一种有效提高卷叶贝母总生物碱含量的培养方法

摘要

本发明公开了一种有效提高卷叶贝母总生物碱含量的培养方法，该方法采用前体饲喂技术，在卷叶贝母幼嫩再生鳞茎的液体培养过程中，通过添加氨基酸前体物来有效提高卷叶贝母培养物中的总生物碱含量。实验结果显示，培养25天后最终获得的卷叶贝母培养物其总生物碱含量最高可达0.212％，比未加氨基酸前体物的对照组高出52.5％。本发明不仅有效地提高了液体培养中卷叶贝母的总生物碱含量，而且也使得其生物量增殖倍数明显增加，较好地实现了川贝母药材有效组份快速生产的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高卷叶贝母总生物碱含量的培养方法，特别是涉及一种通过在液体培养基中添加特定氨基酸前体物来有效提高卷叶贝母总生物碱含量的培养方法。

背景技术

卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科多年生草本植物，其鳞茎为名贵的川产药材川贝母。中药材川贝母用于治疗肺热燥咳，阴虚劳嗽，肺虚久咳不愈等症，功效显著，每年的用量都在逐年增大，目前以川贝母为主药或包含川贝母的中成药有130多种。长期以来，川贝母药材主要依靠采挖野生药材为主，因过量采集和生境遭到破坏等因素，使其蕴藏量急剧下降，再加之人们对川贝母药材的需求量进一步增加，因而最终导致其价格不断攀升，药材市场的缺口越来越大。

为了快速获得川贝母药材，以满足川贝母药材市场的大量需求，人们开始采用生物技术方法来实现川贝母药材的快速生产。当前采用组织培养技术进行卷叶贝母的快速繁殖已获得成功，如王跃华等人已完成了卷叶贝母愈伤组织诱导和快速增殖、鳞茎再生、细胞团块悬浮培养和卷叶贝母组培苗快速培育等研究。通过对卷叶贝母总生物碱含量测定结果显示，组织培养生产的卷叶贝母总生物碱含量明显高于野生卷叶贝母鳞茎中的总生物碱含量。高山林等人对川贝母组培物的化学成分和药理作用进行了研究，检测结果显示，通过组织培养获得的鳞茎和商品鳞茎有一致的化学成分，都具有生物碱、有机酸、皂甙氨基酸等13种化学物质；通过药理实验结果显示，组培川贝与野生川贝同样具有镇咳祛痰作用，而且药物毒性均较低，比较安全。

目前在对卷叶贝母的生物技术研究中，还未见采用前体饲喂技术来显著提高液体培养中卷叶贝母的总生物碱含量的报道。前体饲喂是在药用植物组织培养中，通过加入次生代谢物合成的前体物质来提高细胞中次生代谢物的含量。这是因为植物细胞中的次生代谢物是通过植物体内一系列代谢过程产生的，在组织培养过程中将适宜的代谢中间产物添加入培养基中，能有效地促进次生代谢物的大量生成。生物碱在植物体内的合成大部分是由苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等α-氨基酸经过一系列生化反应而产生的。卷叶贝母的主要有效组分是生物碱类物质，因此通过在液体培养基中添加氨基酸前体来提高液体培养的卷叶贝母再生鳞茎的总生物碱含量在理论上是可行的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效提高卷叶贝母总生物碱含量的培养方法，该方法是通过在卷叶贝母再生鳞茎的液体培养过程中添加氨基酸前体物来有效提高卷叶贝母培养物中的总生物碱含量。

为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤：

(1)卷叶贝母再生鳞茎的获得：将诱导产生的已开始初步分化的紧密愈伤组织切成1.5～2.5cm的小块，转接到产生再生鳞茎的培养基MS+6-BA 1～2.0mg·L^-1+NAA0.1～0.3mg·L^-1+蔗糖20～60g·L^-1+琼脂5.5～7.0g·L^-1中进行培养，所采用的pH值为5.5～6.5，培养温度15～23℃、每天光照8～16小时、光照强度为1000～1800lx；经40d左右培养后，可获得大量生长良好的再生鳞茎；

(2)卷叶贝母再生鳞茎的液体培养：切取(1)步骤获得的直径为3～6mm、未抽芽的卷叶贝母再生鳞茎，转接到加有氨基酸前体物的液体培养基MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA0.2～1.0mg·L^-1+蔗糖20～60g·L^-1中进行培养，pH 5.5～6.5，接种量为30～50g·L^-1，培养温度15～23℃、每天光照8～16小时、光照强度为1000～1800lx、摇床转速110～130r·min^-1，培养24～28d后，即获得总生物碱含量高的再生鳞茎，上述氨基酸前体物为苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸中的任意一种，加入量为0.25～1.00mmol·L^-1。

