一种鸭疫里默氏杆菌疫苗生产用培养基及其制备方法

摘要

本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌疫苗生产用培养基，包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的组分及比例为：胰蛋白胨1.5-1.9％；酵母提取物0.2-0.7％；牛肉浸膏0.2-0.7％；水解乳蛋白0.2-0.7％；葡萄糖0.1-0.4％；NaCl 0.5％；磷酸二氢钾0.1-0.7％；磷酸氢二钾0.1-0.7％；Na2HPO4·12H2O，0.5-0.9％；(NH4)2SO4，0.1-0.2％；NH4Cl 0.01-0.03％；其中所述各组分的百分比为重量/体积百分比；所述添加物为采用颈静脉采血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健壮牛血并无菌脱纤，于-20℃和室温冻融，反复冻融3次后，保存于-20℃备用或采血并无菌脱纤后直接保存于-20℃，使用前取出反复冻融3次。该培养基可降低成本；增加了营养；克服用活体动物或胚胎培养操作复杂和人工成本高的不足；可以用于大规模发酵生产鸭疫里默氏杆菌疫苗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌疫苗生产用培养基及其制备方法。

背景技术

鸭传染性浆膜炎是发生于家鸭、鹅、火鸡和多种禽类的一种接触性传染病，又称鸭疫里默氏杆菌病、鸭疫巴氏杆菌病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫败血症和新鸭病，其病原为鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)。该病呈急性败血症或慢性感染，临床上主要表现为咳嗽、喘气、下痢、眼鼻分泌物增多、共济失调和头颈震颤，少数慢性病例出现头颈歪斜等症状；典型病变为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎和干酪性输卵管炎。该病一年四季均可发生，以冬季发病严重，主要经污染的饲料、饮水、飞沫等传播；1-8周龄的鸭高度敏感，尤以2-3周龄的雏鸭发病率较高，可达90％；死亡率受多种因素的影响，差别较大，常为10-20％，但也有的高达60-75％。应激因素如饲养密度过大、通风不畅、卫生条件差、气候突变等，可诱发该病的发生，死亡率大大提高；耐过鸭可表现神经症状，生长发育缓慢、消瘦，饲料报酬下降，严重影响生产成绩，造成严重的经济损失。

鸭传染性浆膜炎是目前对世界各国养鸭业造成危害最为严重的传染病之一，在世界范围内分布，几乎在所有采用集约化养鸭生产的国家都有发现，给世界养鸭业造成了巨大的经济损失。我国是一个养鸭大国，养鸭业在我国的农业经济中占有着重要的地位，也是人们生活所需肉蛋的重要来源之一，鸭传染性浆膜炎在我国各养鸭地区的流行较严重，是我国养鸭场(特别是商品鸭场)最难于对付、造成养鸭业经济损失的最主要传染病之一，加之RA的耐药性逐渐增强，给我国养鸭业造成了巨大经济损失。

由于鸭传染性浆膜炎给养鸭业带来严重的经济损失，有关其免疫预防研究引起了越来越多的关注。尽管RA血清型较多，各型之间基本无交叉保护作用，给疫苗的研制带来了较大的困难，但因疫苗接种是预防鸭疫里默氏菌的有效措施，因此RA疫苗的研究引起了兽用生物制品领域科研人员的广泛关注，目前研究报道的RA疫苗主要有RA灭活疫苗(只有一种血清型的单价灭活疫苗、含多种血清型的多价灭活疫苗)、RA和E.coli二联灭活疫苗、RA弱毒活疫苗、提取获得RA亚单位成分的亚单位疫苗。但目前国内外还没有政府批准生产使用鸭疫里默氏菌疫苗，多是自家场疫苗(即自己小量生产，自己使用)。

不管生产鸭疫里默氏菌疫苗的何种类型的疫苗，其基础均涉及鸭疫里默氏菌的培养，但鸭疫里默氏菌的培养条件要求极高，在普通的细菌培养配方或基质上难以生长，目前鸭疫里默氏菌培养过程中所涉及的培养基质主要有以下几类：第一类是商品化专用培养基，如胰酶大豆肉汤、脑心肉汤等，这类培养基价格较高；第二类是在普通培养基中加入较高比例的动物血或血清(如10％犊牛血清或脱纤羊血的营养肉汤)；第三类是用动物或活胚进行培养。上述三类培养基质中，动物或活胚培养较繁琐、工作量大，且不能用于工厂化的大规模发酵生产；第一类商品化专用培养基和第二类在普通培养基中加入较高比例动物血或血清的方法成本高且目前未有用于工厂化大规模发酵生产的效果报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭疫里默氏杆菌疫苗生产用的培养基(命名为：N-J合成培养基)，可用于鸭疫里默氏杆菌大规模发酵，并可降低鸭疫里默氏菌疫苗的生产中鸭疫里默氏菌的大规模发酵这一生产环节的成本。

