制备基于功能两亲分子或者大分子的纳米颗粒的方法和其用途

摘要

本发明涉及任选地在至少一种共类脂存在下，制备基于功能两亲分子或者大分子的纳米颗粒的方法，其可以包封治疗剂，特别为抗肿瘤剂，和其用于治疗剂，特别地抗肿瘤剂的运送或者载体化的用途。

说明书

本发明涉及制备基于功能两亲分子或者大分子的纳米颗粒的方法和其用于治疗剂(特别地抗肿瘤剂)的运送或者载体化(vectorisation)的用途。

在抗肿瘤剂中，顺铂为广泛使用的抗肿瘤剂，特别地用于治疗实体瘤。然而，由于其毒性以及出现获得抗药性，它的使用受到限制。

为了克服这些缺点，现有技术已经提出不同配制剂：例如专利US5178876描述了用于在脂质体中封装的疏水络合物形式的铂衍生物。

专利US 6001817描述了包含顺铂的组合物和包含至少一种核苷或者脱氧核苷的载体(vecteur)的组合物。

专利US 7908160涉及与配体连接的顺铂衍生物，其活性根据与配体的结合是可逆的。

申请WO 01/32139描述了在亲脂性纳米颗粒中封装的顺铂的组合物，所述纳米颗粒通过重复的加热和冻结周期、基于带负电荷的天然脂类(特别地二油基磷脂酰丝氨酸)获得。在该申请中指出，在水中顺铂形成具有比不带电荷的物种更高的溶解度的带正电荷的聚集体，这可以使它们与带负电荷的类脂膜相互作用和使顺铂聚集体周围的类指膜的重新组织。

然而，仍然需要解决与治疗剂(特别地抗肿瘤剂)的载体化有关的问题。

特别地，寻求一种方法，该方法可以将治疗剂(特别地顺铂和/或它的衍生物)以具有高活性地快速地运送至肿瘤细胞内部，同时保护健康细胞，即降低神经毒性、肾毒性、听觉毒性、消化毒性等等，同时限制对这种治疗剂的抗药性出现的现象。

还设法提供在足够的时间中具有足够稳定性的载体以避免过早释放治疗剂和与在生物培养基中游离治疗剂的存在有关的缺点，特别地在活性损失和毒性方面。

现在已经发现使用由功能两亲分子(composéamphiphile fonctionnel)或者大分子形成的纳米颗粒可以获得治疗剂的有效并且快速的细胞内递送并且显示出改善的稳定性性能，特别地在37℃时，这可以获得所述治疗剂随着时间延长的载体化。

“治疗剂”表示例如用于(体外或者体内)病状的预防或治疗或者生物功能的恢复的天然或者合成的分子，特别地在动物中，包括人类，或者在孤立的细胞上，除了核酸或者其碎片外。

这种分子可以例如选自药物的活性成分，特别地选自抗肿瘤剂，如：

-铂络合物，其中特别地可以提到顺铂、卡铂、奥沙利铂(oxaliplatine)、奈达铂、洛铂(lobaplatine)等等。或者

-能够与铂络合物连接的钌，或者

-不含铂的基于钌Ⅱ和/或Ⅲ、钛的无机络合物，例如二氯化二茂钛，或者镓，例如镓盐，如硝酸镓、氯化镓、KP46，或者

-铁的衍生物，如ferrocenium盐、包含铁的核苷类似物、包含基于的吡啶基-五齿配体(ligands pyridyl-pentadéntate)的铁(Ⅱ)络合物，或者

-钴的衍生物，如六羰基-二钴络合物，炔-钴络合物，包含氮芥配体的Co(Ⅲ)络合物，或者

-金的衍生物，如Auranofin、金(Ⅰ)、(Ⅲ)和(Ⅲ)络合物、硫代葡糖金等等。

有利地，由式(Ⅰ)的功能两亲分子或者大分子形成的纳米颗粒用于封装这些化合物并且确保它们在细胞内的递送的用途可以限制对这些化合物的抗药性的现象。

铂的络合物，特别地顺铂，是用于本发明目的的优选治疗剂。

基于钌Ⅱ和/或Ⅲ的无机络合物可以是例如被取名为NAMI-A、RAPTA-C、KP1019的络合物。这种不含铂的络合物描述在Ott I.和GustR.的Arch.Pharm.Chem.Life Sci.2007，340，117-126；Reedijk J.，CurrOpin Chem Biol.，1999，3，236-40；Haimei Chen等，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，173-186中。

包含铁的核苷类似物描述在Schlawe D.等，Angew.Chem.Int.Ed.，2004，1731-1734)。

根据第一方面，本发明因此涉及用于封装治疗剂，优选地抗肿瘤剂的方法，其包括这样的步骤，该步骤在于：

a)制备至少一种式(Ⅰ)的功能两亲化合物

其中

-X表示氧或者硫原子或者亚甲基，

-B表示嘌呤碱或者嘧啶碱，如尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、次黄嘌呤或者它们的衍生物，或者非天然的单或者双环的杂环碱，其每个环包含4-7个链节，其任选地被取代；

-L₁和L₂，相同或者不同的，表示氢、氧羰基-O-C(O)-、硫代氨基甲酸酯基团-O-C(S)-NH-、碳酸酯基团-O-C(O)-O-、氨基甲酸酯基团-O-C(O)-NH-、氧原子、磷酸酯基团、膦酸酯基团或者包含1-4个氮原子的杂芳基，该杂芳基未被取代或者被直链或支链的，饱和或者不饱和的C₂-C₃₀烃链取代。

或者，L₁和L₂一起形成下式的缩醛基(goupement cétal)

或者L₁或者L₂表示氢，另一个表示羟基或者包含1-4个氮原子的杂芳基，该杂芳基未被取代或者被直链或支链的C₂-C₃₀烷基链取代；

-R₁和R₂，相同的或者不同的，表示

-饱和或者部分不饱和的直链或支链的C₂-C₃₀，优选地C₆-C₂₅，特别地C₈-C₂₅烃链，其任选地完全地或者部分地氟化，其未被取代或在链端的碳上被氟原子或者被苄基酯或醚或者萘基酯或醚取代，或者

-二酰基链，其中每个酰基链是C₂-C₃₀链，或者

-甘油二酯(diacylglycérol)、鞘氨醇或者神经酰胺基团，或者

-当L₁或L₂表示氢，另一个表示羟基或者包含1-4个氮原子的杂芳基时，R₁和R₂不存在；

-R₃表示：

-羟基、氨基、磷酸酯基团、膦酸酯基团、磷脂酰胆碱基团，O-烷基磷脂酰胆碱基团、硫代磷酸酯基团、磷鎓、NH₂-R₄、NHR₄R₅或NR₄R₅R₆其中R₄、R₅和R₆，相同的或者不同的，表示氢原子或者直链或支链的C1-C5烷基链或者羟烷基链，或者

