一种利用标记辅助选择进行萝卜CMS雄性不育系培育的方法

摘要

本发明涉及一种利用分子标记辅助选择进行萝卜CMS雄性不育系培育的方法，属于作物育种技术领域，用于萝卜杂种优势利用中优良雄性不育系的高效培育。本发明技术方案为：筛选出性状优良、育性稳定的自交系；选用特异引物NAUmsF4与NAUmsR4对筛选出的自交系进行PCR扩增，确定能够扩增出1069bp特异条带的自交系不可做为候选保持系；对于未能扩增出该特异条带的自交系，进行恢复基因功能标记分析，筛选出可做为候选保持系的自交系；将原始不育系与鉴定出的候选保持系杂交、4-5代回交，即可获得性状优良的新不育系和相应保持系。本发明利用分子标记快速筛选候选保持系，不受生育期和环境影响，可显著提高萝卜CMS不育系培育效率，加快优良F

说明书

技术领域

本发明公开了一种利用分子标记辅助选择进行萝卜CMS雄性不育系培育的方法，属于作物育种技术领域，用于萝卜杂种优势利用中优良CMS雄性不育系的高效培育。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.)又名莱菔、芦菔，为十字花科萝卜属，是原产于我国的一种重要根菜类蔬菜作物，在我国栽培历史悠久，类型多样，分布广泛；萝卜主要食用部位为肉质根，不仅营养丰富，而且具有较高的药用食疗价值，深受人们喜爱(汪隆植与何启伟主编，中国萝卜，科学技术文献出版社，2005)。

雄性不育(male sterility)是指植物不能产生有功能的花粉或者雄配子的特性，可分为核不育(Genic male sterility，GMS)与质核互作雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)。CMS质核互作雄性不育的不育性由保持系保持，育性可由核内恢复基因恢复(Hanson MR，Bentolila S.Interactions of mitochondrial and nuclear genes that affect male gametophyte development.Plant Cell，2004，16：154-169)。

萝卜是典型的异花授粉植物，自交衰退严重，具有显著的杂种优势。萝卜花器官小，人工去雄成本高，利用CMS雄性不育系做为母本进行杂交制种是当前萝卜杂种优势利用的有效途径，具有F₁纯度高、制种简单、亲本不易流失等优点(柳李旺，汪隆植等，利用胞质雄性不育系生产萝卜优质良种的关键技术.种子，2001，(6)：74；汪隆植与何启伟主编，中国萝卜，科学技术文献出版社，2005)。Ogura不育胞质是萝卜CMS雄性不育系中广泛存在的胞质(Bonhomme S，Budar F，Ferault M，Pelletier G. A 2.5 kb Nco I fragment of Ogura radish mitochondrial DNA is correlated with cytoplasmic male-sterility in Brassica cybrids.1991，Curr Genet 19：121-127)。利用CMS雄性不育系制种的主要方式是，CMS雄性不育系×父本系产生F₁杂种，但母本不育系繁殖需要相应的保持系，即CMS雄性不育系×保持系产生不育系，保持系自交产生保持系(张天真主编，作物育种学总论，中国农业出版社，2003)。

随着蔬菜产业发展，萝卜生产上需要大量优质、抗病、丰产、晚抽薹、抗热、抗逆、适应鲜食或加工的不同类型品种，以满足我国不同地区、不同生长季节、不同栽培形式的需要，促进农民增收，农业增效。常规定型品种选育周期长，工作量大，通过杂种优势利用途径，培育出多个优良CMS雄性不育系与父本系，配组后即可得到大量杂交组合，生产高质量种子以满足萝卜生产需要。

培育大量优良CMS雄性不育系是广泛、高效利用萝卜杂种优势的前提。现有的雄性不育源在配合力、品质、抗性等方面不可能完全适应新品种选育目标。通常育种计划中，在获得不育源后，筛选具有优良性状、符合育种目标的多个自交系与原始雄性不育株(系)测交，杂交后代种子收获后再春化处理，抽薹开花期进行单株育性调查，淘汰掉全可育组合；保留全不育组合与部分不育组合，相应的父本自交系可初步确定为候选保持系；再用不育株作母本，候选保持系作轮回亲本连续多次回交，最终获得与候选保持系遗传组成几乎相同且性状优良的新型不育系。因此，性状优良的候选保持系是成功进行不育性转移、获得新型优良不育系的重要条件，准确快速鉴定出候选保持系是成功培育优良CMS雄性不育系的关键因素。

