用于皮肤创伤愈合的红细胞生成素的局部施用和配制剂

摘要

本发明涉及红细胞生成素(EPO)的用途，特别是EPO在使活性物质稳定的基于聚合物的药物制剂中用于创伤皮肤的治疗，特别是用于机械或病理损伤或者烧伤的创伤愈合。本发明也特别涉及特定的特别是基于多糖(优选纤维素衍生物)的粘性的或凝胶状的配制剂，其包含EPO并能够使其稳定，且缓慢和均匀地在创伤处释放。

说明书

技术领域：

本发明涉及红细胞生成素(EPO)的用途，特别是EPO在使活性物质稳定化的药物配制剂中用于创伤皮肤的局部治疗，特别是用于机械或病理损伤或者烧伤的创伤愈合。本发明特别针对以本发明的稳定形式基于亲水性聚合物的EPO用于刺激特定细胞类型分化和生长的用途，例如分别出现在这类皮肤损伤的直接创伤部位的非血管前体细胞的组织特异性的前体细胞，或者非内皮细胞的成熟组织特异性细胞。

特别是，本发明还涉及特定的基于多糖的粘性的或凝胶状的配制剂，特别是纤维素衍生物，其包含EPO并能够使其稳定且缓慢和均匀地在创伤处释放。

技术背景

红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白激素，其控制由骨髓中的前体细胞生成红细胞(红细胞生成)。EPO在此与在所有造血细胞中表达的受体(EPO-R)结合。

在成人中，红细胞生成素主要在肾脏形成，更确切地说在肾小管周围毛细血管的内皮细胞。少量的也在肝细胞(Hepatozyten)中合成。

EPO的主要作用是，提高血液中红细胞的数量，以导致氧摄入的提高。

近些年，不同的作者报导，EPO也发挥非造血的作用，而所述EPO-R相应地也在特定的非造血细胞中表达。例如，通过EPO刺激神经细胞、脑的神经元细胞和内皮细胞被报道，其中在一些情况下与造血EPO受体的直接表达相联系。在其它情况下，预计存在另一种非造血的受体，但这还没有被证实。

特别是在不久前得知的EPO的非造血作用与例如内皮细胞和组织细胞，如结缔组织、肌肉组织、上皮组织和神经组织的刺激生成和再生相关联，被赋予越来越重要的意义。

例如，WO 2004/001023尤其是描述EPO和TPO用于刺激血管新生和组织再生和改善创伤愈合，例如在手术和受伤后。

在WO 2005/063965中教导了EPO用于创伤组织有目的的结构控制性再生，其中不仅刺激内皮细胞的生长，而且还促进实质再生和壁结构(Wandstrukturen)生成，使得出现协调三维生长以构建功能性组织、器官或其部分。

Haroon等人(American J.Pathol.2003，163，993)讨论了EPO在通过纤维蛋白促使创伤愈合的过程范围内的新作用。

在一篇综述文章中，Brines和Cerami(Kidney International，2006)讨论EPO在组织保护中的作用。

红细胞生成素和EPO衍生物或还有EPO模拟物看似在全身应用中也出色地适用，从而能够在皮肤、粘膜受伤，在开放性皮肤和皮肉伤或者也在由烧伤或烫伤引起的皮肤刺激中，有目的地启动和控制所涉及组织的新生和再生，并且能够最终促进和加快愈合。

WO 2005/070450和有关发明人的其它论文描述了EPO在血管和组织再生中以周剂量小于90IE/kg体重(＝KGW)，尤其是也用于包括在创伤护理领域。即使在此理论上述及可能的局部应用，然而已经发现，全身施用是优选的。

因此假设，在全身施用时EPO以继发性红细胞增多症的小于90IU(国际单位＝Units)/kg体重(KGW)的周剂量给药，代替如到目前为止熟知的EPO-应用中常规的150-300IU/kg体重。由此应该达到，较小地刺激在骨髓区中的造血，但根据如所描述的新教导，活化血液区中的内皮祖细胞是可能的。内皮细胞前体细胞在血液还有在组织中的活化和内皮细胞的发育，其形成血管的最内层的细胞层，与血管形成的改善相关联并假设，由此使组织再生也成为可能。这在临床试验期间在烧伤的情况下得以证明。

即便在一些所述论文中提到了EPO的局部应用以使组织再生，但活性物质的全身施用明显很重要，因为基于结果，根据新的论文的观点所发现的非造血EPO效果首先归因于相应的内皮的、血管的或CD31-阳性前体细胞新发现的刺激，其与血流一起循环，其次才归因于由此刺激的实质的组织结构的生长。

然而，EPO在全身施用中应用于组织保护或组织再生，由于有关造血效果的副作用，实施是有显著风险的。

在EPO的局部应用中，根据到目前为止教导的观点，从所提及的全身通过EPO产生的细胞或前体细胞不足的分布和可达性，对于组织再生观察不到效果或仅仅观察到不令人满意的效果。

在例如烧伤或烫伤后的组织再生的情况下，或者在局部缺血性创伤的情况下，达到迅速的缺损封闭是必需的。这只能在尽可能快地刺激皮肤实质部分形成时发生。为了使之后另一种成分(实质)的生成成为可能，对成分(CD31)进行时间-转换刺激，相应于WO 2005/070450的作者以及其它的出版物的教导。

虽然血管网的生成可以间接地起支持作用，但是就此而言并不是最终结果，因为实质缺乏且在某些条件下只能继发地并因此延迟地生成。

血管细胞的生成也必须与局部组织的生成同时相协调。在此，根据传统教导出现困境，因为经皮下或经静脉施用的剂量基于全身分布原则以内皮祖细胞为目标，且为了限制副作用必须附加给予继发性红细胞增多症的剂量。因此，在这种情况下，EPO的给予只能困难地与局限于皮肤创伤部位的局限性药物动力学相结合。

相应于传统教导，因此必须选择抽象的刺激途径，其中要么必须以继发性红细胞增多症的剂量给药，要么必须重复地注射或改变源物质半衰期。

但是，在每种情况下，EPO将在身体中全身分布，并且通过血流进一步稀释地到达本来的需要部位。

此外，在创伤的情况下产生了使EPO的局部应用困难的过程：通常，创伤愈合例如受伤皮肤或粘膜的创伤愈合经过三期：发炎期、增生期和修复/变异期。在应受护理的新伤口或皮肤受伤的情况下，在最初24小时发生发炎过程，其主要包括不同发炎因子(例如纤维连接蛋白)和不同类型的细胞，例如单核细胞、吞噬细胞、多形细胞和巨噬细胞的移入，并最终导致形成纤维蛋白基质和血管内皮细胞。在此产生的创伤分泌物尤其含有一系列的蛋白质水解酶以及侵入创伤中的含有起相关作用的物质的细菌。

一部分高活性的蛋白质水解酶是，在创伤上施涂的促进创伤愈合的含有蛋白质或肽的药物，如EPO，经常有少许或完全没有效果的原因，因为所涉及的蛋白质或多肽由于其化学和生物性质，在其能够发挥足够的药理学的功效之前，被所述的酶灭活、裂解和降解。通过伤口被细菌感染和细胞碎片的入侵使所述问题额外地强化。

尤其出于这个原因，药物蛋白通常全身施用，由此可以显著延长其半衰期，并使其更快地向其应该发挥它的治疗功效的身体部位运输。但是在这种施用方法中，含有蛋白质的活性物质的剂量必需足够高，以便达到所期望的治疗效果，这经常不可避免地导致不期望的副作用。

此外，在治疗性处理皮肤伤害的情况下显示，活性物质的全身施用原则上是较不适用的，因为药物的治愈效果实际上仅在局部是必需的。因此，当使用含有蛋白质的活性物质以治疗皮肤伤害和开放性皮肉和皮肤创伤时，存在普遍的问题。