-直链或支链的C₂-C₃₀烷基链，其任选地被羟基取代，或者

-环糊精残基，或者

-残基

其中V表示-O-、-S-或-NH-键，R₇表示H或CH₃，和n＝1-500，或

-(CH₂)_n-V-R₈基团，其中R₈表示C₂-C₃₀烷基，和n＝1-500，或

-包含1-4个氮原子的杂芳基，其未被取代或者被以下基团取代：C₂-C₃₀烷基或(CH₂)_m-O-(CH₂)_p-R₉基团，其中m＝1-6和p＝0-10和R₉表示包含5-7个碳原子的环状缩醛基团，其未被取代或者被至少一个直链或支链的C₂-C₃₀烷基或者被甾醇残基取代，或者

-R₃通过共价键与另一相同或者不同的式(Ⅰ)化合物的另一相同或者不同的取代基R₃连接，以形成呈二聚物形式的式(Ⅰ)化合物，

和

-治疗剂，优选地抗肿瘤剂的混合物，

b)使所述混合物经受重复的加热和冻结周期，以便获得包含所述治疗剂的纳米颗粒，和

c)回收如此获得的包含所述治疗剂的纳米颗粒。

有利地，已经发现，构成式(Ⅰ)化合物的分子和/或大分子结构可以与治疗剂形成稳定的纳米颗粒，所述式(Ⅰ)化合物包含至少一种由取代基B表示的治疗剂的配体(核苷碱基(nucléobase)、核苷、修饰核苷、核苷酸、低聚核苷酸、杂环等等)并具有两亲特征，这是由于存在至少一个亲水部分(磷酸酯(盐)、羧酸酯(盐)等等)和至少一个疏水部分(单股(monocaténaire)、双股(bicaténaires)的疏水片段和由生物起源的合成单体产生的极性部分等等)。

通过将式(Ⅰ)化合物的两亲性质，治疗剂的配体和在治疗剂在这些化合物中的存在和这些化合物之间的可能的静电相互作用组合，如此获得的纳米颗粒具有可以使被封装的活性成分(特别为抗肿瘤剂)快速有效的细胞内递送。

不希望将本发明与一种理论结合，可以假定式(Ⅰ)化合物的分子间相互作用导致纳米颗粒的在表面上的内聚力的增加，其表现为在使用条件下随着时间更大的稳定性。

有利地，所述纳米颗粒还具有适合于它们作为治疗剂的载体的用途的寿命。

在上面式(Ⅰ)中，n有利地为1-500，优选地1-100，特别地1-50，尤其特别地1-10。

“直链或者支链的C₁-C₅烷基”表示例如甲基、乙基、丙基、异-丙基、正丁基、异-丁基、叔丁基，优选甲基或者乙基。

同样，在上面式(Ⅰ)中，嘌呤或者嘧啶碱，或者非天然的杂环碱可以被至少一个取代基取代，该取代基选自例如：卤素、氨基、羧基、羰基、羰氨基、羟基、叠氮基、氰基、烷基、环烷基、全氟烷基、烷氧基(例如，甲氧基)、氧羰基、乙烯基、乙炔基、丙炔基、酰基等等。

“非天然的杂环碱”表示不同于尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或者次黄嘌呤的碱，其在自然界中不存在。

“包含1-4个氮原子的杂芳基”表示单环的或者双环的、芳族或者部分不饱和的包含5-12个原子的碳环基团，其被1-4个氮原子间隔，特别地为吡唑、三唑、四唑或者咪唑基。

为了制备式(Ⅰ)化合物，可以参考申请WO 2005/116043，其描述了获得这类化合物的不同路径(特别地参看第8-17页和实施例).

根据本发明的方法可以包括在以下通常条件下进行实施的步骤：

-使式(Ⅰ)化合物溶于有机溶剂中以形成类脂混合物，然后在提取后，进行蒸发以形成膜；

-平行地，将期望量的治疗剂，优选地抗肿瘤剂溶于蒸馏水中；

-类脂膜在治疗剂(优选地抗肿瘤剂)的溶液中进行再水合。通过超声处理和加热获得透明溶液；

-使溶液快速冷却，例如通过浸入液氮中。该加热/冷却周期优选地进行1-10次，特别地5-10次，尤其10次。

使获得的溶液离心。分离上清液。在多次离心之后，干燥沉淀物。

有机溶剂可以选自例如在本领域中通常的有机溶剂，如氯仿、醇，如甲醇或者乙醇等等。

进行加热，优选地加热至大约20℃-80℃的温度，并冷却至大约-190℃(液氮)至0℃(冰)的温度。适当的加热/冷却周期可以例如是45℃(对于加热)和是-78℃(对于冷却)。

优选地，治疗剂选自铂络合物(顺铂、卡铂等等)，顺铂是特别优选的，或者能够与铂络合物连接的钌，或者上述基于钌Ⅱ或者Ⅲ、钛、镓、钴、铁或者金的不含铂的无机络合物。

式(Ⅰ)化合物/治疗剂的摩尔比R可以为例如0.01-50，特别地R＝0.2。

获得的纳米颗粒可以任选地经聚碳酸酯过滤器被挤出，该过滤器具有例如大约100或者200纳米的孔隙直径。

由此获得固体纳米颗粒，其由被一个或多个由如上面所定义的式(Ⅰ)官能性两亲化合物构成的类脂层包围的富含治疗剂(活性成分)的核心构成，有或者没有共-类脂(co-lipide)。

所述由被一个或多个由如上面所定义的式(Ⅰ)官能两亲化合物构成的类脂层(有或者没有共-类脂)围绕的富含治疗剂(优选地抗肿瘤剂，特别地铂络合物)的核心构成的固体纳米颗粒形成本发明的随后目的。

在多层包裹的情况下，全部类脂层由相同的类脂构成(式(Ⅰ)化合物，有或者没有共-类脂)。

根据本发明的一个方面，作为式(Ⅰ)化合物的补充，在类脂混合物中还将使用至少一种共-类脂。

“共-类脂”表示与式(Ⅰ)化合物组合使用的化合物，其参与纳米颗粒的一个或多个类脂层的结构的建立。

优选地，将使用两性离子性共-类脂。

所述共-类脂可以例如选自二油基磷脂酰胆碱(DOPC)或者二油基磷脂酰丝氨酸磷脂酰胆碱(DOUPC)，与式(Ⅰ)化合物组合以形成纳米颗粒的一个或多个类脂层。

当这些化合物与式(Ⅰ)化合物的混合使用时，它们可以起共-类脂的作用。或者，它们可以被包括在式(Ⅰ)中，如二油基磷脂酰丝氨酸磷脂酰胆碱(DOUPC)。在这种情况下，它们将或者起式(Ⅰ)化合物的作用，或者与另一式(Ⅰ)化合物组合而起共-类脂的作用。

