一种海参用复方免疫增强剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种海参用复方免疫增强剂及其制备方法，它所要解决的技术问题在于避免在海参疾病防治中使用抗生素以及克服现有中草药成品利用率低的问题，提供了一种海参用复方免疫增强剂。为了解决上述问题，技术方案是，一种海参用复方免疫增强剂，包括至少由芯材和壁材组成的多糖微胶囊，其中所述壁材包括海藻酸钠和壳聚糖，所述芯材与壁材各组分的重量比为：芯材∶海藻酸钠∶壳聚糖＝1∶(2.8～3.5)∶(1～2)，所述的芯材为黄芪多糖提取物和茯苓多糖提取物的至少一种，经实验证明，本发明的免疫增强剂有效提高了海参免疫保护能力，安全、高效。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫增强剂技术领域，具体涉及一种海参用复方免疫增强剂及制备方法。

背景技术

海参具有极高的营养价值和保健功能，近年来其养殖业已成为一项新兴产业。然而由于海参病害问题日渐突出，极易被寄生虫、细菌、病毒、原生动物等病原感染，造成了巨大的经济损失，为控制病害发生，减少损失，生产者多数通过大量使用抗生素来避免疾病的发生，抗生素的过度使用必然使病原抗性增加以及产生毒力更强的病原，同时可能带来的药物残留也将影响产业的发展，危害人类的健康。

中草药的免疫作用显著，且无毒、无残留，已经逐渐应用到海水养殖业的研究。现有的研究和专利都是使用的中草药成品，按照比例配伍后直接投喂(专利CN200910187415.3)或是通过水煎法提取药液后用于药浴治疗(专利200810012641)。由于中草药的有效化学成分复杂同时兼有营养和药物的双重作用，既能促进机体酶合成及活性，又能增加机体抗体效价，调节机体免疫功能，具有非特异性抗菌作用，中草药中的多糖是众多中草药的主要活性物质，其关键性作用举足轻重，目前研究中草药的例如多糖这种单一成分应用到海参疾病防治还甚少。

中草药免疫增强剂的开发成为一个新的重要发展方向，然而口服多糖类免疫增强剂虽具有较多优点但损失多，效果出现时间长，对于海参的摄食性来说，产品的利用效率低。

基于此，如何研发制备一种安全、无毒、无残留的中草药免疫增强剂，起效快，利用率高。

发明内容

本发明为了避免在海参疾病防治中使用抗生素以及克服现有中草药成品利用率低的问题，提供了一种海参用复方免疫增强剂及其制备方法，安全、高效。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种海参用复方免疫增强剂，包括至少由芯材和壁材组成的多糖微胶囊，其中所述壁材包括海藻酸钠和壳聚糖，所述芯材与壁材各组分的重量比为：芯材∶海藻酸钠∶壳聚糖＝1∶(2.8～3.5)∶(1～2)；

所述的芯材为黄芪多糖提取物和茯苓多糖提取物的至少一种。

优选的，芯材∶海藻酸钠∶壳聚糖＝1∶3∶1。

进一步的，当所述的芯材同时包含黄芪多糖提取物和茯苓多糖提取物时，两者的重量比为：黄芪多糖提取物∶茯苓多糖提取物＝1∶1。

又进一步的，海参用复方免疫增强剂还包括枯草芽孢杆菌活菌制剂，添加量为(1～2)×10⁹cfu/g基础饲料，所述多糖微胶囊的添加量为基础饲料的2～4.5％。

优选的，所述枯草芽孢杆菌活菌制剂添加量为1×10⁹cfu/g基础饲料，所述多糖微胶囊的添加量为基础饲料的4％。

再进一步的，所述的基础饲料由海泥和海藻干粉制剂组成。

所述的黄芪多糖提取物中黄芪多糖含量为40～75％。

所述的茯苓多糖提取物中茯苓多糖含量为40～75％。

一种所述的海参用复方免疫增强剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)、按照权利要求1所规定的重量比例称取芯材和壁材；

(2)、把海藻酸钠配制成浓度为2.8～3.5％的海藻酸钠溶液，并将芯材加入到所述的海藻酸钠溶液中，待溶解后使用搅拌器搅拌均匀，作用时间为30～40分钟，形成芯材与海藻酸钠的凝胶液；

