上皮型钙黏蛋白表达基因CDH1突变检测试剂盒及其用途

摘要

本发明涉及CDH1基因突变检测试剂盒及其用途。试剂盒的主要成分包括：(1)CDH1基因PCR扩增与测序引物19对；(2)PCR扩增用试剂。通过本试剂盒得到的PCR扩增产物，可通过高分辨率溶解曲线法筛查基因微小突变，或者是进行限制性片段长度多态性分析。本试剂盒具有高效的突变检出与功能评估作用。用于CDH1基因突变检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种CDH1基因突变检测试剂盒，特别涉及其在东亚胃癌高发人群的基因诊断与后果评估。

背景技术

CDH1基因位于人类染色体16q22.1，包含16个外显子，全长约100kb，其转录产物为4.5kb信使RNA，通过翻译合成120kD的上皮型钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)。E-cad是钙黏蛋白家族成员之一，钙黏蛋白家族分子均为跨膜糖蛋白，介导钙依赖的细胞间黏附。E-cad在上皮细胞分化和维持细胞极性中起关键作用，由于CDH1基因突变造成的E-cad表达异常，在胃癌等多种肿瘤形成中具有重要作用。因此CDH1基因是胃癌的一个重要的易感基因。但是以前由于检测方法的局限，关于CDH1基因的突变的系统报道很少，主要局限于遗传性弥漫型胃癌中几个特定突变点。在中国胃癌患者中，关于该基因突变的系统筛查与病例对照分析还未见报道。对于检出的错义突变与启动子区突变的的功能后果也未见报道。因此有必要开发一种方便快捷的突变检测以及突变后果的评估方法，以用于胃癌的遗传诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种CDH1基因突变体检测试剂盒及其应用。

本检测试剂盒主要包括以下成分：

(1)CDH1基因启动子区及第1到第16外显子区PCR扩增与测序引物19对，各对引物序列见表1；

(2)常规PCR扩增试剂，如dNTP、Taq DNA聚合酶等。

表1CDH1基因第1-16外显子以及启动子区的PCR扩增与测序引物序列

本试剂盒扩增出的PCR产物可以采用以下三种方式进行突变检测：一种方式是通过高分辨率溶解曲线法筛查基因微小突变；另一种方式是将PCR产物酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带进行分析。因此，上述试剂盒中还可以包括：限制性内切酶或者LC Green Plus⁺荧光染料。

所说的限制性内切酶是检测CDH1基因外显子13 c.2076T＞C突变的Nae I酶等。

在具有限制性内切酶的试剂盒中，还可以有琼脂糖凝胶。

本发明所说的试剂盒用于检测CDH1基因突变体。

本试剂盒的突变检测与功能评估步骤包括：

(1)提取样本外周血DNA。

(2)CDH1基因各外显子及其启动子区片段PCR扩增。：

对于CDH1基因1-16外显子以及启动子区按照表1设计引物进行PCR扩增。反应体系为基因组DNA(100ng/μl)1.0μl、dNTP Mixture(2.5mM each)0.8μl、10×PCR buffer(Mg²⁺free)1.0μl、MgCl₂(25mM)1.0μl、上游引物(10μM)0.2μl、下游引物(10μM)0.2μl、二甲基亚砜(DMSO)0.4μl、ddH₂O 5.32μl、Taq DNA聚合酶(5Unit/μl)0.08μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃(对应退火温度)复性30sec，72℃延伸40sec，40个循环；再72℃延伸7min，4℃保存。

(3)高分辨率溶解曲线法筛查基因微小突变：PCR扩增中混入LC Green染料，在LightScanner检测仪(美国Idaho公司)上进行熔解曲线扫描，利用Lightscanner软件分析曲线的形态差异，区分纯合子和杂合子。

或者是，限制性片段长度多态性分析：针对突变位点寻找特异的限制性内切酶，将PCR产物与内切酶反应体系混合，参照内切酶使用说明书在一定温度下反应一段时间，经琼脂糖凝胶电泳后，通过条带差异区分野生型、纯合突变或杂合突变。