根据本方法的优选方面，所述类脂混合物仅仅包含至少一种式(Ⅰ)化合物并且不包含共类脂。

优选地，治疗剂将在水相中以大约0.1ng/mL-10mg/mL的浓度进行使用，以使得活性成分在细胞内的递送是重要的。

优选的式(Ⅰ)化合物为其中X表示氧的那些。

式(Ⅰ)化合物，其中B表示胸腺嘧啶或者腺嘌呤，也是优选的化合物。

在用于本发明目的的特别有利的式(Ⅰ)化合物中，可以提到式(Ⅰ)化合物，其中：

-X和B如上面所定义；

-L₁表示磷酸酯基，L₂表示氢，R₁表示C₂-C₃₀烷基或者二酰基，其中每个酰基链是C₂-C₃₀链，和R₃是羟基；或者

-L₁和L₂表示氧原子，R₁和R₂表示氢和R₃表示三唑、四唑、吡唑或者咪唑基，其被C₂-C₃₀烷基取代，或

-L₁表示三唑、四唑、吡唑或者咪唑基，L₂表示氢，R₁表示C₂-C₃₀烷基和R₃是羟基，或

-L₁表示羟基，L₂表示氢和R₃是被C₂-C₃₀烷基链取代的三唑基，该烷基链任选地被羟基取代，或者R₃是基团或-(CH₂)n-V-R₈基团，其中V表示-O-或-NH-和R₈表示C₂-C₃₀烷基，或

-L₁表示羟基，L₂表示氢和R₃是被(CH₂)_m-O-(CH₂)_p-R₉基团取代的三唑基，其中m＝1-6和p＝0-10和R₉表示包含5-7个碳原子的环状缩醛基团，其未被取代或者被至少一个直链或支链的C₂-C₃₀烷基或者被甾醇残基取代，或者

-L₁表示羟基，L₂表示氢和R₃是被(CH₂)_m-O-(CH₂)_p-R₉基团取代的三唑基，其中m＝1-6和p＝0-10通过共价键连接至另一相同的式(Ⅰ)化合物的另一相同取代基R₃，以形成二聚物形式的式(Ⅰ)化合物，或者

-L₁表示磷酸酯基，L₂表示氢R₁表示二酰基链，其中每个二酰基链是C₂-C₃₀链，和R₃是羟基，

其是新型化合物。

式(Ⅰ)化合物，其中取代基L₁或者取代基R₃包括或者由未被取代的或者取代的三唑基构成，也是对于根据本发明的方法的目的优选的新型化合物。

上述化合物是构成本发明目的的新型化合物，以及包括这些化合物的和治疗剂的纳米颗粒，治疗剂特别地为抗肿瘤剂，特别为铂络合物(如，例如顺铂，卡铂，奥沙利铂，奈达铂，洛铂)，或能够与铂络合物连接的钌，还或者上述基于钌、钛、镓、钴、铁或者金的不含铂的无机络合物。顺铂是用于本发明目的优选的抗肿瘤剂。

式(Ⅰ)化合物可以包含具有抗肿瘤活性的嘌呤或者嘧啶碱的衍生物，例如aracytosine(AraC)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，碘苷(IdU)，2′-脱氧-2′-亚甲基胞嘧啶核苷(DMDC)或者5-氯代-6-叠氮基-5，6-二氢-2′-脱氧尿苷。

本发明的目的还是能够通过如上所述的方法获得的纳米颗粒的用途，用于治疗剂，特别为抗肿瘤剂的运送或者载体化。

特别地，本发明涉及能够通过如上所述的方法获得的纳米颗粒的用途，用于治疗剂，特别为抗肿瘤剂的细胞内递送。

本发明还涉及能够通过上述方法获得的纳米颗粒的用途，用于制备抗肿瘤药物。

本发明还涉及能够通过上述方法获得的纳米颗粒，用于治疗肿瘤疾病，特别为癌症，如卵巢癌、睾丸癌、结肠癌、宫颈癌、肺癌、或者腺肉瘤等等。

通过以下实施例非限制性地举例说明本发明。

所有来源于化学产品供应商(Aldrich，Alfa Aesar和Avanti PolarLipid)的起始产物不进行随后纯化而进行使用。溶剂不进行附加的蒸馏而进行使用。合成的化合物使用标准的光谱分析法如RMN ¹H(在300.13MHz)，RMN ¹³C(在75.46MHz)和RMN ³¹P(在121.49MHz)和质谱学进行表征(特征)。在RMN中的化学位移(δ)用ppm表示并且相对于TMS。在RMN ¹H中的偶合常数J用Hz表示。Merck RP-18F254s板用于薄层层析法(CCM)。SEPHADEX LH-20(25-100μm)二氧化硅用于通过定量色谱分离法的纯化。

以下取名为″制备″的实施例描述用于制备式(Ⅰ)化合物的合成中间体的制备。式(Ⅰ)化合物的制备然后描述在取名为“实施例”的合成实施例中。

制备1

5’-对甲苯磺酰基胸苷

将在无水吡啶中0.1M溶液形式的2g胸苷(8.26毫摩尔)引入到在无水氮气氛下的双颈烧瓶中。然后将溶液冷却至0℃并且分小部分地加入3.935g对甲苯磺酰氯(2.5当量，20.6毫摩尔)。使反应介质返回到环境温度，然后搅拌10小时。然后通过加入10mL甲醇停止该反应，维持搅拌30分钟。向混合物加入50mL CH₂Cl₂，然后依次用20mL 5％NaHCO₃溶液、20mL NaCl饱和溶液和20mL 5％NaHCO₃溶液洗涤。在减压下去除该溶剂。纯净的期望化合物通过在甲醇中的重结晶而获得。

Rf：0.47(AcOEt/MeOH 9/1)

产率为75％。

RMN¹H(300,13MHz，DMSO d₆)：δ1,77(s，3H，CH₃)，δ2,11(m，2H，CH₂)，δ2,42(s，3H，CH₃)，δ3,52(t，j＝6Hz，4H，CH₂)，δ4,18(m，1H，CH)，δ4,25(m，3H，CH，CH₂)，δ5,42(s，1H，OH)，δ6,15(t，j＝6Hz，H，CH)，δ7,38(s，1H，CH)，δ7,46(s，1H，CH)，δ7,49(s，1H，CH)，δ7,78(s，1H，CH)，δ7,81(s，1H，CH)，δ11,28(s，1H，NH).

RMN ¹³C(75,47MHz，DMSO d₆)：δ12,5(CH₃)，δ21,6(CH₃)，δ38,9(CH₂)，δ70,4(CH₂)，δ70,6(CH)，δ83,7(CH)，δ84,5(CH)，δ110,3(C)，δ128,1(CH ar)，δ130,6(2CH ar)，δ132,6(C ar)，δ136,4(C ar)，δ145,6(C)，δ150,8(C＝O)，δ164,1(C＝O).

