从珍贵橙色束丝放线菌发酵液中分离纯化安丝菌素的方法

摘要

本发明涉及生物药品有效成分的分离方法，具体涉及的是一种从珍贵橙色束丝放线菌粗提物中分离纯化两种安丝菌素的方法。该方法采用逆流色谱法，其溶剂体系由体积比范围为a∶b∶c∶d＝1～0.4∶1∶1～0.4∶1的四种组分构成；其中a组分为正己烷或环己烷；b组分为乙酸乙酯或乙酸正丁酯；c组分为甲醇或乙醇；d组分为水。本发明方法是一种简单、高效和经济的分离纯化安丝菌素的方法，适用于各种型号逆流色谱仪分离纯化安丝菌素单体P2和P3。如用分析型高效逆流色谱仪的小量制备、半制备型高效逆流色谱仪的大量制备和制备型高效逆流色谱仪的工业级制备。

说明书

技术领域

本发明涉及生物药品有效成分分离方法，具体涉及的是一种从珍贵橙色束丝放线菌发酵液中分离纯化两种安丝菌素的方法。 

背景技术

安丝菌素(Ansamitocins)是一种高细胞毒性抗肿瘤化合物[1-2]。它的作用机理是与微管蛋白结合从而拮抗微管蛋白组装，其作用位点与长春花碱重合。它的细胞毒性是传统化疗药长春新碱、甲氨喋呤和柔红霉素的100到1000倍[3-6]。安丝菌素的母核是大环内酯类美登醇，其同系物包括植物来源的美登素和美登普林等。 

珍贵橙色束丝放线菌能产生6种安丝菌素同系物，它们是安丝菌素P0、P1、P2、P3、P4、P4’，也产生少量安丝菌素苷。其中主要产物是安丝菌素P3，其次是安丝菌素P2，它们的细胞毒性相似。在美国此类化合物，如美登素曾进入II期临床试验[7]；在国内也曾在临床应用，药品名为美坦生。由于此类化合物细胞毒性强，临床应用副作用太大已于80年代后期退出临床治疗。近年来，由于肿瘤靶向治疗的兴起，这类强细胞毒性化合物被用于靶向治疗药物的弹头分子与抗体或配体等靶向分子偶联形成靶向复合物，其中有的正在进行II期临床试验[8-10]。目前，得到美登醇类微管抑制剂的途径大概有3种，它们分别为1、从美登木(Maytenus hookeri Loes)等植物中提取。2、全合成或半合成。3、微生物发酵。由于美登木类植物含美登素及其同系物含量很低；全合成和半合成工艺复杂，过程繁琐，产率很低。相比之下微生物发酵途径得到此类化合物是最为便捷和廉价的。然而，由于放线菌发酵液本身成份复杂，要得到高纯度安丝菌素类化合物急需一种快速和高效的分离纯化方法。传统的从放线菌发酵液中提取安丝菌素的方法一般为柱色谱法，由于柱色谱分离方法本身的局限性，如；易产生不可逆吸附、易污染、速度慢、步骤繁琐、费时等，大大降低了分离纯化的效率和发酵收益。 

高效逆流色谱技术(HPCCC)是80年代发展起来的一种与传统柱色谱方法不同的高效分离技术[11-12]。它无需固体填料，而是用两相互不混溶的溶剂体系在支撑管内做高速行星运动的方式下进行天然产物的分离纯化。因而避免了柱色谱法的一些缺点，能做到无不可逆吸附，无样品损失，高效和快速分离纯化克级(甚至公斤级)样品。 

但是，由于目标产物的性质各异，对不同的目标产物其溶剂体系和分离条件都需要单独 摸索。目前尚未有高效逆流色谱技术从珍贵橙色束丝放线菌发酵粗提物中分离纯化高纯度的安丝菌素，尤其是同时分离安丝菌素P2和安丝菌素P3的方法的报道。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从珍贵橙色束丝放线菌发酵粗提物中高效分离纯化高纯度的安丝菌素的新方法。 