以局部形式应用蛋白质和多肽，例如EPO，其本身在血浆中具有仅48小时的半衰期，对于治疗这类皮肤伤害，如在过度机械作用和刺激的情况下以及在烧伤和烫伤情况下可能出现的这类皮肤伤害，EPO是十分理想的，尽管有熟知的难度。

因此，存在以下任务，即，提供EPO或其生物等效的衍生物、片段、模拟物等以局部应用的形式用于皮肤的创伤愈合，而一方面不发生，如上所述的，通过EPO基于在创伤处的酶促或其它过程的蛋白水解的显著效果损失；另一方面，同样如上文详细阐明的，通过局部施用EPO，使得可能对在直接创伤区并尽可能地也对在创伤周边区域较深组织层中的能够使创伤愈合的细胞或前体细胞进行刺激，其最终应该导致较快的创伤闭合，并且使EPO的局部应用首次显得有意义，并展示相对于全身施用的显著优点。

此外，本发明的目的是实现一种给药形式，其不必遵循EPO的全身特别是继发性红细胞增多症的剂量的风险和限制，且同时可以特异性地作用于实际的组织相关细胞，而与此同时不把局部化的成熟内皮细胞排除在外。

发明概述

现在，令人惊讶地发现，EPO优选以适合的使活性物质稳定化并均匀给予配制剂局部应用于皮肤的创伤或者由病理上引起的损伤是有效的，其中该效果，如尤其是也在组织学试验中显示的，没有或几乎没有归因于已知的预计的可以在血液循环和向创伤运输的内皮前体细胞和其它前体细胞的活化(这对争取达到的效果是不够的)，而是明显通过EPO引起的刺激局部化的，即直接创伤区或在创伤扩展的周围环境中的细胞，其中令人惊讶的是这些皮肤组织中的细胞主要功能性地促使创伤愈合，所述细胞为实质，即不是血管细胞或其前体细胞，而且也主要不是位于创伤组织中的内皮细胞或其前体细胞。

通常发现，特别是这些在创伤区的细胞(其不带有或只不明显带有，不表达或者只不明显表达内皮细胞表面标记物CD31)被通过局部施用EPO直接和区域性刺激分化和生长。

CD31通常发现于内皮细胞或血管细胞、血小板、巨噬细胞、粒细胞、T细胞、NK细胞、淋巴细胞和纤维原细胞。表达CD31的细胞被看作是新生血管生成因子。在组织中所述血管为如河流一样穿过组织那样的结构，但决不代表组织本身。该血管细胞和其前体细胞具有如CD31的表面标记，以此与其它细胞是可精确区别和界定的。皮肤的实质部分为CD31阴性细胞类型如角化细胞、发根细胞以及真皮细胞如结缔组织细胞。优选通过局部施用EPO直接和原位(vor Ort)刺激CD31阴性细胞，特别是角化细胞、发根细胞和结缔组织细胞，或者仅少量表达CD31的细胞。所述进一步的作用效果是新的且既区别于已知的EPO造血效果又区别于近期发现的非造血的并全身证明的机理(参见上文)。

关于这一点应该着重强调，特别是全身施用红细胞生成素及其衍生物和类似物在皮下或静脉内给药的情况下，仅导致在皮肤创伤部位不足或短期的效果，尤其该全身的概念忽略了完全独立于血管细胞的组织特异性干细胞的重要性。

根据本发明，首次通过局部的EPO给药直接刺激局部的皮肤附件中的区域化前体细胞和皮肤隐窝干细胞(Stammzellkrypten)。此外发现，通过由EPO引起的上述CD31阴性细胞的刺激还刺激在皮肤创伤区的CD90阳性细胞和巢蛋白阳性细胞。CD90是干细胞和神经元前体细胞的标记蛋白，而巢蛋白是对于神经细胞的标记物。创伤区的CD73阳性细胞也直接通过EPO被同时刺激。所以局部施用EPO能够刺激直接创伤区几乎所有重要的、对治愈皮肤创伤必需的细胞生长。

根据本发明，在局部施用EPO和其等效或类似效果的衍生物和类似物的应用中完全独立于现有技术的继发性红细胞增多症的剂量需求的规定和限制，导致直接刺激皮肤中必需的创伤愈合特异性细胞和前体细胞，所述EPO优选以基于聚合物，特别是亲水性聚合物的适合的配制剂。这一点的实现不依赖于，在常规的全身施用形式的情况下不可避免发生的对整体器官中的内皮祖细胞的作用。这种全身作用通常由于出现的造血效果(红细胞数量的增多，骨髓中造血升高，血栓风险的提高等等)是不期望的。

此外，根据本发明局部应用的EPO不引起或不广泛引起对在全身血液循环中的血管的或内皮的前体细胞的刺激。该直接的对邻近创伤的细胞的刺激具有优点在于，局部皮肤的和创伤的环境一方面通过例如蛋白酶限制全身吸收，所述蛋白酶降低EPO在进入全身循环范围之前的降解，而使区域化的高活性物质浓度成为可能。EPO的量，其在常规的全身施用形式下意味着浓度为250IU EPO/kg体重且更高，可以毫无问题的施用而不出现相应上述不期望的EPO作用。为此对于组织再生领域的治疗广度被显著地扩大了。此外，共刺激效果可以由局部EPO给药通过仅区域化以高浓度存在的创伤因子启动。

因此本发明的主题为：

●红细胞生成素或者其生物等效衍生物或类似物(EPO)之一以使活性物质被稳定并被均匀释放的药物配制剂形式用于制备局部应用药物的用途，所述药物配制剂优选基于具有至少部分亲水性的聚合物，所述局部应用的药物通过有目的地刺激非血管前体细胞的组织特异性前体细胞和非内皮细胞的成熟组织特异性细胞，并在每种情况下区域特异性地积聚于创伤皮肤的直接创伤区，用于创伤皮肤的缺损封闭和/或创伤皮肤的上皮再生。

●相应的用途，其中所述局部应用的EPO不引起或不广泛引起对在全身血液循环中的血管的或内皮的前体细胞的刺激。

●相应的用途，其中上述通过局部应用EPO刺激的细胞不表达或仅少量表达CD31抗原。

●相应的用途，其中皮肤的上皮再生实现20-70％，优选20-50％，特别是30-40％地快于在相同条件下通过以未稳定化形式的EPO的上皮再生。

●相应的用途，其中皮肤的上皮再生实现20-50％，优选30-40％地快于在相同条件下通过无EPO的药物配制剂的上皮再生。

●相应的用途，其中所述局部应用的EPO刺激角化细胞和/或发根细胞和/或结缔组织细胞的分化和生长。

●相应的用途，其中所述局部应用的EPO附加地刺激直接创伤区的CD90阳性和/或巢蛋白阳性细胞的分化和生长。

●相应的用途，其中所述局部应用的EPO刺激神经元前体细胞和/或神经细胞的分化和生长。

●相应的用途，其中所述局部应用的EPO刺激在创伤局部环境中位于较深的组织层的相应前体细胞。

在EPO全身给药时的主要问题之一是，在一方面考虑全身的副作用，另一方面是高活性物质浓度使用的必需性的情况下达到在局部范围足够高的组织保护效果。

因此，本发明的目的也是创造一种施用方法和一种可以使EPO和其类似物尤其有效地局部应用的载体材料。

令人惊讶地发现，当所述活性物质在使其稳定的药物制剂或配制剂中提供于局部施用时，所述局部施用的EPO和其生物等效衍生物和类似物的作用效果尤其显著，其中所述配制剂或制剂应该具有进一步的特征，使所述活性物质可以尽可能均匀且相对缓慢地在创伤处释放(缓释)。