高解析度MS[M+H]⁺：397.1

制备2

2’-脱氧-5’-甲苯磺酰基腺苷

将在无水吡啶中0.1M溶液形式的2g 2’-脱氧腺苷(8毫摩尔)引入到在无水氮气氛下的双颈烧瓶中。然后将溶液冷却至0℃并且按小部分地加入3.793g对甲苯磺酰氯(2.5当量，20毫摩尔)。使反应介质返回到环境温度，然后搅拌10小时。然后通过加入10mL甲醇停止该反应，维持搅拌30分钟。向混合物加入50mL CH₂Cl₂，然后依次用20mL 5％NaHCO₃溶液、20mL NaCl饱和溶液和20mL 5％NaHCO₃溶液。在减压下去除该溶剂。纯净的期望化合物通过在甲醇中的重结晶而获得。由此分离出2.1g白色产物。

Rf：0.37(AcOEt/MeOH 9/1)

产率为63％。

制备3

5’叠氮基-5’-脱氧胸苷

将在DMF中的0.1M溶液形式的如在制备1中描述的2g 5’-对甲苯磺酰基胸苷(5毫摩尔)引入到在无水氮气氛下的装备有冷凝器的双颈烧瓶中。加入1.3g叠氮化钠(4当量，20毫摩尔)。然后搅拌该溶液并且在110℃加热10小时。将该混合物冷却至环境温度。将50mL CH₂Cl₂加入到混合物中，然后依次用两次15mL水然后用15mL NaCl饱和水溶液洗涤。有机相在硫酸钠上进行干燥然后在减压下去除溶剂。纯净的期望化合物通过在甲醇中的重结晶而获得。如此获得0.8g白色固体。

Rf：0.47(AcOEt/MeOH 9/1)

产率为60％。

MS[M+H]⁺：268.1

制备4

5’-叠氮基-5’，2’-二脱氧腺苷

将在DMF中的0.1M溶液形式的如在制备2中描述的2g 2’-脱氧-5’-对甲苯磺酰基腺苷(5毫摩尔)引入到在无水氮气氛下的装备有冷凝器的双颈烧瓶中。加入1.3g叠氮化钠(4当量，20毫摩尔)。然后搅拌该溶液并且在110℃加热10小时。将该混合物冷却至环境温度。将50mL CH₂Cl₂加入到混合物中，然后依次用两次15mL水然后用15mL NaCl饱和水溶液洗涤。有机相在硫酸钠上进行干燥然后在减压下去除溶剂。纯净的期望的化合物通过在甲醇中的重结晶而获得。如此获得0.8g白色固体。

Rf：0.37(AcOEt/MeOH 9/1)

产率为60％。

高解析度MS[M+H]⁺：计算质量：277.1161，测定质量：277.1157

制备5

1-炔丙氧基十八烷

将在DMF中的0.5M溶液形式的673mg的丙炔醇(12毫摩尔)引入到在无水氮气氛下的干净干燥的烧瓶中。然后将该溶液冷却至0℃并且按小份地加入180毫克氢化钠(0.625当量，7.5毫摩尔)。使该反应介质返回到环境温度。加入2克1-溴-十八烷(0.5当量，6毫摩尔)。维持搅拌5小时。然后通过加入10mL甲醇停止该反应并且维持搅拌30分钟。将50mL CH₂Cl₂加入到混合物中，然后依次用两次20mL和20mL的NaCl饱和溶液洗涤。然后有机相在Na₂SO₄上干燥，在减压下去除溶剂。在色谱柱(己烷)上分离后获得纯的期望化合物。由此分离出1.2g白色产物。

Rf：0.82(己烷)

产率为65％。

RMN¹H(300,13MHz，CDCl₃)：δ0,90(t，j＝6Hz，3H，CH₃)，δ1,28(s，30H，CH₂)，δ1,61(m，2H，CH₂)，δ2,43(t，j＝3Hz，1H，CH)，δ3,53(t，j＝6Hz，2H，CH₂)，δ4,15(d，j＝3Hz，2H，CH₂).

RMN¹³C(75,47MHz，CDCl₃)：RMN ¹³C(75,47MHz，CDCl₃)：δ14,2(CH₂)，δ22,7(CH₂)，δ26,1(CH₂)，δ29,4(CH₂)，δ29,5(CH₂)，δ29,6(CH₂)，δ32,0(CH₂)，δ58,0(CH₂)，δ70,4(CH₂)，δ74,1(CH)，δ80,1(C).

制备6

1，12-炔丙氧基十二烷

12-炔丙氧基十二烷-1-醇

将在DMF中的0.5M溶液形式的1g十二烷-1，12-二醇(5毫摩尔)引入到在无水氮气氛下的干净干燥烧瓶中。使该反应介质返回到0℃。按小部分地加入360毫克hydrure d’hydrogène(3当量，15毫摩尔)。使该反应介质返回到环境温度。加入1.49克溴丙炔(2.5当量，12.5毫摩尔)。维持搅拌5小时。然后通过加入10mL甲醇停止该反应，维持搅拌30分钟。将50mL CH₂Cl₂加入到混合物中，然后依次用两次20mL和20mL的NaCl饱和溶液洗涤。然后有机相在Na₂SO₄上干燥，在减压下去除溶剂。然后在色谱柱(Hex/ActEth 9/1)上分离获得的产物。分离两种产物，即370毫克对应于1，12-炔丙氧基十二烷的棕色油和430毫克对应于12-炔丙氧基十二烷-1-醇的褐色固体。

1，12-炔丙氧基十二烷

Rf：0.53(己烷/AcOtEt 9/1)

产率为27％。

RMN¹H(300,13MHz，CDCl₃)：δ1,31(m，16H，CH₂)，δ1,61(m，4H，CH₂)，δ2,43(t，j＝3Hz，1H，CH)，δ3,52(t，j＝6Hz，4H，CH₂)，δ4,15(d，j＝3Hz，4H，CH₂).

RMN¹³C(75,47MHz，CDCl₃)：δ26,1(CH₂)，δ29,4(CH₂)，δ29,5(CH₂)，δ29,6(CH₂)，δ58,0(CH₂)，δ70,3(CH₂)，δ74,1(CH)，δ80,1(C).

12-炔丙氧基十二烷-1-醇

Rf：0.10(己烷/AcOtEt 9/1)

产率为36％。

RMN¹H(300,13MHz，CDCl₃)：δ1,32(m，16H，CH₂)，δ1,59(m，4H，CH₂)，δ2,43(t，j＝3Hz，2H，CH)，δ3,52(t，j＝6Hz，2H，CH₂)，δ3,65(t，j＝6Hz，2H，CH₂)，δ4,15(d，j＝3Hz，2H，CH₂).

RMN¹³C(75,47MHz，CDCl₃)：δ25,8(CH₂)，δ26,0(CH₂)，δ29,4(2CH₂)，δ29,5(2CH₂)，δ29,6(CH₂)，δ32,7(CH₂)，δ57,9(CH₂)，δ62,7(CH₂)，δ70,2(CH₂)，δ74,2(CH)，δ79,9(C).

