丝孢酵母(Trichosporon sp )21148三磷酸甘油酯激酶启动子序列及其克隆方法

摘要

本发明涉及一种基因序列及其克隆方法。丝孢酵母Trichosporon sp 21148三磷酸甘油酯激酶基因启动子序列的克隆，其特征在于：选择18种不同来源的三磷酸甘油酯激酶，将其氨基酸序列利用生物信息学软件进行分析比对，选取两个比较保守的结构域RVDFNVP和NADAFGT，利用密码子表反推出其对应的简并引物，得到简并度大大降低的目标引物BPGK1和BPGK2；以丝孢酵母Trichosporon sp 21148基因组DNA为模板，用简并引物扩增到了丝孢酵母Trichosporon sp 21148三磷酸甘油酯激酶基因的部分DNA序列，在此基础上通过染色体步移的方法获得了它的上游启动子序列。本发明克隆了丝孢酵母的强启动子，为进行丝孢酵母的载体构建及转基因工程操作提供启动元件。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因序列及其克隆方法。

背景技术

丝孢酵母Trichosporon sp 21148在自然界分布较为广泛，其中有若干种能引起发酵和冷藏食品的变质，有些种又与污水处理有关，还有一些丝孢酵母Trichosporon sp21148能够将外界的碳水化合物通过自身的代谢转变为油脂进行储存且油脂含量较高，如发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans 20243和皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum 20119，其油脂含量可高达菌体干重的45％，因此可以作为一种新的油脂资源进行开发。目前为止，很多研究仅仅局限在丝孢酵母生理学特征和发酵特性等方面，而对其进行分子生物学和基因工程方面的研究较少。目前国内外尚无关于发酵性丝孢酵母强启动子DNA序列的克隆和表达载体构建的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供丝孢酵母(Trichosporon sp) 21148三磷酸甘油酯激酶启动子序列及其克隆方法，克隆丝孢酵母的强启动子，为进行丝孢酵母的载体构建及转基因工程操作提供启动元件。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：丝孢酵母(Trichosporon sp)21148三磷酸甘油酯激酶启动子序列，其特征在于它的序列如下：

ATACGACTCACGGCCCGGGCTGGTCTACTCTGGCTTCTCTATAATGTATTTTTTGCTTTAGAATTTGAAAGGGTTCAAATAAAGTTGGTGTCAAATATTTAGTGCAGATCAAATTTATATGGTTTCTAGGAAAGACTAGACTATTACCTCAAAGGTCCTATCCTAGATTGACACCCTAGAACTAGTCTCCTCTGAAAACGGTCTAGCAAAATCGCGAACAAGATTTTTAATTGCACCATGAGACGATCATGAAAAATTGTATGATCTGAAGCACAAGGTACACTTTGATGGTTAAATGAGCTGGAATTGTTAGGTGATTGGGTATGTACAACGTGTCTGAGGCTACATTCTATCCCAGTCGTAGTCAGCCTGGTGCTCTTAATTCCTTGTACTACACTCTGAGCTGTACTTCTCTGATTGTAAATGCTCGTGGTGAGCCTTTCTATCATGAGCTAGCATTGACACATAATAAATCATCACTCTTAAACCAGATCCTTCTGTAGTCTTCCATAATCTTCCATAATCCTCTATAATCCACTCTATTACTCTAATTATCACTCCCAGTTTACCCTTCTTACAAAATTTGCATCCCACCGTTGACTCGTCCGTTGATGTCGTTGACGTTCGTGGGCCCGGCACACACGCTCACACGGTGCAACATCACGCTACTCCCTCGAGCTGGTGATGGAACAAGCCCAGTGGGGAGTGCTATCCCCCTGTTGCTTCAACCTTCTTTACTACCACATCAACAATACTTTATTAAACAAAGTAAGCACAGTGAACACTCAATTGACATCTCAATAGCTTCTTTATCAAGCAAATTATCAGTCACTGACTTGAACGTTGAAAACAAACGTGTCTTTATCCGTGTT