令人惊讶地发现，形成凝胶的亲水性高粘性的聚合物如纤维素衍生物、卡波姆、脂肪醇或大粒凝胶(聚乙二醇)或它们的混合物，优选形成凝胶的多糖，特别是选自纤维素醚类和纤维素酯类的组，作为在相应的局部应用的含有EPO的制剂如软膏、霜剂、糊剂或凝胶中对EPO和其衍生物起稳定化作用的载体材料或配制剂基体，优选地，在相应的局部应用的EPO制剂中显示使EPO稳定的效果。在此，所述活性物质均匀地分布在保护它的粘性的、已膨胀的、聚合的或凝胶状的基质，优选多糖基质中，而且活性物质从该基质中在创伤处均匀和缓慢地释放，在其中它能够直接地和即刻发挥它的效果，而不发生被蛋白质水解酶显著降解。

有趣的是，具有大于20,000mPa s，优选大于30,000mPa s，尤其是在20,000和100,000mPa s之间，优选在40,000和60,000mPas之间的相对高粘度的含有EPO的凝胶，其显示比具有粘度值小于20,000mPa s，特别是小于10,000mPa s的较低粘性的凝胶更有利的结果。该粘度值可以在凝胶中获得，其中形成凝胶的聚合物具有份额为2-4重量％，优选2-3％，但不显著更少的多糖-凝胶形成剂。

凝胶配制剂表明特别有利的是，其包含至少一种可膨胀的多糖作为凝胶形成剂，所述多糖选自羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素和羧乙基纤维素组成的组。该配制剂优选含有羧甲基纤维素和/或羟乙基纤维素，或由它们组成。

除了基于多糖的凝胶状组分如纤维素或还有藻酸盐以外，原则上具有亲水性总体效果和必需的粘性的其它可膨胀的聚合物也是适合的，如在很多商购可得的配制剂(例如凝胶、糊剂、软膏)中使用的那些。

疏水性聚合物也可以是高粘性的基质，例如基于聚丙烯酸酯或聚氨酯，其中构入包含活性物质的多糖构成的水凝胶态颗粒，所述多糖如羧甲基/乙基纤维素、明胶或果胶。

在根据本发明的有利的凝胶-配制剂中的EPO显示超过30天的长时间段内是稳定的(附图1)，而在浓度可比较的EPO水溶液(0.9％的NaCl)中EPO的含量在20天后降低约80％。

相比之下，与不含EPO的根据本发明的配制剂相比，用含有EPO的根据本发明的配制剂治疗的创伤的愈合快约10-50％，优选20-40％。例如在用含有EPO的本发明的配制剂4-8天后通过上皮再生达到介于92和99％的创伤愈合，而在相同条件下，用不含EPO的根据本发明的配制剂仅达到最多85-87％的创伤愈合。

因此，本发明的主题为：

●基于至少一种形成凝胶的具有至少20,000mPa x s的粘度的亲水性聚合物的粘性配制剂，其包含红细胞生成素或其生物等效的衍生物或类似物(EPO)之一，且能够将它们均匀释放到亲水性的周围环境中。

●相应的粘性配制剂，其具有至少30,000mPa x s的粘度，优选40,000至60,000mPa x s的粘度，

●相应的粘性配制剂，其优选包含作为亲水性聚合物的纤维素衍生物，特别是选自下组的多糖：羟烷基纤维素和/或羧烷基纤维素，和基于聚丙烯酸酯或聚氨酯的疏水性聚合物基质，

●基于至少一种膨胀性多糖的凝胶状或粘性配制剂，所述多糖选自羟烷基纤维素和/或羧烷基纤维素，所述配制剂包含红细胞生成素或其生物等效的衍生物或类似物(EPO)，

●相应的配制剂，其通过将EPO以冻干、溶解或悬浮的形式与预先膨胀的多糖混合而获得，

●相应的配制剂，其中完成膨胀的多糖具有5000-100,000mPax s，特别是20,000-50,000mPa x s的粘度，

●相应的配制剂，其中以0.4至4重量％，特别是2-3％的浓度使用多糖，

●相应的配制剂，其中所述多糖是纤维素醚和/或纤维素酯类并选自下组的一个或多个成员：

--羟乙基纤维素

--羟甲基纤维素

--羧乙基纤维素

--羧甲基纤维素

●优选的配制剂，其包含作为凝胶形成剂的可聚合的羟乙基纤维素和/或羧甲基纤维素，

●相应的配制剂，其以100至500IU/g凝胶配制剂的浓度包含EPO，特别是150至300IU/g凝胶配制剂，优选150IU/g凝胶配制剂，

●相应的配制剂，其包含0.5g至5g凝胶配制剂/cm²创伤面积，优选1g至3g凝胶配制剂/cm²创伤面积，特别是1.0g/cm²创伤面积，

●相应的配制剂，其取决于所使用的凝胶量，具有以下的EPO量，其相当于在约100cm²的创伤面积的情况下，全身给药约50-2200IU/kg体重(KGW，标准体重70kg)，或对于创伤面积200cm²，约100-4500IU/KGW，和对于创伤面积约300cm²，约150-6000IU/KGW。

●相应的配制剂，其视创伤的大小或创伤面积(1cm²至300cm²)而定，包含约50至约450,000IU量的EPO，平均约500至300,000IU，优选1500至60,000IU，特别是3000至10,000IU，

●相应的配制剂，其额外地包含至少一种其它活性化合物，其优选起抗菌的、抗病毒的、抗真菌的或消炎的作用，用作蛋白酶抑制剂或对创伤愈合是重要的。

●相应的配制剂，其额外地包含至少一种合成聚合物，

●相应的配制剂，其额外地包含一种或多种助剂，

●相应的配制剂，其引入固体载体基质之中或之上，其调节活性物质的释放，且特别是EPO均匀释放到创伤皮肤的创伤区。

●相应的配制剂，其中固体载体基质是贴剂、箔、薄膜、绷带、纱布，但是特别是三维结构的贴剂，其能够稳定化并保护配制剂本身。

●药物试剂盒，其包含至少两个分开的包装单元，其中第一个单元包含至少一种膨胀性聚合物和第二个单元包含至少冻干EPO及其相应的衍生物。

根据本发明的配制剂可以用于局部和区域性治疗人和动物的受伤皮肤以及不同原因的皮肤疾病。根据本发明的配制剂也可以特别是在牙科中使用和/或用于基础医学或者兽医学中改善创伤愈合。根据本发明的配制剂也可以用于局部治疗术后或创伤后的伤口感染和烧伤、术后败血症、发炎和/或感染的溃疡、慢性局部缺血性创伤、急性或慢性的皮肤感染或皮肤病、痤疮、酒渣鼻、牛皮癣或者粘膜溃疡，或粘膜创伤，如粘膜-骨创伤(Schleimhaut-Knochenwund)中，特别是在颌区或齿区。

本发明的主题因此也是上下文特定的配制剂用于制备药物制剂的用途，其用于通过皮肤上皮再生局部地并区域性地治疗创伤和使创伤愈合，特别是用于烧伤或皮肤、粘膜、骨的创伤和牙科领域的创伤的治疗和愈合。

附图简述

附图1：含有EPO的制剂的稳定性研究

如由附图1可以得知的那样，在研究期间EPO含量在90-100％净含量(150U/ml)的范围内变动，从而认为所述制剂和相应的水凝胶在制备后4周时间内的稳定性。

与此相反，含有食盐的溶液(在水中0.9重量％的NaCl与40U/ml的EPO)显示在实验期间内显著的EPO降解，以至于在第三和第四周后能够确定仅有在20％和30％之间的净含量。

附图2：

该图以％描述受伤大鼠皮肤的上皮再生，其用根据本发明的配制剂(羧甲基纤维素3％)不含EPO(对照/安慰剂，凝胶F-左柱图)和含有EPO(大约0.3g凝胶：150IU/g凝胶＝大约200IU/体重，凝胶E-右柱图)处理4天。