制备7

o-炔丙基胆甾醇

将在DMF中的0.5M溶液形式的500mg的胆甾醇(1.3毫摩尔)引入到在无水氮气氛下的干净干燥的烧瓶中。然后将该溶液冷却至0℃和按小部分加入47毫克的氢化钠(1.5当量，2毫摩尔)。使该反应介质返回到环境温度。加入238毫克溴丙炔(1.5当量，2毫摩尔)。维持搅拌5小时。然后通过加入10mL甲醇停止该反应并且维持搅拌30分钟。将50mL的CH₂Cl₂加入到该混合物中，然后它依次用两次20mL和20mL的NaCl饱和溶液进行洗涤。然后有机相在Na₂SO₄上干燥，在减压下去除溶剂。在色谱柱(己烷/AcOEt 8/2)上纯化后获得期望化合物。由此分离出215毫克白色产物。

Rf：0.83(己烷/AcOEt 8/2)

产率为39％。

实施例1

胸苷3’-(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)(di c14dT)

在氮气下，将5’-O-(4.4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧胸苷，3’-[(2-氰基-乙基)-N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(0.500g，1当量，0.67毫摩尔)，1，2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三醇(0.447g，1.3当量，0.87毫摩尔)和在乙腈中的0.45M四唑溶液(2mL，1.3当量，0.87毫摩尔)溶于4mL无水乙睛中。在环境温度下磁力搅拌该反应介质24小时。然后通过加入43mL在THF/Pyr/H₂O中0.02M二碘溶液氧化该混合物。在环境温度下12小时后，在真空下蒸发掉溶剂。将残留物溶于8mL二氯甲烷中。然后，在5小时内将0.2mL的1，5-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)(1.3当量，0.87毫摩尔)加入到反应介质中。该反应介质用0.1N的HCl溶液然后用Na₂S₂O₇饱和溶液洗涤。有机相在真空下进行浓缩。在通过使用洗脱梯度(MeOH/DCM 9∶1直至1∶1)的快速色谱分离法(381mg)纯化后，获得化合物。

产率为69％。

Rf：0.34(DCM/MeOH 9∶1)

RMN 1H(300MHz，CDCl3)：δen ppm 0,84(t，6H，J＝6,92Hz，2＊CH₃)，1,21(m，40H，20＊CH₂)，1,42(dd，4H，J1＝8,45Hz，J2＝15,68Hz，2＊CH2)，1,89(s，3H，Me)，2,30(dd，4H，J1＝7,43Hz，J2＝15,92Hz，2＊CH2)，2,83(t，2H，J＝5,84，H2’)，3,84(m，1H，H3’)，4,09-4,35(m，7H，2＊CH₂(glycerol)，H4’，H5’)，5,27(s，1H，CHglycérol)，6,22(t，1H，J＝6,81Hz，H1’)，7,61(s，1H，Hbase).

RMN 13C(75MHz，CDCl3)：δen ppm 19,29(CH₃)，23,71(CH₂)，26,57(CH₂)，28,73(CH₂)，32,76(CH₂)，37,85(CH₂)，48,90(CH₂)，166,15(C＝O).

RMN 31P(121MHz，CDCl3)：δen ppm 0,61.

FAB高解析质谱-理论m/z＝815.4823观测m/z＝815.4794.

实施例2

胸苷3’-(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)(di C16dT)

在氮气下，将5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2’-脱氧胸苷，3’-[(2-氰基-乙基)-N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(0.500g，1当量，0.67毫摩尔)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油(0.496g，1.3当量，0.87毫摩尔/溶解在3mL THF中)和在乙腈中的0.45M四唑溶液(2mL，1.3当量，0.87毫摩尔)溶于3mL无水乙晴中。在环境温度下和在氮气下磁力搅拌该反应介质24小时。然后通过加入43mL在THF/Pyr/H₂O中0.02M二碘溶液氧化该混合物。在环境温度下12小时后，在真空下将溶剂蒸发掉并且使用泵在P₂O₅下干燥过夜。将残留物溶于8mL二氯甲烷中。然后，在5小时内将0.2mL的1，5-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)(1.3当量，0.87毫摩尔)加入到该反应介质。反应介质用0.1N HCl溶液然后用Na₂S₂O₃饱和溶液洗涤。有机相在真空下进行浓缩。通过快速色谱分离法(180mg)通过使用洗脱梯度(MeOH/DCM 98∶2直至1∶1)纯化后获得化合物。

产率为24％。

Rf：0.3(DCM/MeOH8∶2)

RMN 1H(300MHz，CDCl3)：δen ppm 0,88(t，6H，J＝6,9Hz，2＊CH₃)，1,25(m，48H，24＊CH₂)，1,42(dd，4H，J1＝8,4Hz，J2＝15,6Hz，2＊CH2)，1,90(s，3H，Me)，2,33(m，4H，2＊CH₂)，2,83(t，2H，J＝5,6Hz，H₂’)，3,84(m，1H，H3’)，4,09-4,35(m，7H，2＊CH₂(glycerol)，H₄’，H₅’)，5,27(s，1H，CH glycérol)，6,21(t，1H，J＝6,7Hz，H1’)，7,54(s，1H，H base).

RMN 13C(75MHz，CDCl3)：δen ppm 12,4(CH₃base)，14,1(CH₃)，19,6(CH₂)，19,7(CH₂)，22,6(CH₂)，24,8(CH₂)，29,1-29,6(CH₂)，31,9(CH₂)，33,9(CH₂)，34,1(CH₂)，61,5(CH₂)，61,7(CH₂)，62,5(CH₂)，62,6(CH₂)，66,1(CH₂)，66,2(CH₂)，69,1(CH)，78,8(CH)，85,5(CH)，86,1(CH)，111,3(Cbase)，136,8(CH base)，150,5(C＝O base)，164,1(C＝O base)，173,0(C＝O)，173,5(C＝O ).

RMN 31P(121MHz，CDCl3)：δen ppm 2,1.

质谱ESI-：理论m/z＝872.5观测m/z＝871.3。

实施例3

5’-(4-十六烷氧基甲基-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧胸苷

将200毫克如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(0.75毫摩尔)和在THF和水(1/1)的混合物中0.1M溶液形式的231毫克如在制备5中描述的1-炔丙氧基十八烷(1当量)引入到在烧瓶中。然后，依次加入：30毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.15毫摩尔)和12毫克的硫酸铜(0.1当量，0.075毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。在二氧化硅柱色谱分离法(AcOEt/MeOH 8/2)之后获得180毫克白色固体。

Rf：0.72(AcOEt/MeOH 8/2)

产率为42％。

高解析度MS[M+H]⁺：计算质量：576.4125，测定质量：576.4120

实施例4

5’-(4-十六烷氧基甲基-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’-二脱氧腺苷

将200毫克如在制备4中描述的5’-叠氮基-5’，2’-二脱氧腺苷(0.72毫摩尔)和在THF和水(1/1)的混合物中0.1M溶液形式的223毫克如在制备5中描述的1-炔丙氧基十八烷(1当量)引入到在烧瓶中。然后，依次加入：30毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.15毫摩尔)和12毫克的硫酸铜(0.1当量，0.075毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时，然后将该混合物冷却至环境温度。该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。在柱色谱分离法之后(AcOEt/MeOH 8/2)获得150毫克白色固体。

Rf：0.65(AcOEt/MeOH 8/2)

产率为35％。

RMN¹H(300,13MHz，CDCl₃)：δ0,89(t，j＝6Hz，3H，CH₃)，δ1,26(m，30H，CH₂)，δ1,55(m，2H，CH₂)，δ2,54(m，1H，CH₂)，δ3,06(m，1H，CH₂)，δ3,45(t，j＝6Hz，2H，CH₂)，δ4,50(m，4H，CH₂，CH)，δ4,89(m，？？？)，δ5,88(s，2H，NH₂)，δ6,40(t，j＝6Hz，1H，CH)，δ7,42(s，1H，CH)，δ7,81(s，1H，CH)，δ8,35(s，1H，CH).