其中：是启动子中的TATA box，CAAT box；是AGAG-box和TGTG启动子中的顺式作用元件；代表可能的转录起始位点；指的是起始密码子；粗斜体部分代表启动子扩增所需引物148PP1，148PP2部分；“_”指染色体步移所需引物AP2和GSP2部分；斜体部分指的是染色体步移所得片段测序结果与简并引物扩增所得序列测序结果一致的序列。

上述丝孢酵母(Trichosporon sp)21148三磷酸甘油酯激酶启动子序列的克隆方法，其特征在于：

选择18种不同来源的三磷酸甘油酯激酶，将其氨基酸序列利用生物信息学软件进行分析比对，选取两个比较保守的结构域RVDFNVP和NADAFGT，利用密码子表反推出其对应的简并引物，得到简并度大大降低的目标引物BPGK1和BPGK2；以丝孢酵母(Trichosporonsp)21148基因组DNA为模板，用简并引物扩增到了丝孢酵母(Trichosporon sp)21148三磷酸甘油酯激酶的部分DNA序列，在此基础上通过染色体步移的方法获得了它的上游启动子序列；染色体步移得到的序列亚克隆到载体pMD18-T上，测序结果表明，该序列有1.3kb，其3’端核苷酸序列与已知丝孢酵母(Trichosporon sp)21148三磷酸甘油酯激酶基因DNA 5’端的核苷酸序列相同，起始密码子的上游有930bp的碱基序列；通过启动子在线分析软件分析发现，该序列包含真核生物启动子特征序列，如类似TATA-box和CAAT-box的结构，以及调节启动子转录活性的AGAG-box和具有增强子作用的TGTG顺式作用元件，并且富含GT的重复序列；丝孢酵母Trichosporon sp21148三磷酸甘油酯激酶启动子的序列如下：ATACGACTCACGGCCCGGGCTGGTCTACTCTGGCTTCTCTATAATGTATTTTTTGCTTTAGAATTTGAAAGGGTTCAAATAAAGTTGGTGTCAAATATTTAGTGCAGATCAAATTTATATGGTTTCTAGGAAAGACTAGACTATTACCTCAAAGGTCCTATCCTAGATTGACACCCTAGAACTAGTCTCCTCTGAAAACGGTCTAGCAAAATCGCGAACAAGATTTTTAATTGCACCATGAGACGATCATGAAAAATTGTATGATCTGAAGCACAAGGTACACTTTGATGGTTAAATGAGCTGGAATTGTTAGGTGATTGGGTATGTACAACGTGTCTGAGGCTACATTCTATCCCAGTCGTAGTCAGCCTGGTGCTCTTAATTCCTTGTACTACACTCTGAGCTGTACTTCTCTGATTGTAAATGCTCGTGGTGAGCCTTTCTATCATGAGCTAGCATTGACACATAATAAATCATCACTCTTAAACCAGATCCTTCTGTAGTCTTCCATAATCTTCCATAATCCTCTATAATCCACTCTATTACTCTAATTATCACTCCCAGTTTACCCTTCTTACAAAATTTGCATCCCACCGTTGACTCGTCCGTTGATGTCGTTGACGTTCGTGGGCCCGGCACACACGCTCACACGGTGCAACATCACGCTACTCCCTCGAGCTGGTGATGGAACAAGCCCAGTGGGGAGTGCTATCCCCCTGTTGCTTCAACCTTCTTTACTACCACATCAACAATACTTTATTAAACAAAGTAAGCACAGTGAACACTCAATTGACATCTCAATAGCTTCTTTATCAAGCAAATTATCAGTCACTGACTTGAACGTTGAAAACAAACGTGTCTTTATCCGTGTT

其中：是启动子中的TATA box，CAAT box；是AGAG-box和TGTG启动子中的顺式作用元件；代表可能的转录起始位点；指的是起始密码子；粗斜体部分代表启动子扩增所需引物148PP1，148PP2部分；“_”指染色体步移所需引物AP2和GSP2部分；斜体部分指的是染色体步移所得片段测序结果与简并引物扩增所得序列测序结果一致的序列。