分子标记是指以DNA为基础的遗传标记，可分为随机DNA标记(Random DNA Markers，RDMs)与功能标记(Functional Markers，FMs)。功能标记是新型分子标记，在植物育种应用上比随机DNA分子标记(RDMs)更具有优越性(Andersen J R，Functional markers in plants.Trends in Plant Science，2003，8：554-560)。一旦获得特定性状(基因)遗传标记，即可实现分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)，MAS是利用特定的遗传标记对某特定性状基因型进行选择，不受组织类别和发育阶段影响，可在苗期至成株期进行分析，具有简便快速、高效、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，可明显缩短育种年限，显著提高育种的选择效率与育种预见性。

传统萝卜育种过程中，CMS雄性不育系的候选保持系的筛选鉴定主要依赖于田间大量测交配组。通常第一年大株留种时选择多个优良自交系，第二年春季开花期与不育源植株测交，第三年春季花期对测交后代逐一进行育性调查，因此候选保持系鉴定过程往往需要相当长时间，而且育性调查准确性有时还会受温度、肥水因素影响，特别是育种计划中同时选育多个不育系，导致工作量大，效率不高，严重限制了萝卜新型不育系培育与优良新品种选育进程。有鉴于此，本发明研发了利用胞质雄性不育及相关育性恢复基因功能标记进行萝卜候选保持系快速鉴定，以实现具有ogura不育胞质的萝卜CMS雄性不育系的高效培育。

发明内容

技术问题

本发明的目的是，针对目前萝卜CMS雄性不育系选育过程中，候选保持系的筛选鉴定工作量大、耗时长的问题，开发一种利用分子标记辅助选择萝卜候选保持系的方法，快速准确地选择出优良候选保持系，从而提高萝卜优良CMS雄性不育系的选育进程，为大规模优良不育系快速培育提供有力技术支撑。

实施方案

一种利用分子标记辅助选择进行萝卜CMS雄性不育系的高效培育方法，其特征在于：

1)CMS胞质不育基因鉴定

对萝卜自交系，提取基因组DNA，用标记引物进行PCR扩增，正向引物NAUmsF4序列为AAAACGCCGCCCAAATACG，反向引物NAUmsR4序列为TTCAACAAATCCCTCCAGACAGC；PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1.5min，32个循环；72℃延伸10min；PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，能够扩增出1069bp特异片段的自交系携有ogura胞质雄性不育基因，不能做为候选保持系用于新CMS雄性不育系培育，将其淘汰；；

2)CMS恢复基因功能标记分析

对于步骤1)未扩增出1069bp特异片段的自交系材料，用特异引物进行PCR扩增，正向引物NAUrfoF4序列为AATACTGAACCGGAACTCTACTGG，反向引物NAUrfoR4序列为TGCAGCAGCAGAAACAAAAT；PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 50s，56℃50s，72℃ 1.5min，35个循环；72℃延伸10min；对此扩增产物进行限制性内切酶SspI酶切，20μl体系包括8μl PCR产物与7.5U内切酶SspI，37℃下温浴3h；酶切产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，如果有2个酶切位点产生大小分别为1538bp，629bp，363bp的3个酶切片段，表明该萝卜自交系携有育性恢复基因，不能用做候选保持系，也将其淘汰；剩下的自交系如果只有1个酶切位点产生2167bp与363bp的2个酶切片段，表明该萝卜自交系不携有恢复基因，选作候选保持系用于新CMS雄性不育系培育；

或者对步骤1)胞质不育基因鉴定中未扩增出1069bp特异片段的自交系，用恢复基因特异标记引物进行PCR扩增，正向引物NAUrfoF10序列为ATATACAGCTTCACCATTC，反向引物NAUrfoR10序列为CTACCAGAGCTACAAAAAC；程序为：94℃ 3min；94℃ 50s，50℃ 50s，72℃ 1.5min，32个循环；72℃延伸10min；能扩增出575bp特异片段的自交系则不携有CMS恢复基因，选做为候选保持系用于新CMS雄性不育系培育；

