一种高含量倍半萜类雷公藤生物碱的制备方法

摘要

本发明公开了一种半制备色谱法分离制备高纯度倍半萜类雷公藤生物碱单体的方法。以脱除雷公藤甲素和雷公藤乙素后的雷公藤醋酸乙酯浸膏废液为原料，先经氯代烷烃萃取及以低级醇为溶剂的重结晶过程，随后采用反相高效液相半制备色谱法制备高含量的倍半萜类雷公藤生物碱单体，采用紫外在线检测，收集目标物，冷冻干燥后，获得4种含量大于99.0％的倍半萜类雷公藤生物碱单体(雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱)。采用本发明公开的制备方法，分离所得的产品纯度高、过程短、成本低，易于产业化。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高含量的倍半萜类雷公藤生物碱单体的制备方法。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)系卫矛科雷公藤属植物，以根、叶、花及果入药，，对治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、慢性肾炎、红斑狼疮、接触性皮炎等均有显著疗效。据《中国药植志》记载，雷公藤碱、雷公藤定碱及二萜内酯、卫矛醇均有明显的抗肿瘤活性，对小鼠白血病及人类鼻咽癌均有抑制作用，能使周围小动脉舒张增加血流量，减低外围血流的阻力，改善微循环的阻碍，有活血作用。对多种变态性反应与非细菌性炎症有激素样抗炎作用。

雷公藤化学成分复杂，药理作用广泛，有重要的临床应用价值。但由于雷公藤毒副作用大，限制了临床应用的推广。应进一步加强对雷公藤药物化学、药理作用和临床应用的研究，提取、纯化出高效的雷公藤活性成分，为雷公藤中药饮片的质量监控及雷公藤中药材的进一步开发利用研究奠定基础。

雷公藤生物碱是雷公藤的主要活性成分之一，一直是人们研究的主要对象，特别是其中的含量相对较高的雷公藤生物碱，如：雷公藤春碱(wilfortrine)、雷公藤定碱(wilfordine)、雷公藤吉碱(wilforgine)和雷公藤次碱(wilforine)等。目前雷公藤生物碱单体的制备主要采用液/液萃取法结合柱层析色谱法(林绥，李援朝，樱井信子，郭舜民，邓福孝.雷公藤倍半萜生物碱的研究，植物学报，2001，43(6)：647-649；陈俊元，夏志林，邓福孝.雷公藤生物碱提取工艺的改进，中国医药工业杂志，1989，20(11)：484-485)和高速逆流色谱法(High-speed countercurrent chromatography，HSCCC)(CN100422188C)等，主要采用雷公藤根茎为原料，获得的雷公藤生物碱单体含量一般在95％左右或更低一些，其纯度难以满足雷公藤生物碱单体医药用对照品的要求，也不利于雷公藤倍半萜类生物碱药理的进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于针对现有雷公藤生物碱单体制备技术的不足，提供一种高含量的雷公藤生物碱单体的半制备色谱分离纯化方法。

高含量倍半萜类雷公藤生物碱单体的制备方法的具体步骤如下：

1)将脱除雷公藤甲素和雷公藤乙素后的雷公藤醋酸乙酯浸膏废液，用5～15g/L的易挥发性有机酸，或5～20g/L的易挥发性碱调节溶液pH值至6-10.5，进行重结晶，重结晶的溶剂为低级醇，重结晶的温度为0～40℃，得到雷公藤粗总生物碱；

2)将雷公藤粗总生物碱，用体积比为55∶45～99∶1的乙腈和水混合溶剂溶解后，使用体积比为55∶45～99∶1的乙腈和水混合溶剂为流动相，以0.2～2.0mL/min的流速，在0～40℃温度范围内，在C18反相半制备色谱柱上实现雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的分离，通过紫外在线检测，得到雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱。

所述的雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱为倍半萜类生物碱，倍半萜类生物碱的分子结构式：

Ac＝acetate，Bz＝benzoyl，Fur＝furanoyl。

所述的C18色谱柱为普通C18柱。所述的C18色谱柱优选为Hypersil C18色谱柱。

所述的低级醇为甲醇、乙醇或异丙醇。所述的低级醇优选为甲醇。所述的乙腈和水的比例为75∶25，所述的流动相流速为1.0mL/min，所述的柱温为30℃。所述的易挥发性有机酸为醋酸、盐酸或甲酸。所述的易挥发性有机酸优选为醋酸，醋酸浓度为10g/L。所述的易挥发性碱为氨水，氨水的浓度为10g/L。