本发明的有益效果是：本发明提供了丝孢酵母(Trichosporon sp)21148三磷酸甘油酯激酶启动子序列及其克隆方法，克隆丝孢酵母(Trichosporon sp)强的启动子作为外源基因在丝孢酵母Trichosporon中表达时的启动元件，进而构建丝孢酵母Trichosporon整合型表达载体，建立一种新的转化系统，为以后进行丝孢酵母Trichosporon基因工程研究的深入开展奠定一定的基础。

丝孢酵母(Trichosporon sp)21148当中的强启动子主要有酵母三磷酸甘油酯激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)，三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)，乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase，ADH)，本发明利用ClustalX等分子生物学软件，通过比较18种不同来源的三磷酸甘油酯激酶的氨基酸序列，找出了它的保守氨基酸序列并反推出其密码子，进而设计了它的简并引物；以丝孢酵母(Trichosporonsp)21148基因组DNA为模板用简并引物扩增到了丝孢酵母(Trichosporon sp)21148三磷酸甘油酯激酶的部分DNA序列，在此基础上通过染色体步移的方法获得了它的上游启动子序列。以克隆得到的PGK基因启动子为载体的启动元件，潮霉素基因为目的基因，构建了发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)20243整合型表达载体，并转化发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)20243，用潮霉素抗性平板进行筛选，来验证启动子的基本功能，为进一步研究外源基因在发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)20243中的表达奠定了一定的理论基础。

丝孢酵母目前大多数研究只集中在其发酵特性和生理学特征上进行研究，对其进行基因工程改造的研究尚未见报，因此本发明旨在克隆一种丝孢酵母的强启动子(PGK启动子)作为构建丝孢酵母载体时的启动元件，为进行丝孢酵母转基因操作提供理论基础和实验材料。

附图说明

图1是染色体步移示意图。

图2-1和图2-2是三磷酸甘油酯激酶同源比对结果分析(因一张A4纸放不了，分成二部分)，注：图2-1和图2-2中“*”所对的列氨基酸相同，“∶”表示氨基酸相同性比例非常高，“.”表示氨基酸相同性比例较高，连续六个及以上的“*”可以看作为蛋白质的保守性序列。

图3是三磷酸甘油酯激酶部分DNA基因序列，注：图3中M为DNAMakerDL2000，1代表简并引物扩增得到的部分PGK基因DNA序列。

图4是简并引物扩增所得PGK基因部分DNA序列，注：图4中粗斜体代表简并引物所在位置，下划线部分代表引物GSP2和GSP1所在的位置。

图5丝孢酵母Trichosporon sp三磷酸甘油酯激酶启动子的序列，注：图5中：是启动子中的TATAbox，CAATbox；是AGAG-box和TGTG启动子中的顺式作用元件；代表可能的转录起始位点；指的是起始密码子；粗斜体部分代表启动子扩增所需引物148PP1，148PP2部分；“_”指染色体步移所需引物AP2和GSP2部分；斜体部分指的是染色体步移所得片段测序结果与简并引物扩增所得序列测序结果一致的序列。

图6发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans 20243表达载体构建流程图，注：Lac Z为半乳糖苷酶基因；HYG为潮霉素基因；P为启动子；Terminator为酵母终止子；Amp为氨苄青霉素基因；Ori为大肠杆菌复制起始点。

图7A、图7B是发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans 20243转化前后的生长情况图；注：图7A中左图为载体pTF-rPH转化发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans 20243后平板生长情况，图7A中右图为未转化的对照菌株平板生长情况，两个图均为潮霉素(80mg/ml)平板；图7B中左图为未添加潮霉素的YPD平板，图7B中右图为潮霉素(80mg/ml)的YPD平板，其中1，2和3代表阳性重组发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans 20243转化子生长情况，-ck为对照菌株。