3)将获得的候选保持系做为轮回亲本与不育系杂交，回交4-5次，即可获得新的CMS雄性不育系，用于杂种种子生产中。

有益效果

本发明利用萝卜胞质雄性不育及相关恢复基因功能标记快速筛选鉴定用于CMS雄性不育系培育的候选保持系，与传统的选育技术相比，其优点是：

(1)萝卜优良选育效率显著提高。常规萝卜CMS雄性不育系培育过程中，候选保持系的筛选鉴定需要经过大株留种、花期与不育株测交、测交后代育性调查等环节，工作量大、周期长，成本高，费时费工。通过本发明建立的快速准确筛选萝卜优良候选保持系的方法，获得一批新的CMS雄性不育系，大大提高萝卜CMS雄性不育系的选择效率，从而显著加快优良F₁杂种选育进程。

(2)标记稳定准确。以萝卜高代自交系为材料，利用胞质不育及育性恢复基因功能标记对其进行筛选，快速鉴定出胞质不育基因与恢复基因的存在与否，分子标记筛选与田间鉴定结果完全一致，标记辅助选择不受生长阶段与环境条件的影响。

附图说明

图1萝卜高代自交系DNA的引物NAUmsF4与NAUmsR4扩增结果

材料1～16为萝卜高代自交系；M：DL2000 DNA ladder(分子量标准)。在材料12～16中能够扩增出胞质不育基因特异片段(1069bp)，表明携有育性恢复基因，不能做为CMS雄性不育系培育的候选保持系。材料1～11中未扩增出胞质不育基因特异片段，尚需进一步鉴定是否存在育性恢复基因。

图2引物NAUrfoF4与NAUrfoR4扩增产物SspI酶切结果

对此1～11号材料进行恢复基因功能标记分析，育性恢复位点DNA扩增产物(NAUrfoF4与NAUrfoR4)经SspI酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，自交系材料扩增产物有2个酶切位点(产生3个酶切片段，大小分别为1538、629、363bp)，则表明该自交系携有育性恢复基因，在CMS雄性不育系培育过程中，此类材料不可做为候选保持系(如图2中材料2)，应将其淘汰；如果仅有1个酶切位点(产生2个酶切片段，大小分别为2167、363bp)，表明该自交系不携有育性恢复基因，适宜做为不育系培育的候选保持系(如图2中材料1，材料5～11)；若产生4个酶切片段(2167、1538、629、363bp)，则表明此材料育性恢复位点为杂合状态，不育系测交、转育中后代会产生育性分离(如图2中材料3与4)，应当将此材料自交使其育性恢复位点纯合。

图3萝卜自交系DNA的引物NAUrfoF10与NAUrfoR10扩增结果

为进一步验证育性恢复基因有无，可利用恢复基因特异标记引物NAUrfoF10与NAUrfoR10进行扩增(图3)，若能扩增出575bp特异片段，则表明该自交系不携有恢复基因，雄性不育系培育过程中可做为候选保持系，进行新型不育系培育(如图3中材料1，材料5～11)。

具体实施方式

本发明的实施程序是：

(一)筛选优良自交系材料

选择土壤理化性质与排灌条件良好的地块种植不同萝卜高代自交系材料，对其肉质根形态、品质、植株抗性、花粉育性等主要性状指标进行鉴定评价，筛选出性状优良、育性稳定的自交系。

(二)采用改良的CTAB—氯仿—异戊醇法提取萝卜基因组DNA(Liu L，Guo W，Zhu X，Zhang T.Inheritance and fine mapping of fertility-restoration for cytoplasmic male sterility in Gossypium hirsutum L.Theor Appl Genet，2003，106：461-469)。

