检测H1和H3亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒

摘要

本发明公开了一组检测H1和H3亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒。该检测H1和H3亚型流感病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测H1亚型流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测H1亚型流感病毒HA基因的LNA修饰的荧光探针，序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5分别为检测H3亚型流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：6为检测H3亚型流感病毒HA基因的荧光探针。本发明进一步提供了含有上述引物和探针的检测H1和H3亚型流感病毒的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、通用性好、重复性好及不易污染的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及检测H1和H3亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒，尤指快速的基于LNA和MGB修饰的短探针单重和双重荧光RT-PCR检测核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于不同动物组织样本中H1和H3亚型流感病毒的准确检测，还可适用于不同动物活体样本(主要为拭子样品)H1和H3亚型流感病毒的检测，可用于动物H1和H3亚型流感病毒的筛查，出入境检疫等，属于检验检疫领域。

背景技术

自1934年首次分离出甲型流感病毒以来，由H1或H3亚型的流感病毒已引起多次世界性的人和动物的大流行以及大流行间期的小流行。H1和H3亚型流感病毒感染宿主范围广，主要感染宿主包括人，禽，猪、马以及其他多种动物。而且其中一些毒株具有在多种动物间传播的能力，例如引起人类历史上多起大流感流感的病原均可在人、猪之间传播。从1989年和1990年发生于我国的马流感疫情中分离出的H3N8亚型的马流感毒株(A/马/吉林/1/89)，该毒株的6个基因片段为禽源片段。2009年全球大流行的甲型H1N1流感病毒是一个新型流感变异株，目前研究已经证明该毒株可自然感染猪、犬猫等哺乳动物。

目前采用TaqMan探针荧光RT-PCR对流感病毒H1和H3亚型进行快速分型检测已经成为目前流感病毒快速检测筛查的首选方法。但TaqMan方法一般要求探针Tm值明显高于引物Tm值，因此在设计引物探针时探针序列往往较长。但对于流感病毒，不同感染宿主的病毒序列之间以及新型变异毒株与经典毒株的HA序列存在很大差异，这使得很多采用长探针的H1和H3核酸检测方法在检测不同来源的H1和H3亚型病毒方面受到局限。

采用短探针可有效解决毒株变异导致的H1和H3亚型流感病毒分型方法通用性较差的问题。

但采用短探针必须在不改变序列的情况下提高探针的Tm值。近期，锁核酸(locked nucleic acid，LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物在生物学研究领域引起了人们的广泛关注，它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O，4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。LNA和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性(ΔTm＝3～8℃)，具有抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性，合成方法相对简单，部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成。

在通过对不同来源的H1亚型流感病毒的HA基因进行序列比对的基础上，发现H1亚型流感病毒HA基因尾部存在12nt的保守区，适合通过LNA修饰后作为短探针用于荧光RT-PCR检测。

但在对H3亚型流感病毒的HA基因进行序列比对时，发现可以利用14nt简并短探针建立荧光RT-PCR方法，由于存在兼并碱基，因此采用在探针3′修饰MGB(Minor Groove Binder)来提高探针的Tm值。

本发明首次将单重和双重基于LNA和MGB的短探针荧光RT-PCR技术应用于H1和H3亚型流感病毒检测，提供了针对H1和H3亚型流感病毒的基于LNA和MGB的短探针、简并引物和试剂盒。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测针对H1和H3亚型流感病毒核苷酸序列，包括引物序列和基于LNA和MGB的短探针序列。

本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的检测H1和H3亚型流感病毒的单重和双重检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

选择H1和H3亚型流感病毒HA基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在12～14个碱基左右，采用LNA或MGB修饰，并标记荧光基团。

1组检测流感病毒H1亚型的核苷酸序列，如下：

1)5’-CAG ATT YTG GCG ATC TAY TC-3′(SEQ ID NO：1)

2)5’-GAC CCA TTA GAR CAC ATC CAG-3’(SEQ ID NO：2)

Y代表嘧啶，此处为T或C；R代表嘌呤，此处为A或G；

3)5’-[HEX]-CCCC[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：3)

1组检测流感病毒H3亚型的核苷酸序列，如下

4)5’-TGG ATT TCM TTY GCC ATA TCA T-3′(SEQ ID N O：4)

5)5’-GCA AAT GTT GCA YCT RAT RTT G-3’(SEQ ID NO：5)