本发明的鸭疫里默氏杆菌疫苗生产专用培养基(N-J合成培养基)极其适合鸭疫里默氏杆菌大规模发酵，包括基础培养基成分及配比、添加物及其预处理方法与比例、培养基的制备程序。

一种鸭疫里默氏杆菌疫苗生产用培养基，包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的组分及比例为：胰蛋白胨，1.5-1.9％；酵母提取物，0.2-0.7％；牛肉浸膏，0.2-0.7％；水解乳蛋白，0.2-0.7％；葡萄糖，0.1-0.4％；NaCl，0.5％；磷酸二氢钾，0.1-0.7％；磷酸氢二钾，0.1-0.7％；Na₂HPO₄·12H₂O，0.5-0.9％；(NH₄)₂SO₄，0.1-0.2％；NH₄Cl，0.01-0.03％；其中所述各组分的百分比为重量/体积百分比；所述添加物为采用颈静脉采血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健壮牛血并无菌脱纤，于-20℃和室温冻融，反复冻融3次后，保存于-20℃备用或采血并无菌脱纤后直接保存于-20℃，使用前取出反复冻融3次。

所述的鸭疫里默氏杆菌疫苗生产用培养基，所述添加物的用量为：裂解血球全血按体积比0.8-1.5％加入基础培养基中。

一种鸭疫里默氏杆菌疫苗生产用培养基的制备方法，包括以下步骤，首先根据权利要求1所述配比称取所需基础培养基组分后121℃灭菌15分钟，待灭菌成分冷却至低于40-50℃时将所述添加物加入所述基础培养基中，摇匀后即得成品培养基。

所述的鸭疫里默氏杆菌疫苗生产用培养基的制备方法，所述添加物的用量为：按体积比0.8-1.5％加入基础培养基中。

例如：配置100ml基础培养基的具体配方为：胰蛋白胨，1.8g；酵母提取物，0.4g；牛肉浸膏，0.4g；水解乳蛋白，0.4g；葡萄糖，0.2g；NaCl，0.5g；磷酸二氢钾，0.2g；磷酸氢二钾，0.2g；Na₂HPO₄·12H₂O，0.5g；(NH₄)₂SO₄，0.1g；NH₄Cl，0.01g；水，加至100mL；将上述各组分121℃灭菌15分钟，待灭菌成分冷却至低于50℃时，然后向上述基础培养基中加入添加物裂解血球全血1ml；摇匀后即得成品N-J合成培养基。

由于本发明的鸭疫里默氏杆菌培养基采用多种成分的基础培养基和裂解血球预处理的全血作为添加物，可以用于鸭疫里默氏杆菌大规模发酵生产鸭疫里默氏杆菌疫苗，同时可降低培养基成本、克服用活体动物或胚胎培养操作复杂和人工成本高等问题，在鸭疫里默氏杆菌的培养、大规模发酵及生产鸭疫里默氏杆菌疫苗中具有极大的优势或不可替代的作用。

一、降低成本。由于基础培养基的成分是价格低的常规试剂，而添加物裂解血球全血经过预处理，血球所包含的营养物充分的释放，加入血的比例大大降低，所以成本比商品化专用培养基(胰酶大豆肉汤、脑心肉汤等)和加入10％犊牛血清或脱纤羊血的营养肉汤培养基的成本大大降低。

二、增加了营养，缩短了培养时间。由于对添加的血球进行多次裂解的预处理，血球裂解后，营养成分完全释放到培养基中，一方面大大增加了营养，同时使细菌尽快接触和利用到所需的必须营养物，因此缩短了培养时间。

三、克服用活体动物或胚胎培养操作复杂和人工成本高的不足。用活体动物或胚胎培养需要对一个一个的体动物或胚胎进行接种，收获菌体时也是对一个一个的体动物或胚胎进行收集，因此操作复杂，花费大量的人力，人工成本高。而采用本培养基可用于鸭疫里默氏杆菌大规模发酵生产鸭疫里默氏杆菌菌体，操作简便，省时省力，人工成本低。

四、可以用于大规模发酵生产鸭疫里默氏杆菌疫苗。目前的各种培养基质都是在实验室研究或小规模生产条件下，未有采用发酵罐用于大规模发酵生产鸭疫里默氏杆菌疫苗的实例，而本发明可以用于大规模发酵生产鸭疫里默氏杆菌疫苗。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