结果以表格形式(上图)和图形(下图)描述。

附图3：

该图以％描述受伤大鼠皮肤的上皮再生，其用根据本发明的配制剂(羧甲基纤维素3％)不含(对照/安慰剂，凝胶F-左柱图)和含有EPO(大约0.3g凝胶：150IU/g凝胶＝大约200IU/体重，凝胶E-右柱图)处理8天。将绷带/贴剂(Pflaster)4天后更换一次且创伤用新鲜的凝胶处理。在用根据本发明的配制剂处理8天后皮肤将近100％恢复。

结果以表格形式(上图)和图形(下图)描述。

附图4：

附图4描述经用如实施例8中描述的凝胶处理8天后的创伤愈合的组织学研究。在此通过相应染色的表达CD31蛋白和巢蛋白的细胞来描述。

结果显示，相比用对照配制剂，在用EPO处理的情况下，上皮层厚显著提高。就此可以看出，上皮的新生基本上与CD31阳性(被染色的)细胞增多无关，但一定程度上与巢蛋白阳性细胞有关。

附图5：

附图5是一位糖尿病患者的慢性局部缺血性三级外踝溃疡，在用含有3,000IU EPO的根据本发明的配制剂局部施用三次(总计9,000IU)后，愈合的照片证据。下图描绘了15天后的进展(实施例16)。

附图6：

附图6以照片显示一位患者在分层植皮后通过用一次性施用引入根据本发明的水凝胶中的3,000IU EPO(实施例17)治疗热伤的愈合进程。

发明详述

可以确定，过局部施用EPO，特别是以以上或以下详细描述的凝胶状配制剂形式，特别是以纤维素为基础的水凝胶，例如烧伤、烫伤或疾病引起的创伤后的皮肤再生可以达到迅速的缺损封闭。此外，通过局部给予EPO决定性地促进了创伤区的上皮再生。这可从达到更高的上皮层厚看出(附图4)。这仅在刺激皮肤实质部分尽可能快速地形成时出现。

此外可以观察到，血管网的形成也通过局部施用EPO启动，但是其中这也伴随出现局部实质的形成，与已知的教导相反，通过EPO引起的创伤愈合过程首先通过刺激形成血管的细胞而启动，即EPO刺激内皮细胞和其前体细胞的结果是，EPO仅导致血管形成而实质组织的形成不直接出现且最佳情况下延迟出现。

然而，本发明的结果明确地显示，血管细胞的形成与局部化的组织形成至少被同时协调。

此外，根据本发明可以确定，通过局部施用EPO在新上皮组织的边界区发现组织特异性的前体细胞增多，其是巢蛋白阳性细胞。因此在该区域内的神经元干细胞也被刺激，这解释了在创伤愈合中改善的皮肤敏感性。

对于根据本发明的配制剂，优选使用重组红细胞生成素，如商购可得的那些。但根据本发明也可以使用开发的EPO衍生物，以便相比天然EPO延长活性物质在血液或血清中的半衰期。这些EPO衍生物可以针对局部应用使用，但是这不是强制必需的，因为根据本发明的凝胶状配制剂相对于一般EPO发挥特有的保护作用。属于此类的有例如聚乙二醇化EPO，以糖基化形式的经修饰的EPO(例如)，甲硅烷基化的EPO，或者与其它多肽或免疫球蛋白片段(例如与抗体的Fc部分)相融合的EPO(例如已知于WO 02/49673或WO 01/02017)。此外，也可以使用生物有效的合成EPO肽-模拟物(如已知于例如WO96/40749，WO 96/40772，WO 01/38342，WO 01/091780，WO 2004/101611，WO 2004/100997，WO 2004/101600，WO 2004/101606和WO2006/050959中的那些)。由于这些模拟物通常其氨基酸链明显较短，并且因此一般来说显示更快地降解，它们通过根据本发明的配制获得必需的和足够的稳定化。

在已知的EPO全身应用中，所述活性物质通常以每剂介于150和300IU(＝IE)/kg体重(KGW)施用。在显著更高的剂量的情况下不期望的副作用占优势。在成人(70kg)的情况下这相当于介于10,500和31,500IU EPO/剂。反过来，这相当于大约80至250μgEPO/剂(13,000U-100μgEPO)。

在根据本发明局部应用于皮肤受伤的情况下，借助于根据本发明的配制剂或凝胶，每剂可以应用明显较高的EPO量，而不出现明显的副作用。例如在相应的大创伤(例如300cm²)的情况下可以使用相当于在全身给药的情况下约6500IU/kg体重(KGW)的EPO量。这样的EPO量全身施用是不再容许的。视伤口的大小和用于创伤面积的凝胶的量和每g凝胶中EPO的含量而定，所需EPO的总量明显变化。

通常可以根据本发明设定对于(不同大小)的创伤的一次性处理所需的EPO量作为剂量。因为创伤不仅通过其面积，而且任选地通过其深度来界定，因此必要活性物质的剂量可以显著变化，因为创伤优选用本发明的配制剂填充。

如果设定成人的体重为70kg，则对于创伤愈合提供例如以下的值：

50-500IU/KGW→3500-35,000IU EPO每剂或创伤和创伤大小；

50-150IU/KGW→3500-10,500IU EPO每剂或创伤和创伤大小；

100-500IU/KGW→7500-35,000IU EPO每剂或创伤和创伤大小；

150-300IU/KGW→10,500-21,000IU EPO每剂或创伤和创伤大小.

从表1可以看出，与这些值相应的创伤大小和凝胶浓度。

低EPO单位优选用于具有约5-20cm²的创伤面积的小伤口，而对于具有约100cm²或更大的面积的创伤面积可使用较高的值。在具有例如10cm²的面积的创伤面积的情况下，根据本发明可以使用介于约500和15,000IU的EPO量。在具有例如约100cm²的面积的创伤的情况下约5000-150,000IU的EPO是必需的。这表明，根据本发明应在创伤上施涂平均约50-1500IU的EPO/cm²的创伤面积，优选75-450IU的EPO/cm²，用于创伤的上皮再生和缺损封闭。当然在特定的条件下上下明显地超过或低于所提及的值。

以上提及的值基于100-500IU/g凝胶配制剂，特别是100-300IU/g凝胶配制剂，优选150-200IU/g凝胶配制剂的EPO含量。具体地，每克配制剂基体(Formulierungsgrundlage)，根据本发明使用以下范围的EPO量：

100IU/g凝胶-300IU/g凝胶，100IU/g凝胶-150IU/g凝胶，

100IU/g凝胶-200IU/g凝胶，100IU/g凝胶-250IU/g凝胶，

150IU/g凝胶-200IU/g凝胶，150IU/g凝胶-250IU/g凝胶，

150IU/g凝胶-300IU/g凝胶，200IU/g凝胶-250IU/g凝胶，

250IU/g凝胶-300IU/g凝胶。

通常，在成人中视伤害而定，使用约0.5至约5g，优选1-3g，特别是1g根据本发明的凝胶每平方厘米(cm²)创伤面积。然而可以在上下两方面超过或低于该浓度。特别是使用以下的凝胶浓度范围：0.5g凝胶/cm²-2.0g凝胶/cm²，0.5g凝胶/cm²-1.0g凝胶/cm²，1.0g凝胶/cm²-2.0g凝胶/cm²。

因此，根据本发明的配制剂，每剂量，相应于创伤大小和每克配制剂基体的EPO量，例如包含约以下量的EPO(IU)或在表1中说明的量的EPO：

2000IU，3000IU，4000IU，5000IU，6000IU，7000IU，8000IU，9000IU，10,000IU，12,000IU，15,000IU，20,000IU，25,000IU，30,000IU，35,000IU，40,000IU，45,000IU，55,000IU，60,000IU，70,000IU，80,000IU，90,000IU，100,000IU，120,000IU，135,000IU，150,000IU和180,000IU。