图8重组发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans 20243 PCR鉴定图，注：M代表DNA makerDL2000，1代表以载体pHBM114为模板PCR扩增潮霉素基因，大小位1.0kb；2-6代表以重组发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans 20243总DNA为模板扩增所得片段，其中大小为1.0kb，和已知潮霉素基因大小相符合，因此为阳性转化子。

具体实施方式

一.实验材料

1.酶和试剂

限制性内切酶CopI和NotI、T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Ex-Taq DNA聚合酶、GenomeWalker Universal kit试剂盒，4种dNTP等均购自TaKaRa公司；PCR产物纯化试剂盒购自道普生物科技，DNA凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒等购自新长江公司，其他常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

2.培养基

LB液体培养基、LB固体培养基用于大肠杆菌XL10-Gold的培养，抗生素浓度为100ug/mL氨苄青霉素，用来筛选大肠杆菌阳性转化子。YPD液体培养基、YPD固体培养基用于丝孢酵母的生长，抗生素浓度为80ug/mL的潮霉素，用来筛选发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)20243阳性转化子。大肠杆菌于37℃培养，丝孢酵母于28-30℃度培养。

LB固体培养基(质量百分数)：1.0％(质量)胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％氯化钠，pH 7.0，(105℃)灭菌30min，1.8％琼脂(固)；其余为蒸馏水。

LB液体培养基(质量百分数)：1.0％(质量)胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％氯化钠，pH 7.0，(105℃)灭菌30min；其余为蒸馏水。

YPD液体培养基(质量百分数)：1.0％(质量)酵母提取物，2.0％胰蛋白胨，2.0％葡萄糖，(105℃)灭菌30min；其余为蒸馏水。

YPD固体培养基(质量百分数)：1.0％(质量)酵母提取物，2.0％胰蛋白胨，2.0％葡萄糖，(105℃)灭菌30min，1.8％琼脂(固)；其余为蒸馏水。

3.所需引物

表1载体构建过程中所需要的引物

4.菌株和质粒

表2实验所需菌株和质粒

二、实验方法

1.酵母总DNA的提取

详见酵母总DNA提取试剂盒购自OMEGA的E.Z.N.A.Yeast DNA Kit说明书。

2.简并引物克隆PGK基因部分DNA序列

三磷酸甘油酯激酶的蛋白质序列中存在着三个保守序列，即①IRVDFNVP；②NDAFGTAHRAHSSM；③STGGGASLELLEGK，选取两个比较保守的结构域RVDFNVP和NADAFGT设计引物进行简并扩增。PCR反应条件及体系如下表3和表4所示。

表3，PCR反应体系

表4，PCR反应条件

PCR产物凝胶回收纯化(见道普试剂盒说明书)后，与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌。PCR鉴定阳性转化子送交Invitrogen公司进行测序，回收质粒。

3.染色体步移法扩增21148三磷酸甘油酯激酶PGK基因的启动子序列：

根据质粒测序结果设计两条特异性引物GPS1和GPS2，配合GenomeWalker Universal kit试剂盒中的AP1和AP2两条引物组合成两对引物进行扩增，GenomeWalker基本原理如图1。