解决本发明技术问题的技术方案是一种应用高效逆流色谱技术从珍贵橙色束丝放线菌发酵粗提物中分离纯化得到高纯度的安丝菌素P2和安丝菌素P3的方法。该方法中的溶剂体系由体积比范围为a∶b∶c∶d＝1～0.4∶1∶1～0.4∶1的四种组分构成；其中a组分为正己烷或环己烷；b组分为乙酸乙酯或乙酸正丁酯；c组分为甲醇或乙醇；d组分为水。 

进一步的，上述方法中溶剂体系由体积比范围为a∶b∶c∶d＝0.5～0.7∶1∶0.5～0.7∶1的四种组分构成。 

更进一步的，上述方法中溶剂体系的四种组分体积比范围为a∶b∶c∶d＝0.6∶1∶0.6∶1。 

再进一步的，上述方法中溶剂体系中的a组分为正己烷；b组分为乙酸乙酯；c组分为甲醇；d组分为水。 

具体的，上述方法包括以下步骤： 

a、在分液容器中配制溶剂体系，摇匀后静置分层；待充分平衡后，取上相为固定相，下相为流动相； 

b、将固定相泵入高效逆流色谱仪的柱内，待固定相填满后以将流动相泵入柱内建立体系的动态平衡； 

c、将珍贵橙色束丝放线菌的发酵粗提物进样后进行分离，上样浓度可以在1～25mg/ml，紫外检测波长为254nm，分别收集安丝菌素P2峰和安丝菌素P3峰。 

本发明的目的是应用高效逆流色谱技术从珍贵橙色束丝放线菌发酵粗提物中分离纯化得到高纯度的安丝菌素P2单体和安丝菌素P3单体。发酵所用珍贵橙色束丝放线菌菌株可为：Actinosynnema pretiosum subsp.ATCC 31281、Actinosynnema pretiosum subsp.ATCC31309、Actinosynnema pretiosum subsp.ATCC 31565等。上述各种珍贵橙色束丝放线菌发酵粗提物一般是指其发酵液的有机萃取物，如乙酸乙酯萃取物，丙酮提取物等。 

本发明方法可具体采用分析型或半制备型或制备型高效逆流色谱，影响高效逆流色谱分离效果的主要因素是溶剂体系种类及各组分配比的选择。本发明方法使用的溶剂体系由4个组分组成，a组分可为正己烷，环己烷；b组分可为乙酸乙酯，乙酸正丁酯；c组分可为甲 醇，乙醇；d组分为水。它们的体积配比可在1～0.4∶1∶1～0.4∶1范围内配制。体系组分最优为：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水；体积比进一步优化为0.5～0.7∶1∶0.5～0.7∶1；体积比最优为0.6∶1∶0.6∶1。使用本发明方法一次分离可以得到纯度高达98％以上的安丝菌素P2和P3，且用时很短。根据紫外检测器或应用HPLC检测，安丝菌素P2在分析型和半制备型HPCCC上出峰时间范围一般分别为：16～30分钟和26～60分钟；安丝菌素P3分别为20～40分钟和50～90分钟。 

以上所述溶剂体系中，若增加水跟b组分体积比可以让安丝菌素P2和P3的分离度处于合适的0.5～2之间，但体积比过高则会使目标化合物与杂质分离度小于最小分离度(1.5。以上分离条件适合室温在15到35摄氏度下进行。HPCCC上样浓度可以在1～25mg/ml范围内选择；半制备型逆流色谱仪分离流速可以在5～20ml/min之内选择。 

本发明的有益效果在于：本发明方法能创造性的一次同时高效从珍贵橙色束丝放线菌发酵粗提物中分离纯化得到高纯度的安丝菌素P2单体和安丝菌素P3单体。在制备级的规模下，两者的纯度都可达到98％，其回收率可达80％。同时本发明方法简便，高效，快速，具有很好的应用前景。适用于各种型号逆流色谱仪分离纯化安丝菌素单体P2和P3。如用分析型高效逆流色谱仪的小量制备、半制备型高效逆流色谱仪的大量制备和制备型高效逆流色谱仪的工业级制备。 