表1：

(A)0.5g凝胶/cm²创伤面积

  IU的EP0  IU的EP0  IU的EPO  IU的EP0  IU的EPO  cm²创伤  面积  凝胶量  (g)  (100IU/g  凝胶)  (150IU/g  凝胶)  (200IU/g  凝胶)  (300IU/g  凝胶)  (500IU/g  凝胶)  1  0.5  50  75  100  150  250  10  5  500  750  1000  1500  2500  100  50  5000  7500  10,000  15,000  25,000  200  100  10,000  15,000  20,000  30,000  50,000  300  150  15,000  22,500  30,000  45,000  75,000

(B)1g凝胶/cm²创伤面积

  IU的EPO  IU的EPO  IU的EPO  IU的EPO  IU的EPO  cm²创伤  面积  凝胶量  (g)  (100IU/g  凝胶)  (150IU/g  凝胶)  (200IU/g  凝胶)  (300IU/g  凝胶)  (500IU/g  凝胶)  1  1  100  150  200  300  500  10  10  1000  1500  2000  3000  5000  100  100  10,000  15,000  20,000  30,000  50,000  200  200  20,000  30,000  40,000  60,000  100,000  300  300  30,000  45,000  60,000  90,000  150,000

(C)2g凝胶/cm²创伤面积

  IU的EPO  IU的EPO  IU的EPO  IU的EPO  IU的EPO  cm²创伤  面积  凝胶量  (g)  (100IU/g  凝胶)  (150IU/g  凝胶)  (200IU/g  凝胶)  (300IU/g  凝胶)  (500IU/g  凝胶)

  1  2  200  300  400  600  1000  10  20  2000  3000  4000  6000  10,000  100  200  20,000  30,000  40,000  60,000  100,000  200  400  40,000  60,000  80,000  120,000  200,000  300  600  60,000  90,000  120,000  180,000  300,000

(D)3g凝胶/cm²创伤面积

  IU的EPO  IU的EPO  IU的EPO  IU的EPO  IU的EPO  cm²创伤  面积  凝胶量  (g)  (100IU/g  凝胶)  (150IU/g  凝胶)  (200IU/g  凝胶)  (300IU/g  凝胶)  (500IU/g  凝胶)  1  3  300  450  600  900  1500  10  30  3000  4500  6000  9000  15,000  100  300  30,000  45,000  60,000  90,000  150,000  200  600  60,000  90,000  120,000  180,000  300,000  300  900  90,000  135,000  180,000  270,000  450,000

根据本发明，所述新颖的配制剂包含至少一种形成凝胶的粘性亲水性聚合物，优选纤维素衍生物，优选多糖，或藻酸盐或其衍生物、几丁质或其衍生物或其盐或者淀粉的组。在此，形成凝胶的多糖的来源是不重要的，即，该形成凝胶的多糖可以是植物或动物来源的或者由合成途径制备的。也可能应用植物或动物来源的并额外地经化学合成修饰的多糖。

优选纤维素衍生物用于根据本发明的凝胶或配制剂。联系本发明属于纤维素衍生物的组特别是纤维素醚类和纤维素酯类以及其盐。作为纤维素醚类在此特别是使用羟烷基纤维素，例如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丁基纤维素，但特别是使用羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。作为纤维素酯类在此特别是使用羧烷基纤维素，特别是羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、羧丙基纤维素或羧丁基纤维素，但优选使用羧甲基纤维素或羧乙基纤维素，其中最优选羧甲基纤维素。

根据另一个实施方式，根据本发明的配制剂还包含至少两种形成凝胶的上述多糖，特别是上述纤维素衍生物。其中证明特别有利的是，使用至少一种选自纤维素醚类的化合物和至少一种选自纤维素酯类的化合物。在此特别优选的是包含作为形成凝胶的多糖的羟烷基纤维素和羧烷基纤维素的配制剂/水凝胶，特别是包含羟乙基纤维素和羧甲基纤维素的。

此外，根据本发明的凝胶可以包含作为形成凝胶的多糖，特别是至少一种水溶性纤维素衍生物。其特征在于，它们在凝胶中不形成膨胀的颗粒，又因此形成非常均匀的水凝胶。再者，含有水溶性多糖的凝胶在施涂于创伤时显示特别好的可涂抹性，此外，形成特别光滑的表面，并且可以特别好地塑形。在此，特别适合的是未交联的水溶性纤维素衍生物。

此外，根据本发明的配制剂可以含有结构形成剂或调节粘度的化合物。在此特别适合的是丙烯酸和丙烯酸酯，特别是交联的丙烯酸酯。这样的适合的丙烯酸酯的实例是：(聚)甲基丙烯酸酯、(聚)甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、(聚)甲基丙烯酸乙氧基乙酯。此外，这些聚丙烯酸衍生物具有的优点为，其可以吸纳就其自身重量而言相当多的水。通过该丙烯酸衍生物与至少一种形成凝胶的多糖的组合，由此可以有目的地制备可以控制吸水量和释水量的凝胶。在所述配制剂中纤维素衍生物和丙烯酸衍生物之间的比例可以在20∶1和1∶1之间，但优选在10∶1和2∶1之间。

此外，根据本发明的配制剂可以是基于粘性的总体上起亲水作用的聚合物构建的，其具有疏水性载体基质或支持基质，例如聚氨酯或聚丙烯酸酯，其中构入了所述的含有活性物质的多糖，例如羧烷基纤维素。这类凝胶特别适合于创伤愈合，其使得创伤保持潮湿，产生对于自溶性清创的最佳环境，并且创伤分泌物留存在二级绷带中。对此的实例是水凝胶。

通常，其它疏水性聚合物支架或支持结构也是可以的，其中构入了水胶体多糖颗粒，如上所述。

原则上，所有基于聚合物，特别是基于多糖构建的凝胶基体和软膏基体(其被证实特别适合于创伤愈合并且是商购可得的)都适合于根据本发明的配制剂，只要通过保持如上下文所述的粘度值确保EPO均匀缓慢的释放。

此外，根据本发明的配制剂可以含有额外的电解质。联系本发明适合的电解质特别是在溶于水时能够离解为离子的和由一价、二价和/或三价离子构成的化合物。该电解质可以是例如作为无机的和有机的盐，并且以具有的离子性质区别于可能在配制剂中出现的聚合物。与此相关的特别适合的是碱金属的或碱土金属的氯化物、碘化物、硫酸盐、硫酸氢盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸二氢盐或磷酸氢盐，但特别是氯化钠、氯化钾和氯化钙。该电解质混合物以特别好的方式模拟在由创伤释放的创伤血清中的电解质混合物。因此，含有该电解质的根据本发明的创伤配制剂提供特别有利于创伤愈合的范围。

在本发明的另一个可选实施方式中，根据本发明的配制剂具有额外的多元醇。该多元醇是出色地适合作为保湿剂(Feuchtigkeitsspender)并因此对于创伤周围的皮肤是保护性成分。对此特别适用的多元醇是，例如可以选自下组：甘油、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯丙二醇或它们的混合物。作为本发明的水凝胶中的多元醇特别是可以以基于整体凝胶的0.5％和10％(重量/重量)之间的量使用甘油和聚乙二醇以及其混合物。

根据本发明的配制剂或凝胶，特别是水凝胶，必须具有适合于以最佳方式保护EPO的粘度，但同时保证，活性物质能够以足够的量和足够快速地在创伤处释放，而之前不被代谢。

令人惊讶地发现，这以最佳的方式仅用具有相对高粘度的配制剂就确保了，所述相对高粘度用膨胀性聚合物(优选纤维素衍生物)在整体凝胶中的以下份额实现，即至少1.5％，但优选2-4％，完全特别优选2.5-3.5％，特别是3％或大约3％。这种粘性凝胶通常很少用于医学目的，因为相较于具有1-2％的凝胶形成剂份额的凝胶，它们大都不好加工。通过使用例如如上所述的丙烯酸酯改善凝胶的可加工性。