本试剂盒具有高效的突变检测与后果评估作用。实施实例中报道，针对CDH1基因突变开展病例对照分析，涉及236例中国胃癌患者与240例正常对照的外周血DNA CDH1基因突变全面筛查。共检出15处CDH1基因突变，其中7处为新突变。并报道一些多态位点在中国人群中的等位基因频率。采用试剂盒的功能评估方法提出其中4种新突变对于胃癌形成可能具有病因学意义。本试剂盒在胃癌患者基因诊断与突变的病因学意义评估上具有重要作用。

附图说明

图1是CDH1基因Exon 14的HRM分析图：杂合子与纯合子曲线簇如图示。

图2是CDH1基因Exon 13RFLP后电泳图，图中右边第1泳道为Marker，野生型304bp，杂合型304+183+121bp，纯和突变型183+121bp。

图3是用本试剂盒检出的CDH1基因新突变测序图。(A)c.44_46del TGC.(B)+76G＞T.(C)c.604G＞A(V202I).(D)c.894C＞T(A298A).(E)c.1224G＞A(A408A).(F)c.1320+7A＞G.(G)c.1888C＞G(L630V).

图4是携带CDH1 c.44_46del_TGC突变的DNA片段序列。图中下划线处示CDH1 c.44_46delTGC。

图5是携带CDH1+76G＞T突变的DNA片段序列。图中下划线处示CDH1+76G＞T突变。

图6是携带CDH1 c.604G＞A(V202I)突变的DNA片段序列。图中下划线处示CDH1 c.604G＞A(V202I)突变。

图7是携带CDH1 c.894C＞T(A298A)突变的DNA片段序列。图中下划线处示CDH1 c.894C＞T(A298A)突变。

图8是携带CDH1 c.1224G＞A(A408A)突变的DNA片段序列。图中下划线处示CDH1c.1224G＞A(A408A)突变。

图9是携带CDH1 c.1320+7A＞G突变的DNA片段序列。图中下划线处示CDH1 c.1320+7A＞G突变。

图10是携带CDH1 c.1888C＞G(L630V)突变的DNA片段序列。图中下划线处示CDH1c.1888C＞G(L630V)突变。

图11是CDH1基因启动子区突变的双荧光素酶报告基因检测结果。

具体实施方式

实施例1：中国胃癌患者CDH1基因突变的系统筛查与病例对照分析

选择238例中国江苏、安徽及浙江地区胃癌患者，以及240例正常对照，抽取外周血，提取DNA。对于CDH1基因2-12、14-16外显子区域按照表1设计引物进行PCR扩增及高分辨率熔解曲线(HRM)分析。反应体系为：基因组DNA(100ng/μl)1.0μl、dNTP Mixture(2.5mM each)0.8μl、10×PCR buffer(Mg²⁺free)1.0μl、MgCl₂(25mM)1.0μl、上游引物(10μM)0.2μl、下游引物(10μM)0.2μl、二甲基亚砜(DMSO)0.4μl、ddH₂O 4.32μl、LC Green染料1.0μl、Taq DNA聚合酶(5Unit/μl)0.08μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃(相应退火温度)复性30sec，72℃延伸40sec，40个循环；再72℃延伸7min，4℃保存。HRM仪器LightScanner 96(美国Idaho公司)检测：打开Lightscanner软件，设置曝光时间80ms，扫描温度范围70-95℃进行扫描。扫描完成后使用Scanning程序进行熔解曲线分析，自动基因分型。杂合子的解链温度较纯合子低，其熔解曲线的下降段比纯合子的熔解曲线提前，不同类型的纯合子间也有差别。图1为CDH1基因外显子14的HRM分析图，杂合子与纯合子曲线簇如图示。对于CDH1基因第13外显子，按照表1设计引物进行PCR扩增与限制性片段长度多态性(RFLP)分析。