6)5’-[FAM]-TGG CAR GCC CAC AT-[MGB]-3’(SEQ ID NO：6)

Y代表嘧啶，此处为T或C；R代表嘌呤，此处为A或G；M此处为A或C；

其中序列1)和2)分别为检测H1亚型流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，序列3)为检测H1亚型流感病毒HA基因的LNA修饰的荧光短探针，用斜体表示的碱基用LNA进行修饰，即第5、7、9、11位的碱基用LNA进行修饰，探针的5’端标记报告荧光基团HEX(5-hexachloro-荧光素)，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；序列4)和5)分别为检测H3亚型流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，序列6)为检测H3亚型流感病毒HA基因的MGB修饰的荧光短探针，探针的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素)，3’端标记MGB基团。

我们采用TaqMan荧光PCR检测技术建立了H1和H3亚型流感病毒单重和双重检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg²⁺使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。

检测H1和H3亚型流感病毒单重和双重检测试剂盒，由以下组分组成：

1)裂解液：购自INVITROGEN公司，按15ml/瓶进行分装，2瓶/盒。

2)RT-PCR反应液，表1为H1单重反应液配方；表2为H3单重反应液配方；

表3为检测H1和H3的双重反应液配方。

表1H1单重反应液配方

  组分  终浓度  5×RT-缓冲液  0.5×RT-缓冲液  10×PCR缓冲液  0.5×PCR缓冲液  25mM MgCl₂  1.5mmol/L MgCl₂  2.5mM dNTP  0.2mmol/L dNTP  H1正义引物  0.3μmol/L  H1反义引物  0.3μmol/L  H1LNA短探针(H1荧光探针)  0.3μmol/L

表2H3单重反应液配方

  组分  终浓度  5×RT-缓冲液  1×RT-缓冲液  25mM MgCl₂  4.0mmol/L MgCl₂  2.5mM dNTP  0.05mmol/L dNTP  H3正义引物  0.4μmol/L  H3反义引物  0.4μmol/L  H3MGB短探针(H3荧光探针)  0.2μmol/L

表3检测H1和H3亚型流感病毒的双重反应液配方

  组分  终浓度  5×RT-缓冲液  1.0×RT-缓冲液  25mM MgCl₂  4.0mmol/L MgCl₂  2.0mM dNTP  0.05mmol/L dNTP

  H1正义引物  0.4μmol/L  H1反义引物  0.4μmol/L  H1LNA短探针  0.3μmol/L  H3正义引物  0.4μmol/L  H3反义引物  0.4μmol/L  H3MGB短探针  0.3μmol/L

10×PCR缓冲液、25mM MgCl2购于Promega公司；5×RT-缓冲液，2.5mM dNTP购自大连宝生物生物工程有限公司，引物和探针均委托大连宝生物生物工程有限公司合成，其中10×PCR缓冲液的组成为：500mmol/L KCl、100mmol/L Tris-HCl(pH9.0，25℃)、1.0％Triton X-100。5×RT-缓冲液组成为375mmol/L KCl、15mmol/L MgCl₂、50mmol/L DTT、250mmol/L Tris-HCl(pH8.3，25℃)。

3)RT-PCR酶颗粒，购自AMERCIA公司，12粒/盒。

4)Taq DNA聚合酶5U/μL，购自Promega公司。

5)DEPC水，用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1％，37℃搅拌处理12hr，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

6)阴性对照：流感病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7.2PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时。

7)阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。回收H1亚型流感病毒A/Swine/2003(H1N1)HA和H3亚型流感病毒A/Swine/2003/GD(H3N2)HA基因RT-PCR扩增产物，分别获得高纯度的H1亚型和H3亚型流感病毒HA基因编码区序列基因，长度为1701bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，分别命名为pGEM-H1和pGEM-H3。以纯化的质粒为模板，经酶切线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备H1和H3亚型流感病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。

H1亚型流感病毒A/Swine/2003(H1N1)1701bp HA目的片段基因序列具有序列表SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

H3亚型流感病毒A/Swine/2003/GD(H3N2)1701bp HA目的片段基因序列具有序列表SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。：

对合成的引物和探针做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间，即视为合格引物。从1∶10⁴稀释的H1亚型流感病毒A/Swine/2003(H1N1)和H3亚型流感病毒A/Swine/2003/GD(H3N2)鸡胚培养物中提取的RNA为模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对与探针配合使用，扩增的Ct值相对较低，且升幅较高。