本发明所用的原料为脱除雷公藤甲素和雷公藤乙素的雷公藤醋酸乙酯浸膏废液，原料价格成本低，属废物利用。所用各种化学试剂通用、易购。色谱分离及收集可实现自动化，操作简便，获得的雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱产品含量高(＞99.0％)，适用于各种型号的半制备色谱仪。

下面结合实施例及附图对本发明做进一步的说明，但不限于本实施例的范围。

附图说明

图1为实施例1的雷公藤生物碱半制备色谱流出紫外色谱图；流动相为乙腈/水＝(60∶40，v/v)的HPLC图；图中，峰1、2、3、4分别为雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱；

图2为实施例3的雷公藤生物碱半制备色谱流出紫外色谱图；流动相为乙腈/水＝(75∶25，v/v)的HPLC图；图中，峰1、2、3、4分别为雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱；

图3(a)为由实施例3得到的以直接进样方式获得的雷公藤生物碱在大气压化学电离源(APCI)正离子模式下雷公藤春碱的一级质谱图；

图3(b)为由实施例3得到的以直接进样方式获得的雷公藤生物碱在大气压化学电离源(APCI)正离子模式下雷公藤定碱的一级质谱图；

图3(c)为由实施例3得到的以直接进样方式获得的雷公藤生物碱在大气压化学电离源(APCI)正离子模式下雷公藤吉碱的一级质谱图；

图3(d)为由实施例3得到的以直接进样方式获得的雷公藤生物碱在大气压化学电离源(APCI)正离子模式下雷公藤次碱的一级质谱图。

具体实施方式

实施例1：

取5.0g的己脱除雷公藤甲素和雷公藤乙素的雷公藤醋酸乙酯浸膏废液，挥干溶剂后，称取2.0g于烧杯中，每次用10mL氯仿萃取，重复3次，合并氯仿层，挥干后得到氯仿浸膏；然后氯仿浸膏用10g/L的醋酸提取3次，合并醋酸提取液，再用10g/L氨水调节pH至10，过滤后沉淀物用去离子水洗涤5次，烘干，得到粗总生物碱，然后加入30.0mL的甲醇溶解，在室温下进行重结晶，用重结晶得到的原料进行色谱分离。

将重结晶得到的雷公藤粗总生物碱，用体积比为60∶40的乙腈和水混合溶剂溶解后，使用体积比为60∶40的乙腈和水混合物为流动相，以1.0mL/min的流速，在30℃温度时，在Hypersil C18反相半制备柱上进行分离，采用在线紫外检测，检测波长为230nm，分别收集各色谱峰对应的化合物，真空干燥后得雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱4种倍半萜类雷公藤生物碱。

实施例2：

取5.0g的己脱除雷公藤甲素和雷公藤乙素的雷公藤醋酸乙酯浸膏废液，挥干溶剂后，称取2.0g于烧杯中，每次用10mL氯仿萃取，重复3次，合并氯仿层，挥干后得到氯仿浸膏；然后氯仿浸膏用10g/L的甲酸提取3次，合并甲酸提取液，再用15g/L甲酸氨水调节pH至6，过滤后沉淀物用去离子水洗涤5次，烘干，得到粗总生物碱，然后加入20.0mL的异丙醇溶解，在室温下进行重结晶，用重结晶得到的原料进行色谱分离。

将重结晶得到的雷公藤粗总生物碱，用体积比为99∶1的乙腈和水混合溶剂溶解后，使用体积比为99∶1的乙腈和水混合物为流动相，以0.2mL/min的流速，在40℃温度时，在Hypersil C18反相半制备柱上进行分离，采用在线紫外检测，检测波长为230nm，分别收集各色谱峰对应的化合物，真空干燥后得雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱4种倍半萜类雷公藤生物碱。