(三)胞质不育基因鉴定

提取萝卜自交系基因组DNA，自交系品种1～16号分别为Nau-1，Nau-2，Nau-3，Nau-8，Nau-9，Nau-11，Nau-12，Nau-13，Nau-14，Nau-15，Nau-16，Nau-18，Nau-19，Nau-20，Nau-21，Nau-24(Zhao-liang Lu，Li-wang Liu，Xiao-yan Li，Yi-qin Gong，Xi-lin Hou，Xian-Wen Zhu，Long-zhi Wang.Analysis and evaluation of nutritional quality in Chinese radish(Raphanus sativus L.).Agricultural Sciences in China，2008，7(7)：823-830.)，用不育基因标记引物NAUmsF4与NAUmsR4对萝卜自交系基因组DNA进行PCR扩增。采用20μl反应体系，包含20ng基因组DNA，1.5mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，正向、反向引物各0.6μM，0.8U Taq DNA聚合酶；PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1.5min，32个循环；72℃延伸10min。扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，160V电泳2h后于10％乙醇和0.5％乙酸溶液中固定30min，0.2％硝酸银溶液中银染15-20min，最后在1.5％氢氧化钠、1.1％甲醛、0.00025％硫代硫酸钠溶液中显色至有明显条带出现。若能够扩增出1069bp特异片段，表明材料中存在萝卜ogura胞质雄性不育基因，则应淘汰该自交系，不能做为候选保持系用于新不育系培育；对于未扩增出该特异片段的自交系材料，需进行恢复基因功能标记分析，进一步确定有无育性恢复基因。图1为萝卜高代自交系DNA的引物NAUmsF4与NAUmsR4扩增结果：材料1～16为萝卜高代自交系；M：DL2000 DNA ladder(分子量标准)。在材料12～16中能够扩增出胞质不育基因特异片段(1069bp)，表明携有育性恢复基因，不能做为CMS雄性不育系培育的候选保持系。材料1～11中未扩增出胞质不育基因特异片段，尚需进一步鉴定是否存在育性恢复基因。

(四)育性恢复基因功能标记分析

对于胞质不育基因鉴定中未扩增出1069bp特异片段的自交系材料，进一步进行恢复基因功能标记分析。用引物NAUrfoF4与NAUrfoR4进行PCR扩增，16uL反应体系包含1×buffer，1.8mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，每个引物0.6μM，0.7U Taq DNA聚合酶，20ng DNA。反应程序为94℃预变性3min，94℃ 50s，56℃ 50s，72℃ 1.5mim，35个循环，72℃延伸10min。扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，单一条带的扩增产物进行限制性内切酶SspI酶切。酶切体系为20μl，包括8μl PCR产物，2μl Buffer，7.5U内切酶SspI，用ddhH₂O补足20μl；酶切条件是37℃下温浴3h。

酶切产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，160V电泳2h后于10％乙醇和0.5％乙酸溶液中固定30min，0.2％硝酸银溶液中银染15-20min，最后在1.5％氢氧化钠、1.1％甲醛、0.00025％硫代硫酸钠溶液中显色至有明显条带出现。由于保持系与恢复系的育性恢复位点DNA序列差异，导致内切酶SspI识别位点不同。若材料扩增产物有2个酶切位点(产生3个酶切片段，大小分别为1538、629、363bp)，则表明该萝卜自交系携有育性恢复基因，在CMS雄性不育系培育过程中，此类材料不可做为候选保持系，应将其淘汰；如果仅有1个酶切位点(产生2个酶切片段，大小分别为2167、363bp)，表明该萝卜自交系不携有育性恢复基因，适宜做为候选保持系，用于CMS雄性不育系培育。图2为引物NAUrfoF4与NAUrfoR4扩增产物SspI酶切结果：对此1～11号材料进行恢复基因功能标记分析，育性恢复位点DNA扩增产物(NAUrfoF4与NAUrfoR4)经SspI酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，材料2扩增产物有2个酶切位点(产生3个酶切片段，大小分别为1538、629、363bp)，则表明该自交系携有育性恢复基因，在CMS雄性不育系培育过程中，此类材料不可做为候选保持系(如图2中材料2)，应将其淘汰；材料1与材料5～11仅有1个酶切位点(产生2个酶切片段，大小分别为2167、363bp)，表明该自交系不携有育性恢复基因，适宜做为不育系培育的候选保持系(如图2中材料1，材料5～11)；材料3，4产生4个酶切片段(2167、1538、629、363bp)，则表明此材料育性恢复位点为杂合状态，不育系测交、转育中后代会产生育性分离(如图2中材料3与4)，应当将此材料自交使其育性恢复位点纯合。