将筛选好的引物浓度从0.1μmol/L至0.8μmol/L以0.1μmol/L为间距递增，探针浓度从0.025μmol/L至0.2μmol/L以0.025μmol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较，从多次重复试验中发现：对于单重反应，分别采用表1和表2所列引物浓度和探针浓度时荧光增幅相对较高；对于双重反应，分别采用表3所列引物和探针浓度时荧光增幅相对较高。

我们针对Roche Light Cycler2.0，Roche480以及ABI 7900HT荧光PCR检测仪，在42℃/30min，94℃/3min的逆转录后，对该实验中对变性温度和时间、退火和延伸温度及时间进行了优化实验。扩增时，采用循环次数分别为40、45和50，比较扩增结果的Ct值，进而确定扩增的循环次数为40。最终确定采用扩增效果较好，耗时较短的方案为PCR反应参数：H1亚型单重反应条件为：94℃/15s，52℃/5s，60℃/35s，40个循环；H3亚型单重反应条件和双重反应条件为：94℃/15s，50℃/5s，60℃/35s，40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。

研究表明，Mg²⁺浓度对荧光PCR扩增结果有一定影响，故应用筛选好的引物探针，将Mg²⁺的浓度从1.5mmol/L至6.0mmol/L以0.5mmol/L为间距递增，对不同Mg²⁺浓度条件下的扩增进行了比较。优化后的Mg²⁺浓度为见表1，表2和表3。

我们选择Promega公司生产的Taq酶，一单位的定义：74℃作用30分钟，能将10nM的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求：具DNA聚合酶活性及5’→3’核酸外切酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃1小时后仍保持50％活性。从多次重复试验结果中选定1.25U Taq酶作为使用的Taq酶量。

本发明所述检测H1和H3亚型流感病毒的单重和双重检测试剂盒的使用方法：

1)样品处理：对于组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。对于液体样本，用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融2次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。

2)RNA的提取：在样本处理区进行。

取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，作好标记。首先加入600μL裂解液(裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干)，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL(一份样本换用一个吸头)；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。

12,000g离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇(-20℃预冷)，作好标记。吸取离心后上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600μL 75％乙醇(-20℃预冷)，颠倒洗涤。

12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min(不宜过于干燥，以免RNA不溶)。

加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用(注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增)。

3)RT-PCR扩增：从试剂盒中取出RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系需要15μL RT-PCR反应液和0.25μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，于800g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：H1亚型单重反应条件为：94℃/15s，52℃/5s，60℃/35s，40个循环；H3亚型单重反应条件和双重反应条件为：94℃/15s，50℃/5s，60℃/35s，40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。

4)结果的判定：结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无H1或H3亚型流感病毒；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在H1或H3亚型流感病毒。

本发明的优点是：本发明选择H1或H3亚型流感病毒HA基因编码区作为靶区域，设计引物和LNA和MGB短探针建立并优化了H1和H3亚型流感病毒单重和双重荧光RT-PCR检测方法，取得了优异的技术效果：

1)快速：该方法对PCR产物进行实时监控，RT-PCR结束即可获得结果。

2)灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100～1000倍；对已知拷贝数的体外转录RNA进行检测。结果显示，单重方法的灵敏度均可达10拷贝/反应，双重反应的灵敏度可达100拷贝/反应，略低于单重检测方法。

3)特异：由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统RT-PCR方法；建立的荧光RT-PCR检测方法在检测所收集的其他亚型流感病毒(H4亚型，H5亚型，H7亚型和H9亚型)以及新城疫病毒，结果为阴性，未发现交叉反应。

4)通用性好：可以检出收集到的不同感染宿主来源的H1亚型或H3亚型流感病毒。

5)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；对不同浓度的已知拷贝数的cRNA进行重复性试验，结果见表4。

表4重复性试验结果

6)不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为A/Swine/2003(H1N1)和A/equine/HB/1/07(H3N8)HA基因RT-PCR扩增结果，泳道1为阴性对照，泳道2为A/Swine/2003(H1N1)HA基因扩增结果，泳道3为A/equine/HB/1/07(H3N8)HA基因扩增结果。