(1)抽提并纯化目标物种的基因组DNA，见OMEGA酵母DNA提取试剂盒说明书。

(2)分别用4种平头酶(如EcoRV、PvuII、DraI、StuI)消化基因组DNA并纯化。

(3)给4种消化好的基因组DNA加上接头Adaptor，构建成Genome walking文库。

(4)以适当稀释的Genome walking文库DNA为模板，用引物AP1和GSP1进行首轮PCR。

(5)再以适当稀释的首轮PCR产物为模板，用引物AP2和GSP2进行次轮的巢式PCR。

(6)琼脂糖电泳回收适当大小的特异性巢式PCR产物，测序验证。

除两轮PCR反应退火温度分别为56℃和60℃外，具体操作同GenomeWalker Universal kit说明书所示。

4.发酵性丝孢酵母表达载体的构建：

1.)rDNA中酶切位点引入：

rDNA片段中间引入Cop I和Not I酶切位点分两步进行，第一步是片段rDNA1，rDNA2片段的获得，引物分别TFrDNA1/CN24311和TFrDNA2/CN2432，模板为21148总DNA，退火温度45℃；第二步为cnrDNA片段的克隆，以第一步的PCR产物rDNA1和rDNA2片段各0.5uL为混合模板，引物为TFrDNA1/TFrDNA2，退火温度45℃，PCR产物纯化试剂盒回收cnrDNA片段并连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌，鉴定阳性转化子后回收质粒，命名为pTF-cnrDNA；

载体pTF-cnrDNA用CopI和NotI双酶切后胶回收置于-20℃冰箱备用；反应体系为：Not I和Cop I分别1uL，10×H Buffer，0.1％TritonX-100和0.1％BSA各2uL，载体12uL，共20uL体系，反应条件为：25℃1 h，37℃ 2h；

2.)表达单元的构建：

①扩增启动子和终止子：PPGK片段的扩增所需模板为载体pTS-PP，引物为AP2/148PP2，退火温度为45℃；终止子Te片段的扩增所需模板为载体pPIC9K，引物为T1/T2，退火温度为45℃；

②启动子与终止子片段相连并引入CopI和NotI酶切位点：以PPGK片段0.5uL，Te片段0.5uL为混合模板，148PP2/T2为引物，用退火温度45℃来扩增启动子和终止子单元PPT，PCR产物纯化试剂盒回收片段PPT并连接到pMD18-T载体，载体命名为pTS-PPT，CopI和NotI双酶切后保存；

③潮霉素磷酸转移酶基因表达单元的连接：以载体pHBM114为模板，PHYG1/PHYG2为引物，在退火温度46℃时PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因HYG，产物回收后用T4 DNA聚合酶消化，反应体系为0.1％BSA 5uL，10×Buffer 5uL，dTTP 5uL(10mmol)，T4 DNA聚合酶0.8uL，PCR产物35uL，12℃消化半个小时后快速用PCR产物回收试剂盒纯化，然后连接双酶切后的载体pTS-PPT并转化大肠杆菌，鉴定阳性的转化子，回收质粒保存，命名为pTS-PHT；

3.)表达载体的组装：

以pTF-PHT为模板，148PP2/T2为引物扩增潮霉素磷酸转移酶表达单元，退火温度45℃，PCR产物用T4 DNA聚合酶消化后快速回收并连接到双酶切后的载体pTF-cnrDNA，转化大肠杆菌鉴定阳性转化子，回收质粒置于-20℃冰箱保存备用，命名为pTF-rPH。

5.发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)20243表达载体的转化和表达：

载体pTF-rPH用rDNA两端的酶切位点Sal I和EcoR I双酶切，回收目的片段，电转化发酵性丝孢酵母，涂布80ug/ml潮霉素抗性选择性平板，置于28℃恒温培养。

三、实验结果与分析

1.三磷酸甘油酯激酶蛋白质比对结果分析

本实验选择了18种不同来源的三磷酸甘油酯激酶的蛋白质序列，将其氨基酸序列利用生物信息学ClustalX软件进行分析比对发现，该酶普遍存在着3个极为保守的氨基酸簇(①IRVDFNVP；②NDAFGTAHRAHSSM；③STGGGASLELLEGK)，根据密码子的简并性，选取两个比较保守且密码子简并性较低的结构域RVDFNVP和NADAFGT，利用密码子表反推出其对应的简并引物，再考虑到密码子利用的偏爱性，根据核苷酸序列的BLAST比对结果，去掉非偏爱密码子，得到简并度大大降低的目标引物BPGK1和BPGK2，比对结果如图2所示(图2-1和图2-2)。

选取的18种不同来源的蛋白质分别有酵母、细菌、真菌、哺乳动物和人类等，具体如图2所示。由于物种间亲缘关系的远近决定了蛋白质序列保守性的高低，为了得到保守性较强的蛋白质序列，需要搜集比对不同物种来源的三磷酸甘油酯激酶的蛋白质序列，亲缘关系越远，比对得到的相同序列保守性就越强。