将上述培养的再生鳞茎从液体培养基中滤出，用干燥滤纸拭干表面水分后，称取重量，即为鲜重；其生物量增殖倍数＝(收获量鲜重-接种量鲜重)/接种量鲜重。

将上述培养的再生鳞茎从液体培养基中滤出，用干燥滤纸拭干表面水分后，置于60℃的烘箱中烘干至恒重，用分光光度法在412nm处测定吸光度，可计算出培养物中总生物碱含量。

本发明采用前体饲喂技术，在卷叶贝母再生鳞茎的液体培养中，通过向培养液中添加苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸等生物碱类物质的代谢中间产物来有效提高卷叶贝母培养物中的总生物碱含量；另外所添加的氨基酸类物质还可以参与细胞内的蛋白质合成以及充当碳源和氮源，特别是色氨酸可以在氨基转换酶和脱羧酶的作用下转变成吲哚乙酸(又称植物生长素)，从而对植物细胞的生长产生促进作用。本发明中卷叶贝母再生鳞茎液体培养的生长周期为24～28天，培养25天后再生鳞茎的总生物碱含量最高可为0.212％，比未添加氨基酸前体对照组的总生物碱含量0.139％提高了52.5％。

本发明采用再生鳞茎作为外植物体进行悬浮培养，可克服常规悬浮培养中采用愈伤组织作为外植物体进行培养存在的在多次继代培养后易导致愈伤组织变异和再生能力丧失的问题；而且采用再生鳞茎作为外植物体有效地保留了卷叶贝母器官的完整性和次生代谢产物的生产体系，从而有利于在提高培养物生物量的前提下保证有效成分含量。因此用本发明方法能够快速提高卷叶贝母再生鳞茎液体培养总生物碱含量，较好地解决了名贵中药材川贝母在生产中存在的生长周期长，药材产量和有效成分含量低等问题，从而可实现利用发酵工程技术大规模生产名贵中药材川贝母的目的。

具体实施方式

实施例1

(1)卷叶贝母再生鳞茎的获得：将诱导产生的已开始初步分化的紧密愈伤组织切成1.5cm的小块，转接到产生鳞茎的培养基MS+6-BA1mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1+蔗糖40g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1中进行培养，所采用的pH值为6.0，培养温度15～23℃、每天光照8～16小时、光照强度为1000～1800lx；经40d左右培养后，可获得大量生长良好的再生鳞茎；

(2)卷叶贝母再生鳞茎的液体培养：切取(1)步骤获得的直径为3～6mm、未抽芽的卷叶贝母幼嫩再生鳞茎，转接到加有色氨酸的液体培养基MS+6-BA 2.0mg·L^-1+NAA 0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1中进行培养，pH值6.5，接种量为50g·L^-1，培养温度15～23℃、每天光照8～16小时、光照强度为1000～1800lx、摇床转速110～130r·min^-1，所述色氨酸按0.50mmol·L^-1加入，即每升培养基中加入0.50mmol色氨酸；

(3)培养物总生物碱含量的测定：将培养25天后的卷叶贝母再生鳞茎从液体培养基中滤出，用干燥滤纸拭干表面水分后，置于60℃的烘箱中烘干至恒重，用分光光度法在412nm处测定吸光度，并计算出培养物中的总生物碱含量为0.212％，比未添加任何氨基酸前体的对照组总生物碱含量0.139％高出了52.5％。其生物量增殖倍数为2.45，比未添加任何氨基酸前体的对照组生物量增殖倍数2.26高出了8.4％。说明在卷叶贝母液体培养基中添加适当的氨基酸前体不仅能够显著提高卷叶贝母再生鳞茎的总生物碱含量，而且还能对其生物量增殖倍数产生一定程度的促进作用。

实施例2

该实施例(2)步骤中所添加的氨基酸前体物为色氨酸，加入量为1.00mmol·L^-1，其它步骤同实施例1，培养25天后测得培养物中的总生物碱含量为0.140％，明显低于实施例1中卷叶贝母再生鳞茎的总生物碱含量0.212％，说明在卷叶贝母液体培养基中氨基酸前体物的加入存在一个最佳添加浓度，添加不同前体物浓度对卷叶贝母再生鳞茎的总生物碱含量有明显的影响。

实施例3

该实施例(2)步骤中所添加的氨基酸前体物为苯丙氨酸，加入量为0.25mmol·L^-1，其它步骤同实施例1，在培养25天后测得培养物中的总生物碱含量为0.173％，比未添加任何氨基酸前体的对照组总生物碱含量0.139％高出了22.4％。

实施例4

该实施例(1)步骤中产生鳞茎的培养基为MS+6-BA 1.5mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+蔗糖40g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1，(2)步骤中所添加的氨基酸前体物为酪氨酸，加入量为0.75mmol·L^-1，液体培养基为MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA 0.7mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1，其它同实施例1，在培养25天后测得培养物中的总生物碱含量为0.170％，比未添加任何氨基酸前体的对照组总生物碱含量0.139％高出了22.3％。

三种氨基酸前体物中，色氨酸最有助于提高卷叶贝母的总生物碱含量。