(3)、配制浓度为2.8％～4％的CaCl₂溶液，利用喷雾器把所述凝胶液挤压成微胶珠放入到所述CaCl₂溶液中，作用时间为30～50分钟，形成混合颗粒物；

(4)、使用浓度为1％的醋酸把壳聚糖配制成浓度为1～2％壳聚糖溶液，把所述混合颗粒物经蒸馏水至少洗涤3次后放入所述壳聚糖溶液中，使用搅拌器不断搅拌，作用时间为60～100分钟，形成多糖微胶囊颗粒；

(5)、将所述多糖微胶囊颗粒经蒸馏水至少洗涤1次后置于干燥箱内烘干，干燥温度为20～50℃，将烘干后的多糖微胶囊颗粒使用药物粉碎机粉碎，经100-160目筛子过滤。

其中，步骤(3)中所述的CaCl₂溶液的pH为5～6。

其中，步骤(4)中所述的醋酸溶液的pH为2～3。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明的海参用复方免疫增强剂避免了使用抗生素对海参疾病的防治，无毒、无残留，保证了海参产品的食用安全；通过提取中草药例如多糖这种单一成分应用到海参疾病防治；使用微胶囊技术将多糖物质包埋，提高了多糖的使用效率，增强了药效，见效快。

结合本发明具体实施例的详细描述，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

具体实施方式

(1)、称取芯材和壁材，其中所述壁材包括海藻酸钠和壳聚糖，所述芯材与壁材各组分的重量比为：芯材∶海藻酸钠∶壳聚糖＝1∶(2.8～3.5)∶(1～2)；

所述的芯材为黄芪多糖提取物和茯苓多糖提取物的至少一种，当芯材同时包含黄芪多糖提取物和茯苓多糖提取物时，黄芪多糖提取物∶茯苓多糖提取物＝1∶1；

(2)、把海藻酸钠配制成浓度为2.8～3.5％的海藻酸钠溶液，并将芯材加入到所述的海藻酸钠溶液中，待溶解后使用搅拌器搅拌均匀，海藻酸钠由于静电作用，可以吸附在糖类表面，设定作用时间为30～40分钟，形成芯材与海藻酸钠的凝胶液；

也可以先将多糖配成多糖溶液，然后将海藻酸钠加入到多糖溶液中，只需使海藻酸钠质量与配制多糖溶液所添加的蒸馏水体积比保持在2.8～3.5％即可；

(3)、配制浓度为2.8％～4％的CaCl₂溶液，并将其pH值保持在5～6之间，利用锐孔仪把所述凝胶液挤压成微胶珠，并放入到所述CaCl₂溶液中，CaCl₂溶液中的Ca²⁺与海藻酸发生离子交换，设定作用时间为30～50分钟，形成混合颗粒物；

(4)、由于壳聚糖只在强酸性环境中溶解，使用浓度为1％的醋酸把壳聚糖配制成壳聚糖的浓度为1～2％壳聚糖溶液，使溶液的pH保持在2～3，把所述混合颗粒物经蒸馏水至少洗涤3次，以洗除掉未发生反应的Ca²⁺或者其他杂质离子，然后将混合颗粒物放入配制好的壳聚糖溶液中，使用搅拌器不断搅拌，令其混合均匀、充分作用，设定作用时间为60～100分钟，形成多糖微胶囊颗粒；

(5)、将所述多糖微胶囊颗粒经蒸馏水至少洗涤1次后置于干燥箱内烘干，干燥温度为20～50℃，将烘干后的多糖微胶囊颗粒使用药物粉碎机粉碎，经100-160目筛子过滤，即成多糖微胶囊。

为了方便所制备的免疫增强剂易于沉入海参池的底部，防止由于重量轻而漂浮在水面无法被刺参摄食，一般采用免疫增强剂与基础饲料混合一起投喂，基础饲料由海泥和海藻组成，基础饲料投喂量为刺参的体重的2％左右，具体投喂量可视残饵量稍做调整。所述基础饲料优选采用海泥和鼠尾藻，也可以海泥配合使用其他藻类。本发明的免疫增强剂下述的所有实施例投喂海参时混合使用的基础饲料均按海泥∶鼠尾藻＝1∶1进行配制，不再作赘述。