选取的18种来源的三磷酸甘油酯激酶所对应的物种分别是：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae(NP_009938.2)；鲁氏接合酵母Zygosaccharomyces rouxii(CAQ43462.1)；树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS 6054(XP_001384704.1)；米根霉Rhizopus oryzae(ABB88570.1)；粗糙脉胞菌Neurospora crassa(CAA39865.1)；土曲霉Aspergillus terreus NIH2624(XP_001210310.1)；桔蚜Toxoptera citricida(AAU84938.1)；蔬菜灰霉病菌Botryotiniafuckeliana(XP_001548321.1)；荚膜组织胞浆菌Ajellomyces capsuLatus(XP_001541288.1)；野猪Sus scrofa(NP_001093402.1)；小家鼠Mus muscuLus(AAA70267.1)；大西洋鲑Salmosalar(ACH70652.1)；家犬Canis familiaris(XP_532167.1)；双孢蘑菇Laccaria bicolorS238N-H82(XP_001878331.1)；裂殖酵母Schizosaccharomyces japonicus yFS275(XP_002174797)；双孢蘑菇Agaricus bisporus(O94123.1)；玉蜀黍赤霉Gibberella zeae PH-1(XP_384168.1)；人类Homo sapiens(CAG32997.1)。

2.丝孢酵母(Trichosporon sp)21148三磷酸甘油酯激酶基因PGK启动子序列的克隆：

利用简并引物BPGK1和BPGK2，扩增出目的片段序列，三磷酸甘油酯激酶基因DNA部分序列，凝胶电泳成像如图3所示，PCR产物序列长度约400bp左右，命名为pTS-UPG。

载体pTS-UPG经测序后所得基因序列如图3，序列长度为434bp，将该序列提交NCBI进行BLASTX同源比对，分析表明，Genebank没有登陆关于丝孢酵母PGK基因的序列，但该基因与发表的爱尔兰海藻Chondrus crispus的三磷酸甘油酯激酶基因(AY029776.1)序列一致性最高，为88％；其次是总状毛霉Mucor racemosus(EU195430.1)，序列一致性为84％；再次是甲基营养酵母Candida boidinii(AB111102.1)，序列一致性为81％；与白色念珠菌Candida albicans SC5314(XM_706279.1)序列一致性为77％；与稻根霉菌Rhizopus oryzae(DQ279101.1)的PGK基因同源性较差，序列一致性仅为65％。因此证明所克隆到的基因片段为三磷酸甘油酯激酶DNA部分序列(如图4所示)，可进行下一步的染色体步移实验。

3.克隆得到的PGK基因及其启动子的序列分析：

染色体步移得到的序列亚克隆到载体pMD18-T上，测序结果如图5所示，该序列有1.3kb左右，其3’端核苷酸序列与已知丝孢酵母Trichosporon sp三磷酸甘油酯激酶基因(图4)DNA5’端的核苷酸序列相同，起始密码子的上游有930bp的碱基序列。通过启动子在线分析软件(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)分析发现，该序列包含真核生物启动子特征序列，如类似TATA-box和CAAT-box的结构，以及调节启动子转录活性的AGAG-box和具有增强子作用的TGTG顺式作用元件等，并且富含GT的重复序列。