0.8％裂解血球全血N-J合成培养基制备：

配置100ml的0.8％裂解血球全血N-J合成培养基：胰蛋白胨：1.5g；酵母提取物：0.4g；牛肉浸膏：0.5g；水解乳蛋白：0.6g；葡萄糖：0.2g；NaCl：0.5g；磷酸二氢钾：0.18g；磷酸氢二钾：0.18g；Na₂HPO₄·12H₂O：0.7g；(NH₄)₂SO₄：0.12g；NH₄Cl：0.02g；水加至100mL；将上述各组分121℃灭菌15分钟，待灭菌成分冷却至低于50℃时，然后向上述基础培养基中加入添加物裂解血球全血0.8ml；摇匀后即得成品N-J合成培养基。

所述添加物裂解血球全血为采用颈静脉采血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健壮牛血并无菌脱纤，于-20℃和室温冻融，反复冻融3次后，保存于-20℃备用或采血并无菌脱纤后直接保存于-20℃，使用前取出反复冻融3次制得。

实施例2

1％裂解血球全血N-J合成培养基制备：

配置100ml的1％裂解血球全血N-J合成培养基：胰蛋白胨：1.9g；酵母提取物：0.7g；牛肉浸膏：0.7g；水解乳蛋白：0.7g；葡萄糖：0.4g；NaCl：0.5g；磷酸二氢钾：0.3g；磷酸氢二钾：0.3g；Na₂HPO₄·12H₂O：0.9g；(NH₄)₂SO₄：0.2g；NH₄Cl：0.03g；水加至100mL；将上述各组分121℃灭菌15分钟，待灭菌成分冷却至低于40℃时，然后向上述基础培养基中加入添加物裂解血球全血1ml；摇匀后即得成品N-J合成培养基。

所述添加物裂解血球全血为采用颈静脉采血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健壮牛血并无菌脱纤，于-20℃和室温冻融，反复冻融3次后，保存于-20℃备用或采血并无菌脱纤后直接保存于-20℃，使用前取出反复冻融3次制得。

实施例3

验证试验：

1试验目的

筛选出鸭传染性浆膜炎灭活疫苗发酵用的最优培养基。

2试验设计

通过不同的培养基发酵培养血清I型鸭疫里默氏杆菌后，测定其培养物中的菌数并比较其成本。

3材料

3.1菌种 血清I型鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株。

3.2鸡胚 购自鸡场孵化至10日龄的鸡胚。

3.3试剂 普通肉汤、牛肉膏购自杭州微生物试剂公司；胰酶大豆肉汤、蛋白胨、胰蛋白胨、水解乳蛋白、酵母提取物购自BD公司；NaCl、MgSO₄.7H₂O、葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、Na₂HPO₄·12H₂O、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、维生素B1为国产分析纯，新生牛血清为国产。

3.4培养基 10％血清的普通肉汤、胰酶大豆肉汤、10％血清的胰酶大豆肉汤、1％裂解血球全血N-J合成培养基及检验用培养基均严格按《中国兽药典》附录进行生产和检验合格后备用；1％裂解血球全血N-J合成培养基配方采用实施例2所列配方。

4方法

RA经血平板活化培养后，接种于含10％犊牛血清的普通肉汤，置37℃培养24小时，取样作纯粹检验合格后，按2％的接种量分别接种于10％血清的普通肉汤、胰酶大豆肉汤、10％血清的胰酶大豆肉汤、P-L肉汤、10％血清P-L肉汤和1％裂解血球全血N-J合成培养基中，培养罐中培养，鸡胚按常规方法绒毛尿囊腔接种和收取胚液/胚体，测定并比较几种培养物及胚液/胚体混合物中细菌计数结果和培养基的价格，产量高、性价比好的作为定型生产工艺。

5结果评估

5.1结果判定 根据细菌计数结果判定各种培养基的生产菌量，根据各种培养基的生产菌量和培养基价格判定选用何种培养基。

5.2试验的有效性 本实验使用的理论和技术成熟，结果判定指标客观，整个实验的各个环节严格操作、正确评估实验结果，结果如有疑议至少重复操作2次。每一次试验规模稳定，由此认为本实验结果有效。

6结果

见下表1：

表1不同培养基培养物中细菌计数、培养基价格及性价比

该血清I型鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株在10％血清的胰酶大豆肉汤和1％裂解血球全血N-J合成培养基中的产量最高，在P-L肉汤中产量最低；P-L肉汤和1％裂解血球全血N-J合成培养基的价格最低；用1％裂解血球全血N-J合成培养基培养性价比最好。

7结论

该试验结果表明，1％裂解血球全血N-J合成培养基适合作鸭疫里默氏杆菌大规模发酵的培养基，鸭传染性浆膜炎灭活疫苗生产用培养基可用1％裂解血球全血N-J合成培养基作为定型生产工艺。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。