根据本发明基于亲水性聚合物的凝胶或配制剂，例如纤维素醚类和/或纤维素酯类，例如羧烷基纤维素，因此具有从5,000至100,000mPa s，特别是20,000至70,000mPa s且尤其特别是40,000至60,000mPa s(Bohlin流变仪CSR-10型测量，锥形轴(Kegelspindel)4°/0.40mm，示波法测量，T＝22-25℃)的动力粘度。这种水凝胶可以足够良好且均匀地在伤口上和伤口里分布，在吸收创伤渗出物时具有良好的粘着性，且不从待治疗的伤口流出。

设计为，根据本发明优选的含有EPO的配制剂或凝胶包含下述组分：至少70重量％的水和1.5-6.0重量％的形成凝胶的多糖，优选至少一种纤维素衍生物，特别是羧甲基纤维素和/或羟乙基纤维素，并任选0.1-10重量％的丙烯酸衍生物和/或1-20％多元醇，优选1-5重量％的甘油，和/或0.1-5重量％的电解质。

根据本发明的配制剂必要时可以含有对于凝胶配制剂本身已知的助剂，包括适合的防腐剂。

根据本发明的配制剂或凝胶，也可以具有其它本身有助于创伤愈合的活性物质。当出现例如细菌、病毒或真菌感染时或针对这样的感染进行预防时，这是特别适合的。相应的适于该目的的抗生素类、抗真菌剂或消炎药被描述于现有技术中。在此特别适用的是可局部应用的活性物质。对于可局部应用的抗生素类的实例有四环素类或青霉素类，或者还有红霉素，杆菌肽，短杆菌素，多粘菌素E和多粘菌素B或氨基糖苷类如新霉素，卡那霉素和巴龙霉素或莫匹罗星。

在一特别的实施方式中，根据本发明的配制剂添加至少一种蛋白酶抑制剂，其应该抑制在创伤分泌物中大量出现的蛋白酶。根据本发明，特别适宜的蛋白酶抑制剂是抑肽酶，其能够抑制在伤害的情况下出现的促炎症细胞因子的分泌。令人惊讶地表明，在抑肽酶存在的情况下局部给于EPO对创伤愈合特别有效。

此外，根据本发明的凝胶或配制剂还可以含有消毒剂例如聚维酮-碘等。

除了根据本发明含有EPO的配制剂本身以外，本发明还涉及创伤覆盖物，其包括药物载体材料和所描述种类的配制剂或凝胶。在此作为载体材料使用例如来自天然或合成纤维材料的非织造物或纺织的针织品或织物，但也包括例如以喷雾贴剂(Sprühpflaster)形式的薄膜覆盖物。在此将所述药物载体材料用凝胶或水凝胶单侧或多侧地涂覆或浸渍。

特别适宜的创伤覆盖物可以以特别的贴剂形式提供，其以特别优化的方式包含活性物质EPO并释放到创伤处。

这种贴剂详细描述于EP08011985.2中并包含含有活性物质的载体基质，其中所述载体基质构造如下：

(i)以一个或多个具有用作药物容器的空腔形式的区域或结构，和(ii)以一个或多个用作类似管道结构的空腔形式的区域或结构，其用于容纳和引离创伤分泌物和/或通风和/或局部引入其它活性物质和/或促进皮肤愈合的细胞，其中(a)至少一个根据(i)的区域邻接至少一个根据(ii)的区域，(b)所述区域(i)和(ii)在背离创伤的一侧是封闭的，(c)所述区域(i)和(ii)在面向创伤的一侧是敞开的或者至少对于含有的活性物质、创伤分泌物、其它活性物质/所述细胞而言，是可通过的，(d)所述构建为空腔的区域(i)和(ii)设置在贴剂面平面中，和(e)区域(ii)的空腔具有至少一个对注射器或吸出/导入器具的开口或连接，这使得在产生贴剂中所出现的低压的情况下，在空腔中收集的创伤分泌物的引离和/或必要时所述其它活性物质的施用成为可能。

此外，相应含有EPO的贴剂可以以下述方式配置，在潮湿的或产生创伤分泌物的皮肤或创伤情况下(f)所述区域(ii)的空腔具有附加的导液剂，这使在空腔中收集的创伤分泌物的引离成为可能。其中所述区域(ii)的空腔可以是彼此连接的管道。所述区域(i)的空腔可以是槽状的，其中槽的开口侧是对着创伤的，且所述槽底面是长方形的、正方形的、六角形的/蜂房状的或圆形的。在此，所述区域(i)的空腔通过由载体基质材料构成的窄桥彼此隔开。所述窄桥本身同样可以具有类似管道的结构，其彼此至少部分地相连，且用于创伤分泌物的引离，和/或通风和/或其它活性物质/所述细胞的引入。

此外，用作药物容器的区域(i)的空腔是联合成簇的结构，其通过由载体基质材料构成的窄桥彼此隔开。簇结构区显示任意的、长方形的、正方形的、六角形的/蜂房状的或圆形的底面形状，特别是正方形的或直角形的底面形状，其中任选地簇底面的形状可以与区域(i)结构的底面形状相同或不同。在此可以设计为，区域(i)的簇结构区与至少一个区域(ii)的空腔相邻且任选地区域(i)的两个簇结构区通过区域(ii)的空腔彼此隔开。

根据本发明的配制剂/凝胶，其任选地涂覆于原则上已知的和商购可得的创伤覆盖物上，或例如如上所述的贴剂上，可以每12、24、48或72小时，优选每48小时更换一次，这主要由于其它必须处理的因素和情况例如创伤分泌物的形成、流血或出现的感染，可能变得很重要。但是，仅出于活性物质EPO在本发明的配制剂基体内的稳定性和活性的原因，在创伤完全愈合之前也没有必要更换绷带或贴剂。

根据本发明的凝胶是可通过本身已知的方法制备的。在实施例中详尽地描述了这种方法之一。

如已经列举的根据本发明含有EPO的凝胶，特别可以在创伤的治疗，特别是皮肤、粘膜、在牙科领域的治疗，在口腔中颌粘膜受伤或者在皮肤烧伤或烫伤或者伴有慢性伤口的皮肤疾病的情况下使用。皮肤的创伤可以由例如切割、刺戳、挫伤、叮咬或枪伤引起，或者可以是手术或拔牙产生的不可避免的结果。此外，不同疾病可以产生皮肤和皮肉的创伤，或形成开放性溃疡。在器官移植或截肢的情况下也出现必须局部和区域性予以治疗性护理的较大创伤。

在牙科领域也可能在龋齿发炎和牙周炎的情况下出现较小的创伤，其可以用根据本发明的配制剂/凝胶成功治疗。如果牙齿的釉质表面被损伤，细菌进一步向其下面的牙质传播。牙髓的突起存在于放射伸展的牙质小管中，使得其在进一步的进程中出现部分或全部的感染并由此出现牙髓发炎。如果不进行治疗，进一步后果是牙髓组织死亡(坏死)和细菌性腐烂(坏疽)。如果不移除坏疽性物质，那么结果是根尖(Wurzelspitze)外围发炎。可以发展为肉芽肿、囊肿、形成瘘或脓肿。在该任一阶段可以成功使用EPO或含有EPO的凝胶，有利地，在相应的抗菌治疗后使用。

根据本发明的配制剂或含有EPO的凝胶特别适合于治疗相对深的创伤并且能够出色地用作创伤填充物。例如，经常强烈渗出的深真皮溃疡可以用根据本发明的凝胶治疗。在此，通过所述凝胶的相对高粘度阻止或至少减少从创伤渗出液体。此外，用本发明的凝胶也可以治疗干燥创伤，例如干燥的小腿溃疡。在此，本发明的凝胶显示其为创伤导入液体的特性和保证通过温和清创移除不期望的物质、覆盖物和坏死。对于可以应用根据本发明的配制剂的其它种类的创伤包括，但不限于，褥疮I、II、III期(压疮)、小腿溃疡(腿溃疡，腿疮(offenesBein))，糖尿病足综合症、皮肤溃疡、疖、一级和二级烧伤、擦伤和慢性创伤。