丝孢酵母(Trichosporon sp)21148三磷酸甘油酯激酶启动子的序列如下：

ATACGACTCACGGCCCGGGCTGGTCTACTCTGGCTTCTCTATAATGTATTTTTTGCTTTAGAATTTGAAAGGGTTCAAATAAAGTTGGTGTCAAATATTTAGTGCAGATCAAATTTATATGGTTTCTAGGAAAGACTAGACTATTACCTCAAAGGTCCTATCCTAGATTGACACCCTAGAACTAGTCTCCTCTGAAAACGGTCTAGCAAAATCGCGAACAAGATTTTTAATTGCACCATGAGACGATCATGAAAAATTGTATGATCTGAAGCACAAGGTACACTTTGATGGTTAAATGAGCTGGAATTGTTAGGTGATTGGGTATGTACAACGTGTCTGAGGCTACATTCTATCCCAGTCGTAGTCAGCCTGGTGCTCTTAATTCCTTGTACTACACTCTGAGCTGTACTTCTCTGATTGTAAATGCTCGTGGTGAGCCTTTCTATCATGAGCTAGCATTGACACATAATAAATCATCACTCTTAAACCAGATCCTTCTGTAGTCTTCCATAATCTTCCATAATCCTCTATAATCCACTCTATTACTCTAATTATCACTCCCAGTTTACCCTTCTTACAAAATTTGCATCCCACCGTTGACTCGTCCGTTGATGTCGTTGACGTTCGTGGGCCCGGCACACACGCTCACACGGTGCAACATCACGCTACTCCCTCGAGCTGGTGATGGAACAAGCCCAGTGGGGAGTGCTATCCCCCTGTTGCTTCAACCTTCTTTACTACCACATCAACAATACTTTATTAAACAAAGTAAGCACAGTGAACACTCAATTGACATCTCAATAGCTTCTTTATCAAGCAAATTATCAGTCACTGACTTGAACGTTGAAAACAAACGTGTCTTTATCCGTGTT

其中：是启动子中的TATA box，CAAT box；是AGAG-box和TGTG启动子中的顺式作用元件；代表可能的转录起始位点；指的是起始密码子；粗斜体部分代表启动子扩增所需引物148PP1，148PP2部分；“_”指染色体步移所需引物AP2和GSP2部分；斜体部分指的是染色体步移所得片段测序结果与简并引物扩增所得序列测序结果一致的序列。

4.发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)20243表达载体的构建：

表达载体pTF-rPH构建过程：首先将rDNA中间引入CopI和NotI双酶切位点，连入T载体使得载体pTF-cnrDNA大小为3.5kb；同时构建潮霉素磷酸转移酶基因表达单元，即将潮霉素磷酸转移酶基因置于启动子和终止子之间，同样采用引入CopI和NotI双酶切的方式进行，构建载体pTS-PHT，载体大小为5.1kb；之后将潮霉素磷酸转移酶基因表达单元连入rDNA两个酶切位点之间，载体pTF-rPHG大小增加为5.9kb；发酵性丝孢酵母(Trichosporonfermentans)20243整合型表达载体pTF-rPHG构建过程如图6所示。

5.表达载体pTF-rPHG的功能验证

取出发酵性丝孢酵母Trichosporon sp酵母表达载体pTF-rPHG转化，平板观察生长情况，如图7A所示，转化后的酵母在潮霉素平板上有单菌落长出，而未转化的对照菌株则没有菌落长出。从转化后的平板中挑取三个单菌落，从原始菌株保存的斜面上挑取一环分别接种到2ml YPD液体培养基，过夜培养后分别划线到未填加潮霉素和补加潮霉素的YPD固体培养基，其生长情况如图7B所示。从图7B中可以看出，转化后的酵母菌均能在两种培养基生长，但潮霉素平板生长情况相对较差，而未转化的酵母只能在不含潮霉素的平板上生长。由此可以说明，三磷酸甘油酯激酶的PGK启动子成功的启动了潮霉素基因的表达。

从转化后的潮霉素平板上挑取5个单菌落接种到2ml YPD液体培养基过夜培养，然后进行菌液PCR，验证转化后的酵母菌株，凝胶电泳图像如下图8所示，挑取的五个单菌落PCR扩增所得的目的片段与潮霉素磷酸转移酶基因目的片段大小相等，均为1.0kb左右，因此证明了潮霉素基因转入到了发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)20243。

综合以上实验结果，可以看出，新克隆到的三磷酸甘油酯激酶(PGK)的启动子具有启动潮霉素基因在发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)20243中表达的功能。