反应体系为基因组DNA(100ng/μl)1.0μl、dNTP Mixture(2.5mM each)0.8μl、10×PCR buffer(Mg²⁺free)1.0μl、MgCl₂(25mM)1.0μl、上游引物(10μM)0.2μl、下游引物(10μM)0.2μl、二甲基亚砜(DMSO)0.4μl、ddH₂O 5.32μl、TaqDNA聚合酶(5Unit/μl)0.08μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃(对应退火温度)复性30sec，72℃延伸40sec，40个循环；再72℃延伸7min，4℃保存。RFLP分析：针对CDH1基因第13外显子突变位点c.2076T＞C寻找特异的限制性内切酶Nae I。该酶的识别位点为GCCGGC，当发生c.2076T＞C突变时(下划线示)，该内切酶发挥作用，而野生型的CDH1基因由于该位点为T，不能被该内切酶识别。具体操作：PCR产物5μl、Nae I内切酶0.125μl、10×NEBuffer 0.5μl，37℃反应1小时后，2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外下观察实验结果。PCR扩增片段全长304bp，电泳图上出现条带可能的几种情况：①野生型(TT)：304bp；②杂合突变型(TC)：304+183+121b；③纯合突变型(CC)：183+121bp(图2)。对于CDH1基因启动子与外显子1区域，由于该段可能的突变点较多，采取PCR扩增后直接测序检测。用HRM或RFLP法初步筛查为突变阳性的样本，采用BigDye Terminator V3.1试剂盒，在ABI 3130基因分析仪(美国ABI公司)上测序确认突变。结果共检出15处CDH1基因突变，含点突变与微小插入/缺失。其中7处为新发现的突变点。图3为本研究新检出的7种突变的测序图。这7种突变依次为(A)c.44_46del TGC；(B)+76G＞T；(C)c.604G＞A(V202I)；(D)c.894C＞T(A298A)；(E)c.1224G＞A(A408A)；(F)c.1320+7A＞G.；(G)c.1888C＞G(L630V)。图4-10是携带这7种CDH1新突变的DNA片段序列，分别对应SEQ ID NO：41-47。进一步，采用Mantel-Haenszelχ2等统计分析方法比较突变在患者与正常人中的携带率，报道了这些突变在中国人群的等位基因频率(表2)。尤其重要的是，其中位于外显子1处的3bp缺失为移码突变，只在2例胃癌患者中检出，未在正常对照中检出，为病理性突变。

表2CDH1基因突变检测与病例对照分析结果

^*新突变

^ξ基因型分布或等位基因频率的双侧卡方检验或费谢尔确切概率检验。

实施例2：检出的CDH1基因错义突变对蛋白功能影响的分析

采用SIFT分析(the Sorting Intolerant from Tolerant，http://sift.jcvi.org/)以及PolyPhen(＝Polymorphism Phenotyping，http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)，分析错义突变造成的单氨基酸改变对CDH1蛋白功能的影响。SIFT给定的评分阈值为0.5，即认为＜0.5者很可能影响蛋白质的功能，而≥0.5者则是可容忍的。PolyPhen工具通过计算突变前后编码氨基酸的PSIC评分差值，以判断突变对于蛋白质结构与功能的影响，当分差超过1.5时，认为是改变功能的突变。本研究SIFT分析显示检出的CDH1 c.1888C＞G(L630V)突变计分为0.02，而PolyPhen分差达1.748，因此该突变可能影响CDH1蛋白功能。而V202I与T340A只是良性改变(表3)。

表3SIFT与PolyPhen分析CDH1基因错义突变的后果

实施例3：检出的CDH1基因启动子区突变的功能后果分析

采用双荧光素酶报告基因法检测基因启动子区突变的功能后果。构建各种PGL3-CDH1启动子区突变型质粒，转染Hela细胞，根据表达产物的相对荧光素酶活性，评估各突变型基因的启动子活性强度。