高解析度MS[M+H]⁺：计算质量：585.4241，测定质量：585.4254

实施例5

5’-(4-(1-羟基-己基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧胸苷

将215毫克如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(0.8毫摩尔)和在THF和水(1/1)中0.1M溶液形式的101毫克辛-1-炔-3-醇(1当量)引入到在烧瓶中。然后，依次加入：31.5毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.15毫摩尔)和13毫克的硫酸铜(0.1当量，0.075毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。然后该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。通过柱色谱分离法(AcEt/MeOH 85/15)获得纯的化合物。获得255毫克白色固体。

Rf：0.48(AcOEt/MeOH 85/15)

产率为78％。

RMN¹H(300,13MHz，DMSO d₆)：δ0,83(t，j＝6Hz，3H，CH₃)，δ1,24(m，6H，CH₂)，δ1,68(m，2H，CH₂)，δ1,81(s，3H，CH₃)，δ4,06(m，1H，CH)，δ4,27(m，1H，CH)，δ4,62(m，3H，CH₂，CH)，δ5,2(d，j＝6Hz，1H，OH)，δ5,5(s，1H，OH)，δ6,17(t，j＝6Hz，1H，CH)，δ7,37(s，1H，CH)，δ7,89(s，1H，CH).

RMN ¹³C(75,47MHz，DMSO d₆)：δ12,5(CH₃)，δ014,4(CH₃)，δ22,6(CH₂)，δ25,1，δ31,7(CH₂)，δ38,4(CH₂)，δ51,6(CH₂-N)，δ66,0(CH-O)，δ71,3(C)，δ84,4，δ84,5，δ110,3(＝C-N)，δ122,8，δ136,4，δ150,9，δ152,4，δ164,1.

高解析度MS[M+Na]⁺：计算质量：416.1910，测定质量：416.1897

实施例6

5’-(4-(己基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧胸苷

将200毫克如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(0.75毫摩尔)和在THF和水(1/1)的混合物中0.1M溶液形式的82.65毫克壬-1-炔(1当量)引入到在烧瓶中。然后，依次加入：30毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.15毫摩尔)和12毫克的硫酸铜(0.1当量，0.075毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。通过柱色谱分离法(AcOEt/MeOH 8/2)获得纯化合物。获得130毫克白色固体。

Rf：0.62(AcOEt/MeOH 8/2)

产率为46％。

高解析度MS[M+H]⁺：计算质量：576.4125，测定质量：576.4120

实施例7

5’-(4-(庚基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧胸苷

将200毫克如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(0.75毫摩尔)和在THF和水(1/1)的混合物中的0.1M溶液形式的93毫克壬-1-炔(1当量)引入到烧瓶中。然后，依次加入：30毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.15毫摩尔)和12毫克的硫酸铜(0.1当量，0.075毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。通过柱色谱分离法(AcOEt/MeOH 85/15)获得纯化合物。获得120毫克白色固体。

Rf：(AcOEt/MeOH 85/15)

产率为41％。

RMN¹H(300,13MHz，CDCl₃)：δ0,83(t，j＝6Hz，3H，CH₃)，δ1,25(m，8H，CH₂)，δ1,55(m，2H，CH₂)，δ1,79(s，3H，CH₃)，δ2,10(t，j＝6Hz，2H，CH₂)，δ2,61(t，j＝6Hz，2H，CH₂)，δ4,06(s，1H，CH)，.δ4,27(s，1H，CH)，δ4,59(m，2H，CH₂)，δ5,5(s，1H，OH)，δ6,16(t，j＝6Hz，1H，CH)，.δ7,29(s，1H，CH)，δ7,82(s，1H，CH)，δ11,31(s，1H，NH).

RMN¹³C(75,47MHz，DMSO d₆)：δ12,6(CH₃)，δ14,4(CH₃)，δ22,5(CH₂)，δ25,4(CH₂)，δ28,9(CH₂)，δ29,0(CH₂)，δ29,4(CH₂)，.δ31,7(CH₂)，δ38,4(CH₂)，δ51,5(CH₂)，δ71,1(CH)，δ84,4(CH)，δ110(C)，δ123,1(CH)，δ136,5(CH)，δ147,4(C)，δ150,9(C＝O)，δ164,1(C＝O).

实施例8

5’-(4-(2，2-双十三烷基-[1，3]二氧戊环-4-基甲氧基甲基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧胸苷

将264mg如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(1毫摩尔)和在THF水混合物(1/1)中的0.1M溶液形式的500mg 4-丙-2-炔氧基甲基-2，2-双十三烷基-[1，3]二氧戊环(1当量)引入到在烧瓶中。依次加入：39.5毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.2毫摩尔)和16毫克的硫酸铜(0.1当量，0.1毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。然后该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。通过柱色谱分离法(AcEt/MeOH 8/2)获得纯化合物。获得550毫克白色固体。

产率为72％

高解析度MS[M+H]⁺：计算质量：774.5745，测定质量：774.5739

实施例9

5’-(4-(2，2-双十三烷基-[1，3]二氧戊环-4-基丁氧基甲基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧胸苷

将195mg如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(0.73毫摩尔)和在THF水混合物(1/1)中0.1M溶液形式的400mg的4-(4-丙-2-炔氧基-丁基)-2，2-双十三烷基-[1，3]二氧戊环(1当量)引入到在烧瓶中。依次加入：30毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.15毫摩尔)和12毫克的硫酸铜(0.1当量，0.073毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。通过柱色谱分离法(AcOEt/MeOH 9/1)获得纯化合物。获得180毫克白色固体。

Rf：0.43(AcOEt/MeOH 9/1)

产率为30％。

实施例10

5’-(4-((O-胆甾醇基)-甲基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧胸苷

将170mg如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(0.63毫摩尔)和在THF水(1/1)混合物中0.1M溶液形式的270毫克如在制备7中描述的o-炔丙基胆甾醇(1当量)引入到在烧瓶中。依次加入：20mg的抗坏血酸钠(0.2当量，0.13毫摩尔)和10毫克硫酸铜(0.1当量，0.063毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。通过柱色谱分离法(AcOEt/MeOH 8/2)获得纯化合物。获得260毫克白色固体。

Rf：0.57(AcOEt/MeOH 8/2)

产率为59％。

MS[M+H]⁺：692.3

实施例11

1，12-双-[5’-(4-(甲基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧胸苷]-氧十二烷

将100mg如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(0.375毫摩尔)和在THF水混合物(1/1)中0.1M溶液形式的52mg由在制备6中描述的化合物制备的1，12-二炔丙氧基十二烷(0.5当量)引入到在烧瓶中。依次加入：15毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.075毫摩尔)和6毫克的硫酸铜(0.1当量，0.0375毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。通过柱色谱分离法(AcOEt/MeOH 8/2)获得纯化合物。获得90毫克白色固体。

产率为59％。

RMN¹H(300,13MHz，MeOH d₄)：δ1,28(m，16H，CH₂)，δ0,83(m，4H，CH₂)，δ1,89(s，6H，CH₃)，δ2,17(s，2H，CH₂)，δ2,25(m，4H，CH₂)，δ3,51(t，j＝6Hz，4H，CH₂)，δ4,18(m，2H，CH)δ4,42(m，2H，OH)δ4,58(s，4H，CH₂)，δ4,76(qd，j＝6Hz，4H，CH₂)，δ6,21(t，j＝6Hz，2H，CH)，δ7,23(s，2H，CH)，δ7,99(s，2H，CH).