本发明的海参用复方免疫增强剂，可以只包含多糖微胶囊，也可以与枯草芽孢杆菌活菌制剂配合使用。所述枯草芽孢杆菌起到调节水质作用，同时也对海参体腔微生态起到调节作用，两者的含量视基础饲料的重量而定，所述多糖微胶囊添加的重量为基础饲料的2～4.5％，当同时包含多糖微胶囊和枯草芽孢杆菌活菌制剂时，所述多糖微胶囊的添加量仍为基础饲料的2～4.5％，所述枯草芽孢杆菌制剂的添加量为(1～2)×10⁹cfu/g基础饲料。

实施例一，称取海藻酸钠30g溶解于1000ml蒸馏水中，黄芪多糖提取物和茯苓多糖提取物各称取5g，缓慢加入到海藻酸钠溶液中，期间使用磁力搅拌器不断搅拌，作用时间为30分钟，此时形成两种多糖提取物与海藻酸钠的凝胶液。所述黄芪多糖提取物中黄芪多糖含量和茯苓多糖提取物中茯苓多糖含量均为50％。称取30g CaCl₂溶于1000ml蒸馏水中，pH值约为5，利用锐孔仪把所述凝胶液挤压成微胶珠放入到所述CaCl₂溶液中，作用时间为30分钟，形成混合颗粒物。称取10g壳聚糖，溶解于1000ml浓度为1％的醋酸溶液中，所述醋酸溶液的pH约为2.5，把所述混合颗粒物经蒸馏水洗涤3次后放入所述壳聚糖溶液中，使用磁力搅拌器不断搅拌，作用时间为60分钟，形成多糖微胶囊颗粒，然后将其经蒸馏水洗涤3次后置于干燥箱内烘干，干燥温度为40℃，烘干后的多糖微胶囊颗粒直径约为1mm，使用药物粉碎机进行粉碎，经100目筛子过滤，得到直径约为0.14mm的多糖微胶囊。

在对海参喂食时，按照多糖微胶囊重量占基础饲料的4％进行投喂。

实施例二，本实施例的免疫增强剂使用实施例一制备的多糖微胶囊配合使用枯草芽孢杆菌活菌制剂，其中枯草芽孢杆菌活菌制剂的添加量为1×10⁹cfu/g基础饲料，所述多糖微胶囊的添加量为基础饲料的4％。

实施例三，称取黄芪多糖提取物10g，海藻酸钠30g，以及30g CaCl₂和10g壳聚糖，其中，所述黄芪多糖提取物中黄芪多糖含量为50％，本实施例的黄芪多糖微胶囊的制备过程中所配制的海藻酸钠溶液浓度、CaCl₂溶液浓度以及所使用的醋酸浓度均与实施例一中保持一致，制备步骤也一致，只需将黄芪多糖提取物和茯苓多糖提取物部分替换为只有黄芪多糖提取物，在此不做赘述，最终制得黄芪多糖微胶囊，并且按照多糖微胶囊重量占基础饲料的4％进行投喂。

实施例四，称取茯苓多糖提取物10g，海藻酸钠30g，以及30g CaCl₂和10g壳聚糖，其中，所述茯苓多糖提取物中茯苓多糖含量为50％，本实施例的茯苓多糖微胶囊的制备过程中所配制的海藻酸钠溶液浓度、CaCl₂溶液浓度以及所使用的醋酸浓度均与实施例一中保持一致，制备步骤也一致，只需将黄芪多糖提取物和茯苓多糖提取物部分替换为只有茯苓多糖提取物，在此不做赘述，最终制得茯苓多糖微胶囊，并且按照多糖微胶囊重量占基础饲料的4％进行投喂。