(1)构建各种PGL3-CDH1启动子区突变型质粒：

根据CDH1基因启动子区的序列，设计带有双酶切位点的引物。PCR扩增包括离转录起始点-345 to+271bp的区域。上游引物为PF：5’-ATGC CTCGAGCCATCTCCAAAACGAACAAAC-3’(SEQ ID NO：39)，’ATGC’为保护序列，’CTCGAG’为XhoI内切酶的识别序列。下游引物为PR：5’-ATGCAAGCTTGAAGGGAAGCGGTGACGAC-3’(SEQ ID NO：40)，’ATGC’为保护序列，’AAGCTT’为HindIII内切酶的识别序列。反应体系为带有特定突变点的基因组DNA(100ng/μl)2.0μl、dNTP Mixture(2.5mM)3.0μl、10×PCR buffer(Mg²⁺free)2.0μl、MgCl₂(25mM)2.0μl、上游引物(10μM)1.0μl、下游引物(10μM)1.0μl、ddH₂O 8.8μl、Taq DNA聚合酶(5Unit/μl)0.2μl。反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸1min，40个循环，再72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳割胶纯化后与pMD-18T(TaKaRa大连)载体连接。上述连接产物转化入大肠杆菌进行克隆。随机挑取10个单克隆进行质粒抽提以及测序。经测序确定为目标质粒的阳性单克隆质粒进行XhoI/HindIII双酶切，同时pGL3-Basic(Promega北京)质粒进行双酶切。双酶切产物电泳，割胶纯化。再将目标序列与pGL3-Basic载体连接，从而构建各种PGL3-CDH1启动子区突变型质粒。

(2)双荧光素酶报告基因检测：Hela细胞在DMEM培养基37℃，5％CO₂下培养，2～3天传代一次。在对数期生长的细胞，用胰酶消化并计数，接种于12孔板中。接种密度为1×10⁵Hela细胞/孔。加无抗生素含10％FBS的DMEM培养基培养至70％-95％孔底面积。按照脂质体说明书将质粒转染至细胞，继续培养24h。取20μl细胞裂解液与50μl LAR II混合后，上机检测荧光值，测得的值即为萤火虫荧光素酶的值。再加入50μl Stop&Glo试剂，混合后测荧光值，测得的值即为海洋腔肠荧光素酶的活性。海洋腔肠荧光素酶的活性代表转染效率，因此各孔的萤火虫荧光素酶的值除以海洋腔肠荧光素酶的活性等于各孔的荧光素酶活性。以pGL3-Basic空载质粒的荧光素酶活性作为标准值1，野生型和突变型启动子的活性分别与其相比，即可得到各突变型基因的启动子活性强度。

经上述启动子区突变的检测，提出CDH1启动子区-164del T、-49G＞T突变增加报告基因表达，-160C＞A、c.48+6C＞T降低报告基因表达(图11)。

实施例4：检出的外显子-内含子交界处突变对RNA剪接的影响分析

利用ESEfinder(http://exon.cshl.edu/ESE/)和BDGP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice-instrucs.html)预测CDH1基因内含子、外显子交界区域错义突变对RNA剪接的影响。ESEfinder通过分析目前已知ESE与剪接调控蛋白SR protein的相互作用，从外显子序列中寻找对应的信息，预测序列中存在的潜在的ESE。BDGP则侧重评估突变对外显子剪接效率的影响。ESEfinder程序(http://rulai.cshl.edu/tools/ESE)显示CDH1 c.48+6T＞突变对剪接产生较大的影响，如序列上原来存在的SF2/ASF结合位点丢失，新增了SRp55的结合位点，另外还降低了SC35结合位点的结合能力。而BDGP显示了突变使剪接效率轻微上升。类似的，CDH1 c.1320+7A＞G突变也对剪接产生较大影响，如新增了SRp55的结合位点，且增加了SC35结合位点的结合能力。而BDGP显示了突变使剪接效率轻微下降(表4)。因此该这两种CDH1突变可能通过影响外显子剪接增强子角度，从而影响RNA正常剪接。

表4CDH1基因突变对于RNA剪切影响的分析