附图说明

图1为实施例三分离操作时的紫外检测图谱。其中标注1为安丝菌素P2，2为安丝菌素P3。 

图2为本发明的实施例四的紫外检测图谱：1为安丝菌素P2，2为安丝菌素P3。具体实施方法见实例2。 

图3为本发明的制备型HPCCC紫外检测图谱：1为安丝菌素P2，2为安丝菌素P3。具体实施方法见实例3。 

图4为本发明经制备型HPCCC分离得到的安丝菌素P2的HPLC纯度分析的紫外检测图谱。色谱条件为：流速：1ml/minute；流动相：45％甲醇和55％水梯度洗脱到90％甲醇和10％的水；色谱时间：15分钟；检测波长：233nm；柱子参数为：Xterra C18，150mm×4.6mm，5μm；HPLC系统为Waters Alliance 2695分离系统，Waters PDA2996紫外检测器。 

图5为本发明经制备型HPCCC分离得到的安丝菌素P3的HPLC纯度分析的紫外检测图谱。色谱条件为：流速：1ml/minute；流动相：45％甲醇和55％水梯度洗脱到90％甲醇和10％的水；色谱时间：15分钟；检测波长：233nm；柱子参数为：Xterra C18，150mm×4.6mm， 5μm；HPLC系统为Waters Alliance 2695分离系统，Waters PDA2996紫外检测器。 

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图进一步说明本发明的技术方案。 

实施例一 珍贵橙色束丝放线菌发酵液粗提物的制备 

本发明选用产安丝菌素的菌株Actinosynnema pretiosum subsp.ATCC 31565。发酵流程为：挑选YMG(4g/L的酵母提取物，10g/L麦芽提取物，4g/L葡萄糖，20g/L琼脂糖，pH7.2)平板培养基上的单个菌落于含5ml YMG液体培养基(4g/L的酵母提取物，10g/L麦芽提取物，4g/L葡萄糖，1.5g/L NaCl，pH7.2)的试管中，在摇床上培养2-3天，培养温度可为18-30摄氏度，摇床摇速可为150-220rpm.而后5ml菌液转于含200ml YMG培养基的种子摇瓶中培养2-3天后，菌液按4％-12％的比例接种于含发酵培养基(20g/L可溶性淀粉，20g/L葡萄糖，4g/L麦芽提取物，5g/L CaCl2，5g/L NaHCO3，PH7.2)的摇瓶中摇床培养14天，培养条件如上。发酵菌液经离心取上清后，再按1∶1的比例向发酵液中加入乙酸乙酯于15-45摄氏度温度下萃取10-15个小时后，静置分离有机相经旋转蒸发仪蒸干得安丝菌素粗提物。 

实施例二 HSCCC溶剂系统的选择及优化 

在多种待选的剂型和非极性溶剂中，经过初步筛选，确定了由4种组分组成的系统更好。其中a组分为正己烷或环己烷；b组分为乙酸乙酯或乙酸正丁酯；c组分为甲醇或乙醇；d组分为水。 

然后对各组分间的配比关系进行了进一步的筛选。表格1为本发明正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水分离溶剂体系体积配比优化表。K_AP2和K_AP3分别代表安丝菌素P2和P3的分配系数。此分配系数值宜在0.5-2之间。 

表1 溶剂体系体积配比优化表 

正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水 分配系数K_AP2分配系数K_AP31∶1∶1∶1 0.08 0.13 0.8∶1∶0.8∶1 0.21 0.35 0.7∶1∶0.7∶1 0.38 0.67 0.6∶1∶0.6∶1 0.71 1.40 0.5∶1∶0.5∶1 1.75 2.21 0.4∶1∶0.4∶1 2.10 2.51 

