H1和H3亚型猪流感病毒M及HA基因核酸探针的制备及应用

摘要

猪流感(Swineinfuenza,SI)是由正黏病毒科A型流感病毒中的猪流感病毒(SIV)引起的一种急性、高度接触传染性、群发性的猪呼吸道疾病,目前已发现的SIV至少有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H9N2和H5N1等8种不同血清亚型,主要是H3N2和H1N1亚型。由于猪可感染禽流感病毒(AIV)和人流感病毒,被认为是流感病毒的混合器和新亚型流感病毒的加工场,因此,建立一种简便、快速、准确、敏感性强、特异性高的诊断SI的方法不但可以减少养猪业的经济损失,而且对食品安全和公共卫生具有重要的意义。
　　 根据GenBank发表的核酸序列,用DNAstar软件分析SIV的HA基因序列间的差异性,分别设计合成H1和H3亚型的特异分型引物,并根据A型流感病毒的型特异性基因(M基因）,设计了A型流感病毒的通用引物。应用RT-PCR方法分别扩增出了H1和H3亚型SIVM基因460bp的特异性片段、H1亚型SIVHA基因543bp的特异性片段和H3亚型SIVHA基因488bp的特异性片段,并分别克隆到pMD18-TVector构建重组质粒,将各质粒测序后,应用BLAST将扩增产物测序结果与相应病毒亚型的核酸序列进行同源比对,证明扩增出的H1和H3亚型SIVM基因特异性片段与大部分毒株同源性在94％以上,H1亚型SIVHA基因特异性片段与大部分毒株同源性在90％以上,H3亚型SIVHA基因特异性片段与大部分毒株同源性在98％以上,说明这些片段可用于制备核酸探针来检测SIV。
　　 以含有M和HA基因部分序列的重组质粒为模板进行了PCR扩增,扩增产物经地高辛(DIG)标记后制成核酸探针,与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的DNA进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果M基因核酸探针只与H1及H3亚型SIV的cDNA反应呈阳性,H1亚型的HA基因的核酸探针只与H1亚型的SIV的cDNA杂交呈阳性,H3亚型的HA基因的核酸探针只与H3亚型的SIV的cDNA杂交呈阳性,而与其余病毒杂交呈阴性,说明此三个核酸探针具有良好的特异性。敏感性试验显示,M基因核酸探针最低能检出约5pg/μl的H3亚型的SIVRT-PCR产物,H1亚型的HA基因的核酸探针最低能检出约7.7pg/μl的H1亚型的SIVRT-PCR产物,H3亚型的HA基因的核酸探针最低能检出约6pg/μl的H3亚型的SIVRT-PCR产物,说明此三个核酸探针具有较好的敏感性。
　　 用制备的核酸探针对35份疑似SI临床病料进行斑点杂交检测,结果M基因核酸探针检出阳性9份,H1亚型的HA基因的核酸探针检出阳性4份,H3亚型的HA基因的核酸探针检出阳性4份,而同时用针对M和HA基因设计的引物对35份病料进行RT-PCR检测,也检出相同份数的阳性病料,且阳性病料的编号与前法一致,说明此三个核酸探针适合于对H1和H3亚型SI的诊断和流行病学调查,可以作为一种临床检测SI的分子生物学方法。

目录

摘要

英文缩写词表

前言

文献综述

1 SI的流行情况

2 SIV的特性

3 SIV蛋白的研究进展

4 SI诊断方法的研究进展

5 公共卫生学意义

6 本研究的目的意义

试验一 H1和H3亚型猪流感病毒的M及HA基因部分片段的克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

试验二 H1和H3亚型猪流感病毒M及HA基因核酸探针的制备

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

试验三 临床病料的检测

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文

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