实施例五，称取28g海藻酸钠溶解于1000ml蒸馏水中，黄芪多糖提取物和茯苓多糖提取物各称取5g，缓慢加入到海藻酸钠溶液中，期间使用磁力搅拌器不断搅拌，作用时间为40分钟，此时形成两种多糖提取物与海藻酸钠的凝胶液。所述黄芪多糖提取物中黄芪多糖含量和茯苓多糖提取物中茯苓多糖含量均为40％。称取40g CaCl₂溶于1000ml蒸馏水中，利用锐孔仪把所述凝胶液挤压成微胶珠放入到所述CaCl₂溶液中，作用时间为50分钟，形成混合颗粒物。称取20g壳聚糖，溶解于1000ml浓度为1％的醋酸溶液中，把所述混合颗粒物经蒸馏水洗涤3次后放入所述壳聚糖溶液中，使用磁力搅拌器不断搅拌，作用时间为90分钟，形成多糖微胶囊颗粒，然后将其经蒸馏水洗涤1次后置于干燥箱内烘干，干燥温度为20℃，使用药物粉碎机进行粉碎，经160目筛子过滤，得到直径约为0.1mm的多糖微胶囊，并且按照多糖微胶囊重量占基础饲料的2％进行投喂。

试验例1，对实施例一制备的多糖微胶囊颗粒进行溶解实验，称取1g多糖微胶囊，溶解于50ml海水中，室温下放置4小时，测定490nm下的吸光度OD值。根据标准曲线Y＝1.4563X(R²＝0.998)计算，多糖的溶解率约为3％；溶解到刺参体腔液中4小时，多糖溶解率约为30％，说明本发明的实施例一制备的多糖微胶囊颗粒在水中的损失率很低，更多被海参吸收。

试验例2，对实施例二制备的免疫增强剂进行攻毒实验，按照刺参体重的2％将100％免疫增强剂进行投喂，刺参状态良好，未见明显异常，死亡率为0，因此证明本发明的实施例二的免疫增强剂对刺参无毒害、无刺激性作用。

试验例3，对海参几种免疫指标的测定。

实验分为6组，其中4组为本发明实施例一至四中所制备的免疫增强剂，还设置有两组对照组，对照1为只有基础饲料，即海泥和鼠尾藻，按1∶1配制，对照2含有壁材和基础饲料，即海藻酸钠∶壳聚糖＝3∶1，配合使用基础饲料。

实验分早晚各一次进行投喂，早上投喂量为1/3，晚上投喂量为2/3，实验中测定的免疫指标包括碱性磷酸酶AKP，溶菌酶LSZ，超氧化物歧化酶SOD以及补体C3含量。

海参池每天排污，隔天换水，连续充气，设有重复实验，每个实验组三个平行，取样时间分别为第7，14，21，28天，剖取体腔液离心后测定，结果如下：

表1不同实验组对刺参体腔液碱性磷酸酶AKP活性的影响

从表1中可以看出，第21天所有的配方组均比对照组AKP酶的活性有所提高，尤其配方2的AKP酶活性达到2.3金氏单位/ml，是对照1的3倍，是对照2的2.4倍。

表2不同实验组对刺参体腔液溶菌酶LSZ活性的影响

从表2中可以看出，第7天开始所有的配方组均比对照组LSZ酶的活性有很大的提高，特别是配方2的LSZ酶活性达到对照1的2.6倍，是对照2的2.3倍，差异性显著，起效时间较快。

表3不同实验组对刺参体腔液超氧化物歧化酶SOD活性的影响

从表3中可以看出，从第14天开始所有的配方组均比对照组SOD酶的活性提高，而配方2是所有配方组中酶的活性最高的，而且配方组的酶活持续时间比对照组高，较其他实验组该复方制剂也存在明显的优势。

表4不同实验组对刺参体腔液补体C3含量的影响

从表4中可以看出，所有配方组的补体C3含量在第21天最高，而对照组已经有了下滑的趋势，说明配方组效果持续时间长，免疫增强效果显著。

由于酶的活性越高、补体C3含量越高，海参的免疫力就越高，通过对刺参体腔液几种酶活的检测，以及与对照组的比较，说明本发明的海参用复方免疫增强剂可以有效的增强海参的免疫力。多糖微胶囊配合使用枯草芽孢杆菌活菌制剂，提高海参免疫力的同时可以调节水质环境，降低病发率，生长保护率达90％以上，在病发后还可以起到巩固治疗的作用。

以上所公开的仅是本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此，依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。