最后，本发明的主题是成套的试剂盒，其包括至少两个分开的包装，其中第一个包装包含水凝胶的材料或水凝胶的组成部分，如多糖和/或聚合物(疏水性)的支持基质，和第二个包装包含作为能长期储存的冻干物的活性物质EPO。如果适合，所述成套的试剂盒还可以在不同的包装中包含配制剂基体的组成部分。同样，具有与用量一致的水性成分(可以将固体成分溶解或悬浮于其中)的包装是根据本发明的成套试剂盒的另一个组成部分，也就是说，药用试剂盒可以包含其它包装单元，其具有用于膨胀/聚合作用所必需的溶剂(优选水或水性介质)。在此，根据本发明的试剂盒可以包含呈粉末的或以已经预先膨胀形式的膨胀性聚合物，其中在后一种情况下，预先膨胀的聚合物的粘度要保持足够低的粘度(优选低于5000mPa s，以确保与来自第二个包装单元的活性物质EPO均匀混合。在添加EPO后，可以将具有希望粘度的载体聚合物/凝胶最后完成膨胀。

单独分开的包装也可以物理上以其内容物可以通过简单的机械如刺穿、穿孔、压透、撕开等彼此混合的方式彼此连接，例如以“混合-封闭-体系”的形式。以此方式，可以使特别是以冻干形式的活性物质EPO在保持其活性的情况下是可非常长期地储存的，在制备根据本发明的预先膨胀状态的新鲜凝胶的情况下，添加到未聚合的凝胶或配制剂基体中，即刻施用于创伤，以致不会出现活性损失，如同在某些情况下自始就完全完成含有活性物质的配制剂会有的情况那样。

以下实施例应该详细描述本发明，而不以任何方式限制本发明。特别是本领域的技术人员借助常识由这些实施例引出一般性的结论。

此外，在实施例中说明的物质，包括其参数、性质物理量、数据，以及所述的特定方法只理解为示例性的，本领域的技术人员，如果没有另外说明或受实际或技术-科学原因的阻挠，也能够概括出并产生除在实施例中所描述以外的其它关联。

实施例

实施例1：

红细胞生成素(EPO)以成品药物制剂形式应用(NeoRecormon，10,000IU，用于制备在药筒中的注射溶液的粉末和溶剂，Ch，-B.MH68260 08，PZN742 914 3，Roche Reg.Ltd.，UK-Welwyn Garden City)。

在下述凝胶形成剂的使用下，将所述活性物质在无菌条件下移入可预先消毒的配制剂中：

○羟乙基纤维素Ph.Eur.5.1(商品名：羟乙基纤维素250HX Pharm，Ch，-B.06E29-N01，Fagron，D-Barsbüttel)

○羧甲纤维素-钠/羧甲基纤维素Ph.Eur.5.0(商品名TylopurC600，Ch，-B.516 762 65，Caelo，D-Hilden)

○甲基纤维素/羟丙基甲基纤维素USP(商品名Metolose 90SH-100，Ch，-B.206314，Shin-Etsu，D-Mülheim)

○聚乙烯吡咯酮Ph.Eur.5.0(商品名25，Ch，-B.74-0915，BASF，D-Ludwigshafen)

○Convatec，Varihesive是水胶体绷带。其内侧(敷于伤口上)由基于可膨胀的多糖的水胶体层构成，所述水胶体层衬入粘附性聚合物基质，并且外侧由膜包覆的聚氨酯泡沫胶构成。

除了用于注射目的作为主体的水(Ph.Eur.5.0)之外，使用甘油作为助剂(85％或无水的，Ch，-B.058 006 2，Fisher Scientific，UK-Loughborough，)。作为用于容纳配制剂的初级包装材料，Fiolax-注射瓶使用I型玻璃(Glaswarenfabrik公司，D-Münnerstadt)。该注射瓶用20mm的Pharma-Fix密封垫圈(Dichtscheiben)盖住并用21m的金属翻边密封盖翻边(两者都自VWR，D-Hannover)。对于释放研究使用器官型皮肤模型，其制备、培养和使用参考以下的相应文献：C.Hoffmann，C.C.Müller-Goymann，″Use of artificial skin constructsin permeation studies of clindamycin phosphate″，Pharmazie 60(2005)350-353。

实施例2：配制不含活性物质的水凝胶

用于研究的凝胶形成剂在低菌条件下在配衡研钵(Fantaschale)中称量并与预定量的甘油研磨。在逐份加入用于注射目的的作为主体的水之后，在补充蒸发的水和所述水凝胶在研钵中匀质化之前，使配制剂至少膨胀2小时。所述水凝胶在每种情况下以3.3g的份额移入高温气体消毒的注射瓶中，其可以分别根据配制剂的稠度通过用注射器抽取或通过转移到Unguator罐中并随即借助套上的Unguator施用器(eines aufgesetztenUnguator-Applikators)(两者都自Gako Konietzko公司，D-Bamberg)进行配药。所述密封的注射瓶然后在Ph.Eur.的标准条件下借助饱和加压的水蒸气消毒。

实施例3：不含活性物质的水凝胶的流变性质评价

为了估算在高压灭菌期间凝胶形成剂的热分解，视觉鉴定经灭菌的水凝胶和未灭菌的样品，并在锥体-平板式回转粘度计(Rheometer GVO，Bohlin Instruements，GB-Cirencester)上于20.0℃和锥顶角1°下测量。凝胶形成剂的最终含量的确定相应于对配制剂的医疗要求而进行。

实施例4：制备含有EPO的凝胶状配制剂

由重构的EP010,000IU溶液，在无菌工作台分别将500IU EPO注射入冷却的且预先消毒的水凝胶中；对此使用Reco-Pen(Roche Diagnostics公司，D-Mannheim)，其通过套上的12m Clickfine通用针头(Ypsomed，D-Sulzbach)释放所需的药物溶液。考虑到针对500IU EPO移入的50μl的EPO体积，得出在所述配制剂中活性物质含量是150IU/g。为了在排除蛋白质变性风险的情况下能够保证均匀的分布，使所述EPO溶液扩散24小时进入水凝胶中。为了更好地混匀，在此期间两次旋转所述注射瓶180°。将所述配制剂于+2至+8℃避光贮存。具体而言，以下对于具有红细胞生成素含量为150IU/g凝胶的水凝胶的制备说明示范性使用：

●在低菌条件下制备不含活性物质的凝胶

●羧甲基纤维素250HX与甘油(2.4％)在研钵中研磨

●逐份地加入水

●使其至少膨胀2小时

●补充蒸发水分，匀质化。可选地还可以使用电子搅拌系统(例如Cito-Unguator 2000)用于制备不含活性物质的凝胶。

●将凝胶逐份以每种情况下3.3g移入预先净化的并高温气体灭菌的玻璃1型注射瓶中并翻边密封，例如用注射器或Unguator-

●翻边密封的凝胶在标准条件下高温灭菌

●注射瓶在进一步加工前置于+2至+8℃的温度下

●在无菌工作台分别将500U EPO移入每只注射瓶，例如从NeoRecormon 10,000E双室药筒中用RecoPen以2Pen单位经Clickfine通用针头释放。

●使EPO经至少24h扩散，在此期间为了更好的混匀，两次旋转注射瓶中的凝胶180°

以类似的方式用羟乙基纤维素、羧乙基纤维素、羧丙基纤维素、羟丙基纤维素(纤维素含量在1.5％至3.5％(重量/重量)之间)制备凝胶。

实施例5：鉴定含有EPO的配制剂的稳定性测试

为了测试配制剂中红细胞生成素的稳定性，在制备后时间点0、1、2、3、4周时，取各配制剂的样本，并供给红细胞生成素分析。在全部试验时间段内，遵循上述贮藏条件。此外，将在0.9％含水食盐溶液中具有红细胞生成素含量为40IU/ml的配制剂也纳入研究中。该结果在附图1中以图示给出。