实施例12

5’-(4-(1(R)-羟基-己基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧胸苷

将215毫克如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(0.8毫摩尔)和在THF和水(1/1)混合物中0.1M溶液形式的101.5毫克辛-1-炔-3-醇(1当量)引入到在烧瓶中。依次加入：31.5毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.15毫摩尔)和13毫克的硫酸铜(0.1当量，0.075毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。然后该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。通过柱色谱分离法(AcEt/MeOH 9/1)获得纯化合物。获得240毫克白色固体。

Rf：0.48(AcEt/MeOH 9/1)

产率为76％。

高解析度MS[M+H]⁺：计算质量：576.4125，测定质量：576.4120

实施例13

5’-(4-(1(S)-羟基-己基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧胸苷

将215毫克如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(0.8毫摩尔)和在THF和水(1/1)混合物中0.1M溶液形式的101.5毫克(S)辛-1-炔-3-醇(1当量)引入到在烧瓶中。依次加入：31.5毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.15毫摩尔)和13毫克的硫酸铜(0.1当量，0.075毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。然后该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。通过柱色谱分离法(AcOEt/MeOH 85/15)获得纯化合物。获得255毫克白色固体。

Rf：0.48(AcOEt/MeOH 85/15)

产率为78％。

高解析度MS[M+H]⁺：计算质量：576.4125，测定质量：576.4120

实施例14

5’-(4-(1-羟基-己基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧腺苷

将200毫克如在制备3中描述的5’-叠氮基-5’-脱氧胸苷(0.75毫摩尔)和在THF和水(1/1)混合物中0.1M溶液形式的95毫克辛-1-炔-3-醇的外消旋混合物(1当量)引入到在烧瓶中。然后，依次加入：30毫克的抗坏血酸钠(0.2当量，0.15毫摩尔)和12毫克的硫酸铜(0.1当量，0.075毫摩尔)。搅拌该反应介质并且在60℃加热5小时。然后将该混合物冷却至环境温度。该反应介质直接被吸附到二氧化硅上，并且通过蒸发去除溶剂。通过柱色谱分离法(AcOEt/MeOH 8/2)获得纯化合物。获得240毫克白色固体。

Rf：0.47(AcOEt/MeOH 8/2)

产率为80％。

高解析度MS[M+H]⁺：计算质量：576.4125，测定质量：576.4120

实施例15：制备纳米颗粒

在实施例2中制备的化合物胸苷3’-(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)(di C16dT)用作式(Ⅰ)化合物和二油基磷脂酰胆碱(DOPC)用作共-类脂。

1)制备母液

-a)制备顺铂溶液

将15毫克顺铂溶解在10mL milliQ水(5mM)中。搅拌该悬浮液1分钟(旋涡)，然后在37℃温育24小时。

-b)制备类脂溶液

溶液A：将20mg diC16dT溶解在2mL氯仿(10mg/mL)中。在-20℃储存该样品。

溶液B：DOPC：在氯仿中20mg/mL溶液，在-20℃储存。

2)制备类脂配制剂

使52.3μL溶液A与23.6μl溶液B在2mL试管中混合。这些体积对应于1/1的摩尔比。

在氮气下蒸发掉氯仿以获得均匀的类脂膜。

3)制备纳米颗粒

在37℃预温育的1.2mL顺铂溶液用于再水合预先制备的类脂膜。在37℃温育该混合物30分钟。进行一系列10个加热(在45℃的水浴)和冷冻(干冰/甲醇-78℃)周期。

4)洗涤和回收纳米颗粒

一旦完成该系列10个周期，在4℃在2100rpm离心该试管5分钟。在去除上清液之后，将沉淀物再悬浮在1mL MilliQ水中。进行第二次离心(2100rpm在4℃达5分钟)，然后除去上清液并且干燥沉淀物。

再悬浮在1mL MilliQ水中的沉淀物的浓度(ICP/光学)为2.844mM当量顺铂(852.2mg/L)。该浓度对应于最初使用的47.4％顺铂。

实施例16：制备纳米胶囊

在实施例2中制备的化合物胸苷3’-(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)(di C16dT)用作式(Ⅰ)化合物和二油基磷脂酰胆碱(DOPC)用作共-类脂。

1)制备母液

-a)制备顺铂溶液

将15毫克顺铂溶解在10mL milliQ水(5mM)中。搅拌该悬浮液1分钟(涡旋)，然后在37℃温育24小时，偶尔搅拌。

-b)制备类脂溶液

溶液A：将20mg di C16dT溶解在2mL二氯甲烷(10mg/mL)中。在-20℃储存该溶液。

溶液B：DOPC：在二氯甲烷中的20mg/mL溶液，在-20℃储存。

2)制备类脂配制剂

使52.3μL溶液A与47.2μl溶液B在2mL试管中混合。这些体积对应于1/1的摩尔比。

使用压缩氮气将二氯甲烷蒸发掉以获得均匀的类脂膜。

3)制备纳米颗粒

在环境温度下使用预先制备的类脂膜温育1.2mL顺铂溶液(5mM)过夜，不搅拌。进行一系列10个加热(在45℃水浴)和冷冻(干冰/乙醇-78℃)周期。

4)洗涤和回收纳米颗粒

一旦完成该系列10个周期，搅拌该悬浮液并且放置在玻璃溶血管中，然后使其经受超声处理达5分钟。在超声处理后，在1000rpm/2.5分钟/20℃离心该悬浮液以取出大胶囊，其位于将被去除的沉淀物中。在10000rpm/5min/20℃再离心该上清液。纳米颗粒位于沉淀物中。将后者再悬浮在1mL MilliQ水中并且进行第二次离心。将该沉淀物悬浮在1mL中并且在电感耦合等离子体(ICP)-光学中进行测定。

实施例17：稳定度测试

根据实施例16的方案制备的纳米颗粒通过ICP-光学进行测定(测定值对应于总浓度)。将纳米颗粒的悬浮液等分到5个管(150μL)中。在搅拌(300rpm)下，后者在37℃温育不同时间(0，2.5，5，10和24小时)。

在给定时间(x)，以14000rpm/10min/20℃离心该管并且测定50μL上清液(小心回收以便不使沉淀物再悬浮))。

根据与对比例相同的方案制备基于1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-[磷酸-L-丝氨酸](DOPS)与1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DOPC)(作为共-类脂)的纳米颗粒。