确定体积配比范围可为1～0.4∶1∶1～0.4∶1。体积配比范围较优为0.5～0.7∶1∶0.5～0.7∶1，最优为0.6∶1∶0.6∶1。这样的溶剂体系既可以满足安丝菌素P2，又可以满足安丝菌素P3的分离。而根据高效逆流色谱的自身特点和原理，在溶剂体系确定后，其它的操作过程和操作参数都可以根据不同的设备型号的常用参数确定。

实施例三 使用本发明方法同时分离安丝菌素P2和P3组分 

采用分析型高效逆流色谱，选用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系分离纯化珍贵橙色束丝放线菌发酵液的乙酸乙酯萃取粗提物中的安丝菌素P2和P3。 

以0.5∶1∶0.5∶1的体积配比在1升分液漏斗中配制溶液体系，震荡摇匀后室温静置分层。待充分平衡后，取上相为固定相，下相为流动相。称取粗提物4mg溶于500μl的下相流动相中等待进样。 

本实施例采用分析型HPCCC是Mini-DE HPCCC(Dynamic Extraction，Slough，UK)。配备有自带18ml进样圈、冷凝系统、进样阀、紫外检测器和记录仪。操作方法如下：先以5ml/min的流速把固定相泵入柱内，缓慢调整主体离心机转速到1950RPM。待固定相填满柱内，然后以1ml/min将流动相泵入柱内。待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，进行分离，收集目标峰。紫外检测波长为254nm。 

分离结果见图1，其中1峰即为安丝菌素P2峰，2峰为安丝菌素P3峰。其中安丝菌素P2和P3纯度由HPLC检测都达到91％以上。 

实施例四 使用本发明方法同时分离安丝菌素P2和P3组分 

采用分析型高效逆流色谱，选用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系分离纯化珍贵橙色束丝放线菌发酵液的乙酸乙酯萃取粗提物中的安丝菌素P2和P3。以0.6∶1∶0.6∶1的体积配比在1升分液漏斗中配置溶液体系，摇匀后室温静置分层。待充分平衡后，取上相为固定相，下相为流动相。称取粗提物4mg溶于500μl的下相流动相中等待进样。 

本实施例采用分析型HPCCC是Mini-DE HPCCC(Dynamic Extraction，Slough，UK)。配备有自带18ml进样圈、冷凝系统、进样阀、紫外检测器和记录仪。操作方法如下：先以5ml/min的流速把固定相泵入柱内，缓慢调整主体离心机转速到1950rpm。待固定相填满柱内，然后以1ml/min将流动相泵入柱内。待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，进行分离，收集目标峰。紫外检测波长设为254nm。 

分离结果见图2，其中1峰即为安丝菌素P2峰，2峰为安丝菌素P3峰。其中安丝菌素P2和 P3纯度由HPLC检测都达到98％以上。 

实施例五 使用本发明方法同时分离制备安丝菌素P2和P3组分 

采用半制备型高效逆流色谱，选用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系分离纯化珍贵橙色束丝放线菌发酵液的乙酸乙酯萃取粗提物中的安丝菌素P2和P3。以0.6∶1∶0.6∶1的体积配比在1升分液漏斗中配置溶液体系，摇匀后室温静置分层。待充分平衡后，取上相为固定相，下相为流动相。精密称取粗提物160mg溶于20ml的下相流动相中等待进样。 

本实施例采用制备型HPCCC是Midi-DE HPCCC(Dynamic Extraction，Slough，UK)。配备有自带总体积295ml进样圈、冷凝系统、进样阀、紫外检测器和记录仪。操作方法如下：先以5ml/min的流速把固定相泵入柱内，缓慢调整主体离心机转速到850RPM。待固定相填满柱内，然后以2ml/min将流动相泵入柱内。待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，进行分离，收集目标峰。紫外检测波长设为254nm。 

分离结果见图3。图3中1峰即为安丝菌素P2峰，2峰为安丝菌素P3峰。其中安丝菌素P2的回收率为78％，安丝菌素P3的回收率为80％。其中安丝菌素P2和P3由HPLC检测纯度都达到98％以上(安丝菌素P2的HPLC检测图见图4，安丝菌素P2的HPLC检测图见图5)。 

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