实施例6：通过皮肤构造物的活性物质释放试验

用于释放试验，使用六个在受体间隔中包含37℃等压甘油溶液的Franz扩散池(Franz-Zellen)(体积：5.68-8.88cm3，渗透面积：0.14-0.34cm²)。在供体间隔和受体间隔之间引入器官型皮肤构造物，其向下通过聚碳酸酯过滤器相对于受体溶液机械固定，并且向上与待测配制剂接触。在替代提取的受体体积1.0ml的情况下，在0；0.5；1；1.5；2；3；4；5；6和24小时后抽取样本，并提供给红细胞生成素分析。皮肤构造物首次接触待测配制剂与第一个样本抽取(0h)之间的时间段规定为约5分钟，该时间段用来安装扩散池、注入受体和称量。4个上述释放扩散池用于测试基于配制剂和稳定性研究可以被看作有前途的配制剂。为了获得是否需担心药物物质在释放测试期间因为高于贮藏条件的温度被降解的知识，提供另外两个具有粘性溶液(红细胞生成素含量：150IU/g)的扩散池，以便能够在释放试验结束后由这些溶液测定含量。

实施例7：EPO分析

因为在所有情况下，待检测药物的物质含量过小，为了借助旋光圆偏光二色性(des optischen Zirkulardichroismus)进行未变性或未降解的红细胞生成素份额的量化，在注重制造商的说明的情况下借助三明治ELISA检测红细胞生成素(EPO-ELISA，OSTEOmedical GmbH，D-Bünde)。为了测定经显色的ELISA分析使用软件版本为3.4 Rev 21.的多盘解读器(Multiplattenreader)KC4(Bio-Tek，D-Bad Friedrichshall)。因为所制备的剂型的含量高于分析的量化范围，将各个样本在测定前稀释，以便获得在400mIU/ml范围的净含量。源自释放研究的标本可以不经过中间的稀释步骤进行测定。

实施例8：利用羧甲基纤维素凝胶在创伤大鼠上的皮肤再生

对体重为200-250g四只雌性大鼠实行削痂创伤(ein tangentialesExzisionstrauma)。所述动物用如上述说明制备的含有凝胶形成剂羧甲基纤维素(3％(w/w)，42,000mPa s)(此外2.4％甘油)的凝胶以及150IUEPO/体重治疗。对照(安慰剂)不含活性物质。在涂抹凝胶后，给予动物绷带或贴剂。每48h进行绷带/贴剂的更换。在4天和8天后取创伤部位的组织样本，并进行组织学研究。在此借助现有技术已知的对CD31和巢蛋白阳性或阴性细胞的染色技术检测。结果显示于附图2、3、4。可以识别出，分别根据治疗时间，相较于不含活性物质的配制剂(“凝胶F”，附图2和3)，上皮再生在含有EPO凝胶(“凝胶E”，附图2和3)中明显更快地结束(平均10-50％)。此外可以通过细胞特异性染色看出，在新生成的上皮中基本上没有新的CD31阳性细胞生成(附图4)。

在类似的情况下，研究在1％羧甲基纤维素凝胶中的皮肤再生。在含有EPO的凝胶配制剂的情况下，所述结果约5-10％次于在可比的3％凝胶的情况下，而在对照组中基本上观察不到区别。

在类似的情况下，研究在含有相同EPO浓度的基于羟乙基纤维素1％和3％的凝胶中的皮肤再生。相对于羧甲基纤维素凝胶，羟乙基纤维素凝胶获得可比的或仅仅稍差的结果。

实施例9：

根据上述方法，制备用于治疗成年患者的烧伤伤口(约120cm²)的如下凝胶配制剂：

涂抹100g这种凝胶，且其含有12,000IU EPO，并显示粘度为约40,000mPa x s。

实施例10：

根据上述处理方法，制备用于治疗成年患者的切割创伤(2cm²)的如下凝胶配制剂：

涂抹2g这种凝胶，且其含有1,000IU EPO。粘度：约68,000mPa x s。

实施例11：

根据上述处理方法，制备用于治疗成年患者的烧伤伤口(约300cm²)的如下凝胶配制剂：

450g这种凝胶含有50,500IU EPO，且在一次治疗中分布在烧伤伤口上。粘度：约35,000mPa x s。

实施例12：

根据上述处理方法，制备用于治疗成年患者的烧伤伤口(80cm²)的如下凝胶配制剂：

涂抹50g这种凝胶，且其含有35,000IU EPO。粘度：约55,000mPa x s。

实施例13：

根据上述处理方法，制备用于治疗成年患者的开放性腿溃疡(150cm²)的如下凝胶配制剂：

涂抹150g这种凝胶，且其含有20,100IU EPO。粘度：约49,000mPa x s。

实施例14：

根据上述处理方法，制备用于治疗成年患者的拔牙后较大的粘膜-下颚创伤(1cm²)的如下凝胶配制剂：

涂抹1g这种凝胶，且其含有1,500IU EPO。

实施例15：

根据上述处理方法，制备用于治疗成年患者的拔牙后较大的粘膜-下颚创伤(约10cm²)的如下凝胶配制剂：

施用30g这种凝胶，且其含有20,500IU EPO。粘度：约23,000mPa x s。

实施例16：

慢性局部缺血性创伤：

慢性局部缺血创伤仅在德国属于最常见的外科病征，并且需要加强地跨学科的治疗。在德国超过3百万人遭受慢性创伤的痛苦，这些创伤通常可以归于三种创伤类型：小腿溃疡、糖尿病足和褥疮。本地用于治疗慢性创伤的费用目前合计每年约50亿欧元。

动脉溃疡(外周动脉闭塞性疾病)和糖尿病溃疡的组合被认为是在临床特别难以治疗的且可惜并不罕见。

具有IV级pAVK的一位69岁的糖尿病患者遭受了12个月以上的局部缺血性III级外踝溃疡(附图5，上图)。在用具有相应高浓度的Varihesive水凝胶的重组EPO(每次3,000IU)局部治疗三个月后，出现明显的肉芽组织生成(中图)。在随后的分层皮移植15天后(下图)观察到创伤的完全治愈。

实施例17：

表皮创伤

每个人在他的生命旅程中遭受或多或少的需要治愈的机械的或热力的表皮损伤。市场上相应大量的是以液体、软膏和包扎材料形式的局部创伤治疗剂。

在基于证明的分析中涉及的患者有成问题的事实，每种皮肤创伤是构型不同的。然而在外科中具有如下产生的高标准化的皮肤创伤，其必须用特定仪器(植皮刀)摘取一部分定义厚度(通常0.2至0.3mm)的皮肤，以便随后向其它身体部位移植。这种摘取分层皮肤的部位(0.3mm)在10至14天内大多完全愈合。

一位25岁的患者显示热损伤，其治疗必需进行分层皮肤摘取(附图6，左图)。用根据以上给出的组成之一(3％羧甲基纤维素)的含有1x 3,000IU EPO的水凝胶成功地治疗摘取分层皮肤的部位。7天后已经可以观察到完全愈合(附图6，右图)。

在其他四位遭受烧伤的患者获得类似的结果。

所述以红细胞生成素局部施用的分层皮肤移植片-摘取部位的治疗试验在上述五位患者中如下进行：所述分层皮肤移植片每次以0.3mm厚度从大腿提取。所述红细胞生成素在手术中与起载体物质作用的水凝胶混合并直接涂抹于创伤。随后创伤部位用穿孔的聚氨酯薄膜和二级绷带包扎。移除所述二级绷带只在进一步局部施用红细胞生成素的情况下进行。最后进行穿过聚氨酯薄膜的多点消毒。手术七天后防止损伤地移除聚氨酯薄膜，以便鉴定上皮再生。