物分子，通过pH值的变化对生物体病变部位进行检测的同时可对病变部位进行治疗；

(4)具有很好的生物相容性；

(5)反应条件温和，易重复；

(6)该体系具有很好的介孔结构和生物相容性，可用于负载包括但不限于布洛芬、地塞米松、长春碱等药物分子的客体分子，将50mg的介孔二氧化硅荧光纳米粒子加入10ml浓度为1mg/JL布洛芬的己烷溶液中，通过紫外-可见吸收光谱测得实际负载量为20％。

附图说明

图1为实施例1得到的介孔二氧化硅荧光纳米粒子的SEM照片；

图2为实施例1得到的介孔二氧化硅荧光纳米粒子的小角XRD图；

图3为实施例1得到的介孔二氧化硅荧光纳米粒子的氮气吸附脱附曲线；

图4为实施例1得到的介孔二氧化硅荧光纳米粒子的BJH孔径分布曲线；

图5是实施例1-7不同比例两种荧光分子掺杂制备的介孔二氧化硅荧光纳米粒子对pH值响应的比例曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)称取4.7mg FITC加入到单口小烧瓶中，加小磁子，加入1.136ml无水乙醇，再加入50μl APTS，密封避光反应12h，制备FITC-APTS复合物；

(2)称取6.3mg RBITC加入到单口小烧瓶中，加小磁子，加入1.136ml无水乙醇，再加入50μl APTS，密封避光反应12h，制备RBITC-APTS复合物；

(3)称取200mg CTAB，加入到三口烧瓶中，加100ml二次水，加入0.7ml 2mol/L氢氧化钠溶液，搅拌15min，升温至70℃，加入1ml TEOS，80μl FITC-APTS，20μl RBITC-APTS，1min后加入1ml乙酸乙酯，搅拌30s，静置2h。样品冷却，12000rpm离心分离，重新分散到二次水中，离心，这样水洗2次，乙醇洗涤5次至上层溶液无色透明。

(4)萃取除表面活性剂：步骤3中样品分散到150ml乙醇中，加入3ml 2M盐酸，室温搅拌反应12h，12000rpm离心分离，水洗4次，分散到二次水中保存备用。

实施例2～7

制备方法与实施例1相同，FITC∶RBITC两种染料的掺入比例不同，具体表1所示，制备得到介孔二氧化硅荧光纳米粒子。

表1

按照上述实施例制备介孔二氧化硅荧光纳米粒子时，通过调节两种染料的比例值，可以对纳米粒子的pH值检测范围和检测灵敏度进行调节：当FITC掺入量较大时，纳米粒子在酸性范围具有较好线性检测效果；当RBITC掺入量较大时在碱性范围具有较好的线性检测效果；两者比例为1∶2时具有最宽的pH检测范围。同时，随着FITC量的增加，检测的灵敏度提高，当FITC∶RBITC＝1∶4时，其线性斜率为0.41，即pH值每变化1两者的荧光比值变化0.41；当FITC∶RBITC＝4∶1时，达到0.8。对上述制得的材料进行检测，如图1～5所示，图1为实施例1得到的介孔二氧化硅荧光纳米粒子的SEM照片，可以说明制备的纳米粒子具有好的形貌，粒子为单分散，粒径均一，图2为介孔二氧化硅荧光纳米粒子的小角XRD图，从图中可以说明制备的纳米粒子具有有序的MCM-41介孔结构，图3是介孔二氧化硅荧光纳米粒子的氮气吸附脱附曲线，从图中可以说明制备的介孔二氧化硅荧光纳米粒子的等温吸附脱附曲线为IV型，进一步具有介孔结构。图4是介孔二氧化硅荧光纳米粒子的BJH孔径分布曲线，从图中可以说明制备的介孔二氧化硅荧光纳米粒子的孔径约为2.3-3nm，图5是实施例1-7不同比例两种荧光分子掺杂制备的介孔二氧化硅荧光纳米粒子对pH值响应的比例曲线，图中可以说明制备的介孔二氧化硅荧光纳米粒子可用作pH比率探针，并且通过调节染料掺杂比例可对pH响应范围进行调节。检测范围与FITC/RBITC之间摩尔比的具体关系见表2

表2

  FITC/RBITC  4∶1  3∶1  2∶1  1∶1  1∶2  1∶3  1∶4  pH检测范围  4-6  4-6  4-6.5  4-7  4-9  6-9  6.5-9

实施例8

本发明提出的用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子，是一种掺杂了二元荧光共振能量转移(FRET)染料对的功能性纳米粒子，其粒径大小为200-1μm。由于在制备过程中引入了有机荧光染料分子，因此该纳米粒子在可见光激发下可发出荧光；由于引入的两种有机荧光染料分子激发和发射光谱之间存在较大的重叠，可以构成荧光共振能量转移染料对，因此在单一波长激发下即可产生两种荧光发射；其中的一种荧光发射对pH敏感、一种对pH稳定，两者的荧光强度比值随pH值呈线性变化关系，因此该纳米粒子可用作pH比率探针；同时该纳米粒子具有很好的MCM-41介孔结构，因此该纳米粒子在进行pH值检测的同时还可以负载客体分子到达不同的pH区域。

用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子制备方法采用硅烷偶联剂对二元荧光共振能量转移染料进行预修饰，再利用溶胶-凝胶化学原理以及溶液中作为结构导向剂的表面活性剂与硅物种的自组装行为，通过硅烷偶联剂与硅源前躯体之间的共同水解缩聚制备得到球形的具有pH比率探针功能的介孔二氧化硅荧光纳米粒子。

具体包括以下步骤：

(1)将FITC及R101-SE分别溶于甲醇中，控制浓度为0.01M，然后加入三乙氧基胺丙基硅烷，控制FITC及R101-SE溶液与三乙氧基胺丙基硅烷的体积比为22∶1，密封避光反应10h，得到预修饰有机荧光染料分子；

(2)将烷基季铵盐表面活性剂C₁₂TAB溶于二次蒸馏水中，加入氢氧化钾，搅拌10min后升温至65℃，再加入硅酸钠及预修饰有机荧光染料分子，烷基季铵盐表面活性剂、氢氧化钾、硅酸钠及预修饰有机荧光染料分子的摩尔比为550∶1400∶450∶1，搅拌反应1min后静置2h，将得到的产品冷却至室温，再控制离心转速为10000rpm，经离心分离并由二次蒸馏水清洗4次至上层溶液无色透明，即得到用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子，介孔孔径在2.3nm，比表面积为900m²·g^-1，孔容为0.5cm³·g^-1。

实施例9

用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将R6G-SE溶于异丙醇中，控制浓度为0.01M，然后加入三乙氧基胺丙基硅烷，控制R6G-SE与三乙氧基胺丙基硅烷的体积比为23∶1，密封避光反应15h，得到预修饰有机荧光染料分子；

(2)将烷基季铵盐表面活性剂C₁₈TAB溶于二次蒸馏水中，加入浓氨水，搅拌10min后升温至65℃，再加入正硅酸甲酯及预修饰有机荧光染料分子，烷基季铵盐表面活性剂、浓氨水、正硅酸甲酯及预修饰有机荧光染料分子的重量比为550∶1400∶450∶1，搅拌反应2min后静置2h，将得到的产品冷却至室温，再控制离心转速为12000rpm，经离心分离并由二次蒸馏水清洗7次至上层溶液无色透明，即得到用于pH比率探针的介孔二氧化硅荧光纳米粒子，介孔孔径在3nm，比表面积为1000m²·g^-1，孔容为0.7cm³·g^-1。