对胞质不育基因鉴定中未扩增出1069bp特异片段的自交系，表明该萝卜自交系不携有育性恢复基因，适宜做为候选保持系，可进一步用恢复基因特异标记引物NAUrfoF10与NAUrfoR10进行PCR扩增，快速鉴定育性恢复基因存在与否。PCR扩增采用10uL反应体系，包含1×buffer，1.8mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，正、反向引物各0.6μM，0.5U Taq DNA聚合酶，20ng DNA。扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 50s，50℃ 50s，72℃ 1.5min，32个循环；72℃延伸10min。扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，能够扩增出575bp单一特异片段的自交系不携有恢复基因，可以做为候选保持系，图3为萝卜自交系DNA的引物NAUrfoF10与NAUrfoR10扩增结果：为进一步验证育性恢复基因有无，可利用恢复基因特异标记引物NAUrfoF10与NAUrfoR10进行扩增(图3)，材料1与材料5～11能扩增出575bp特异片段，则表明这些自交系不携有恢复基因，雄性不育系培育过程中可做为候选保持系(如图3中材料1，材料5～11)，进行新型不育系培育。

(五)不育系回交转育

在不育系回交转育中，将上述候选保持系材料1、材料15～11与原始不育系L-51春A(柳李旺，龚义勤，汪隆植，等.优良萝卜新品种南春白1号，中国蔬菜，2004(2)：52)分别杂交，再用不育株做母本，将相应候选保持系材料做为轮回亲本，回交4-5次，获得一批新的CMS雄性不育系L-51春A1，L-51春A5，L-51春A6，L-51春A7，L-51春A8，L-51春A9，L-51春A10和L-51春A11，可用于杂种种子生产，其中L-51春A1与L-51春A5肉质根圆形，生食脆甜；L-51春A6，L-51春A7，L-51春A8，L-51春A9与L-51春A10春季抽薹晚，抗霜霉病，肉质根长圆柱形，品质优；L-51春A11抗病毒病，肉质根长圆柱形，商品性好。

(六)结果分析

在胞质不育基因鉴定中，利用不育基因标记引物扩增萝卜优良自交系，能够扩增出1069bp特异片段的自交系表明其具有胞质不育基因，既然是育性正常，则细胞核内必定有育性恢复基因，故不能做为CMS雄性不育系培育中的候选保持系，在CMS雄性不育系培育中需要将此类可育自交系淘汰。

未能够扩增出1069bp特异片段的自交系表明其不具有胞质不育基因，但此类自交系有无恢复基因需要进行鉴定。在恢复基因功能标记分析中，育性恢复位点DNA扩增产物(NAUrfoF4与NAUrfoR4)经SspI酶切与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测，若有2个酶切位点(产生3个酶切片段，大小分别为1538、629、363bp)，则表明该自交系携有育性恢复基因，在CMS雄性不育系培育过程中，此类自交系不可做为候选保持系，应将其淘汰；如果仅有1个酶切位点(产生2个酶切片段，大小分别为2167、363bp)，表明该自交系不携有育性恢复基因，适宜做为不育系培育的候选保持系；若产生4个酶切片段(2167、1538、629、363bp)，则表明此材料育性恢复位点为杂合状态，在不育系测交、转育中后代会出现育性分离，若要进入育种程序须先将此材料自交使其育性恢复位点纯合。

利用CMS恢复基因特异标记对胞质不育基因鉴定中未扩增出1069bp特异片段的可育自交系进行分析，可以快速鉴定出育性恢复基因存在与否，不包含恢复基因的可育自交系能扩增出575bp特异片段，此类自交系可以做为候选保持系用于CMS雄性不育系培育。获得优良候选保持系后，在不育系回交转育中，将其与原始不育系分别杂交，再将相应候选保持系材料做为轮回亲本，回交4-5次，即可获得新的CMS雄性不育系，用于杂种种子生产中。

本发明建立了分子标记辅助选择筛选萝卜候选保持系的技术体系，与田间鉴定结果完全一致，能够快速、准确地筛选出候选保持系，可以实现苗期选择，不受植株生长阶段的限制，并且缩短了保持系筛选的时间，减少了工作量，可以大大提高新型CMS不育系的培育效率，加快萝卜优良F₁杂种选育进程。