顺铂递送百分比根据以下方程式进行计算：

递送的顺铂％＝Cx-C0/Ct-C0

Cx：在给定时间(x)得到的浓度

C0：在温育之前在上清液中得到的浓度。

Ct：不温育和不离心时得到的总浓度。

作为温育时间的函数的顺铂的递送曲线在图1中表示。实施例16的纳米颗粒由符号-o-表示和基于DOPC/DOPS的纳米颗粒由符号-▲-表示。

结果表明，对于根据本发明的纳米颗粒半衰期(释放50％顺铂所需的温育时间)大于24h，而对于基于DOPC/DOPS的纳米颗粒为约6.5h。

实施例18：测量纳米颗粒的尺寸

根据实施例16的方案制备的纳米颗粒使用MALVERN zétasizer粒度仪进行分析。

将纳米颗粒悬浮在2mL MilliQ水中(尺寸测量所需的体积)。浓度为大约0.5mM(悬浮液必须是浑浊的以散射光)。使用一次性小池(1cm/1cm)用于该测量。

结果表明大于95％的纳米颗粒具有100-250nm的尺寸与0.228的多分散性。

实施例19：测定细胞内的顺铂

方案

80％汇合(直径10cm盘)的IGROV1细胞(卵巢恶性腺瘤系)用100μM游离的顺铂或者封装在实施例16的纳米颗粒中的顺铂处理2、4或6小时。在该处理结束时，用PBS进行两次洗涤。细胞用胰蛋白酶处理并且再悬浮在PBS中。进行用PBS两次洗涤该细胞悬液(1000rpm/1min离心)。将细胞悬浮在1mL PBS中并且计数。

ICP光学测定

用500μL细胞溶解溶液(来自SIGMA的溶胞缓冲液)对10⁶个细胞进行细胞溶解。体积用具有1％HNO₃酸的MilliQ水补充至5mL。

结果

结果示在图2中，其显示在细胞溶解之后随时间释放的顺铂的浓度，其对应于在处理的细胞中内在化(internalisé)的顺铂的浓度。

对于每个时段，阴影线柱(在左边)对应于游离的顺铂和斑点柱(在右方)对应于包含顺铂的纳米颗粒。

结果表明，顺铂的内在化(internalisation)在纳米颗粒存在下是明显更有效的。例如，在相同条件下(10⁶细胞，100μM，2h)，在游离的顺铂情况下，0.5纳摩尔顺铂被内在化，而在纳米颗粒情况下该内在化大4.5倍(2.3纳摩尔)。

实施例20：根据本发明制备的纳米颗粒的细胞毒性作用的研究

纳米颗粒根据在实施例15中描述的方法进行制备。使用下式的化合物C20dT用作式(Ⅰ)的化合物

其中n＝18，

该化合物描述在Nathalie Campins等，New J.Chem 2007，31，1928-1934中。

方案

实施的测试使用人类癌细胞系HCT8(结肠直肠恶性腺瘤)，其由于它对铂衍生物的固有抗性而已知。

方案如下：

-在J3，细胞以每孔50000个细胞的密度植入96孔板中。

-在J0，细胞用测试配制剂进行处理，或者在生理血清中的短接毒时间(durée d’exposition)(30分钟)，或者在培养基中长接毒时间(72h)。进行的浓度范围包括点0-0.4-0.8-1.5-3-6.25-12.5-25-50和100mg/L。同时进行负对照(未经处理的细胞)和正对照(顺铂)。

-在J3，改变培养基，停止该72h处理。

-在J6，结束该方案，保留在孔底部的细胞用结晶紫染色。

结果的表达

测定细胞的存活，在不同测试配制剂浓度获得的总死亡百分比(或者细胞毒性)与由负对照(未经处理的细胞)得到的相当。细胞毒性结果以效果-剂量曲线形式表示，其通过它们的抑制浓度50(CI₅₀)(即观测到50％死细胞时的浓度)进行表征。

在30分钟时的初步结果(CI₅₀)

结果如下表1所示。

表1

结果表明，包含式(Ⅰ)化合物C20dT的根据本发明的纳米颗粒在该测试中在30min具有显著低于单独使用顺铂的剂量的细胞毒性(用CI₅₀表示)。

实施例21：根据本发明制备的纳米颗粒的细胞毒性作用的研究

以下化合物用作式(Ⅰ)化合物：

-实施例2的diC16dT(胸苷3’-(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)和共-类脂(DOPC)，或

-实施例12的5’-(4-(1(R)-羟基-己基)-[1，2，3]三唑-1-基)-5’，2’二脱氧-胸苷，但没有加入共类脂。

纳米颗粒根据在实施例15中描述的方法进行制备，但是使用对于实施例12的化合物单个加热/冷却周期。

方案

每孔1000-5000个IGROV1细胞在100μL具有血清的培养基中进行培育(96孔板)。在24h之后将培养基取出和用根据本发明的配制剂和/或游离的顺铂(以期望浓度)处理细胞1-3天。细胞在37℃在200μl具有血清的培养基中进行培育。细胞成活力通过在该处理结束时MTS比色测定进行显示。

结果的表达

测定细胞的存活，在不同所测试的配制剂浓度获得的总死亡百分比(或者细胞毒性)可与使用负对照样品(未经处理的细胞)得到的死亡总百分比相当。细胞毒性结果以效果-剂量曲线形式表示，其通过它们的抑制浓度50(CI₅₀)(即观测到50％死细胞时的浓度)进行表征。

结果示于下面表2，其中CI50用顺铂的μM或者用mg/L表示(温育时间：24h)

表2

结果表明包含式(Ⅰ)化合物、在存在或不存在共-类脂下制备的根据本发明的纳米颗粒在该测试中在24h具有显著低于单独使用的顺铂的剂量的细胞毒性(用CI₅₀表示)。

实施例22：根据本发明制备的纳米颗粒的细胞毒性作用的研究

方案

a/细胞的准备和处理：

在96孔板中每孔2500个细胞(IGROV1，SKOV3，卵巢恶性腺瘤系)在100μL具有血清的培养基中进行培育。在24小时后，吸出培养基，细胞用在100μl不含血清的培养基中具有不同浓度(500，100，10，1，0.1，0.01，0.001M)的游离顺铂或者封装在实施例16的纳米颗粒中的顺铂进行处理。在处理24小时后，除去培养基并且细胞用100μL PBS洗涤两次然后用100μL具有血清的培养基进行培育。

b/毒性的显示

在该两次洗涤之后48小时，细胞成活力通过加入20μL MTS进行显示。在37℃培育2-4小时之后测量在490nm的吸光度。吸光度与细胞成活力成正比例。

c)结果：

结果显示在图3中，其显示用游离顺铂(柱A)或者包含顺铂的纳米颗粒(柱B)获得50％细胞死亡所需的浓度(CI50)。

图3A涉及IGROV1细胞系和图3B涉及SKOV3细胞系。

结果表明，在两个细胞系IGROV1(对顺铂敏感)和SKOV3(抗顺铂)中，包含顺铂的实施例16的纳米颗粒是比游离顺铂更有效的。

对于细胞系IGROV1，由0.27μM包含顺铂的纳米颗粒得到50％细胞死亡，而必须使用2.41M游离顺铂以获得该结果。对于细胞系SKOV3，用0.54μM包含顺铂的纳米颗粒得到50％细胞死亡，而需要4.3μM游离顺铂。

对于细胞系IGROV1和SKOV3，包含顺铂的纳米颗粒比游离顺铂效力分别高9和8倍。