图2为H1和H3亚型流感病毒双重检测方法检测极限测定结果。图中上部分为H1检测极限测定结果，下部分H3检测极限测定结果。

图3为H1和H3亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法的特异性试验结果。

具体实施方式

表5本发明方法研究及实施例中用到的病毒核酸

实施例1、试剂盒的配制和使用

1、试剂盒的配制组成，见表6。

表6试剂盒配制组成

具体物质组成如前面所述。

2、试剂盒的使用方法

2.1RNA提取：

取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，作好标记。首先加入600μL裂解液(裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干)，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL(一份样本换用一个吸头)；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。

12,000g离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇(-20℃预冷)，作好标记。吸取离心后上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600μL 75％乙醇(-20℃预冷)，颠倒洗涤。

12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min(不宜过于干燥，以免RNA不溶)。

加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用(注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增)。

2.2扩增试剂准备与配制

从试剂盒中取出单重和双重RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系需要15μL RT-PCR反应液和0.25μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，于400g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：H1亚型单重反应条件为：94℃/15s，52℃/5s，60℃/35s，40个循环；H3亚型单重反应条件和双重反应条件为：94℃/15s，50℃/5s，60℃/35s，40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。

2.3结果判定

结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无H1或H3亚型流感病毒；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在H1或H3亚型流感病毒。

实施例2、试剂盒的灵敏度试验

1、材料：

方法研究过程中应用到的病毒核酸为本实验室保存的经典猪流感病毒A/Swine/2003(H1N1)核酸和马流感病毒A/equine/HB/1/07(H3N8)核酸

2、方法

1)将经典猪流感病毒A/Swine/2003(H1N1)和马流感病毒A/equine/HB/1/07(H3N8)RNA反转录合成cDNA，应用特异性引物扩增含完整HA ORF约1.7kb的DNA片段，将扩增片段回收后克隆于pGEM-T载体中。将提纯的质粒用限制性内切酶PvuII消化处理，对DNA片段纯化回收，之后将其作为模板按照Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNAProduction System-T7试剂盒进行体外转录。转录产物经无RNase的Dnase(1u/μg样品DNA，Promega)消化除去其中的DNA模板后，用TRIZOL重新提取RNA，以去除杂蛋白和各种离子。将RNA沉淀溶于1.0mL的无RNA酶的灭菌水中，分装，20μL/管，冻存于-80℃下，即得到制备好的cRNA片段。

2)取制备的体外转录RNA用无RNA酶的灭菌水分别作200倍稀释，测定其A260吸收值并计算拷贝数。对上述制备的cRNA标准品以10倍梯度稀释后，按最佳条件进行单重和双重荧光RT-PCR测定，并用去离子水作为阴性标准。在对不同稀释度标准品的检测中，确定荧光定量RT-PCR能检出的最低cRNA浓度，并由此得出该方法的检测极限。

3、结果

1)见图1所示，经RT-PCR扩增，获得A/Swine/2003(H1N1)和A/equine/HB/1/07(H3N8)约1.7kb含完整HA ORF的DNA片段。经体外转录后将获得的cRNA纯品。

2)结果显示，单重方法的灵敏度均可达10拷贝/反应，双重反应的灵敏度可达100拷贝/反应，略低于单重检测方法，双重检测方法的灵敏度结果见图2。

实施例3、试剂盒的特异性试验

1、材料

如表5所列

2、方法

用所建立的单重和双重荧光RT-PCR方法对多种流感病毒(包括H1，禽源H4，H5，H7和H9亚型病毒)以及新城疫病毒进行检测，以验证方法的特异性。

3、结果

如图3所示，结果表明所建立的方法与上述病毒无交叉反应，特异性良好。

实施例4、试剂盒对临床样品检测的实验报告

1、材料

我国直属出入境检验检疫局提供的已知样品586份。

2、方法

对我国直属出入境检验检疫局提供的已知样品586份进行检测。在实际样品中验证方法的敏感性和特异性。

3、结果

检测结果见表7。

表7临床样品的检测结果

  样品  数量  实时荧光RT-PCR检测结果  H1阳性样品  16  16/16  H3阳性样品  12  12/12  H5阳性样品  43  0/43  H4阳性样品  2  0/2  H9阳性样品  13  0/13  流感阴性样品  500  0/500

对586份已知样品进行检测。结果显示建立的方法可检出其中所有的H1和H3阳性样品，而且未出现假阳性结果，结果见表8。表明建立的方法可靠实用。