实施例3：

取10.0g的己脱除雷公藤甲素和雷公藤乙素的雷公藤醋酸乙酯浸膏废液，挥干溶剂后，称取2.0g于烧杯中，每次用10mL氯仿萃取，重复3次，合并氯仿层，挥干后得到氯仿浸膏；然后氯仿浸膏用10g/L的醋酸提取3次，合并醋酸提取液，再用8g/L氨水调节pH至10，过滤后沉淀物用去离子水洗涤5次，烘干，得到粗总生物碱，然后加入10.0～50.0mL的甲醇溶解，在室温下进行重结晶，用重结晶得到的原料进行色谱分离。

将重结晶得到的雷公藤粗总生物碱，用体积比为75∶25的乙腈和水混合溶剂溶解后，使用体积比为75∶25的乙腈和水混合物为流动相，以1.0mL/min的流速，在25℃温度时，在Hypersil C18反相半制备柱上进行分离，采用在线紫外检测，检测波长为230nm，分别收集各色谱峰对应的化合物，真空干燥后得雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱4种倍半萜类雷公藤生物碱。

实施例4：

取5.0g的己脱除雷公藤甲素和雷公藤乙素的雷公藤醋酸乙酯浸膏废液，挥干溶剂后，称取2.0g于烧杯中，每次用10mL氯仿萃取，重复3次，合并氯仿层，挥干后得到氯仿浸膏；然后氯仿浸膏用10g/L的盐酸提取3次，合并盐酸提取液，再用5g/L盐酸调节pH至6，过滤后沉淀物用去离子水洗涤5次，烘干，得到粗总生物碱，然后加入20.0mL的乙醇溶解，在室温下进行重结晶，用重结晶得到的原料进行色谱分离。

将重结晶得到的雷公藤粗总生物碱，用体积比为55∶45的乙腈和水混合溶剂溶解后，使用体积比为55∶45的乙腈和水混合物为流动相，以2.0mL/min的流速，在0℃温度时，在Hypersil C18反相半制备柱上进行分离，采用在线紫外检测，检测波长为230nm，分别收集各色谱峰对应的化合物，真空干燥后得雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱4种倍半萜类雷公藤生物碱。

实施例5：

取10.0g的己脱除雷公藤甲素和雷公藤乙素的雷公藤醋酸乙酯浸膏废液，挥干溶剂后，称取2.0g于烧杯中，每次用10mL氯仿萃取，重复3次，合并氯仿层，挥干后得到氯仿浸膏；然后氯仿浸膏用15g/L的醋酸提取3次，合并醋酸提取液，再用12g/L氨水调节pH至10.5，过滤后沉淀物用去离子水洗涤5次，烘干，得到粗总生物碱，然后加入一定量的甲醇溶解，在室温下进行重结晶，用重结晶得到的原料进行色谱分离。

将重结晶得到的雷公藤粗总生物碱，用体积比为75∶25的乙腈和水混合溶剂溶解后，使用体积比为75∶25的乙腈和水混合物为流动相，以1.0mL/min的流速，在30℃温度时，在Hypersil C18反相半制备柱上进行分离，采用在线紫外检测，检测波长为230nm，分别收集各色谱峰对应的化合物，真空干燥后得雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱4种倍半萜类雷公藤生物碱。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都归入本发明的保护范围。

实施例6：

取5.0g的己脱除雷公藤甲素和雷公藤乙素的雷公藤醋酸乙酯浸膏废液，挥干溶剂后，称取2.0g于烧杯中，每次用10mL氯仿萃取，重复3次，合并氯仿层，挥干后得到氯仿浸膏；然后氯仿浸膏用10g/L的甲酸提取3次，合并甲酸提取液，再用20g/L氨水调节pH至10，过滤后沉淀物用去离子水洗涤5次，烘干，得到粗总生物碱，然后加入20.0mL的乙醇溶解，在室温下进行重结晶，用重结晶得到的原料进行色谱分离。

将重结晶得到的雷公藤粗总生物碱，用体积比为55∶45的乙腈和水混合溶剂溶解后，使用体积比为55∶45的乙腈和水混合物为流动相，以0.2mL/min的流速，在30℃温度时，在Hypersil C18反相半制备柱上进行分离，采用在线紫外检测，检测波长为230nm，分别收集各色谱峰对应的化合物，真空干燥后得雷公藤春碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱和雷公藤次碱4种倍半萜类雷公藤生物碱。