IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白

摘要

本发明公开了一种IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白，是IgG抗体亲和肽和碱性磷酸酶构成的融合蛋白，能作为替代酶标记抗体用于免疫测定，其一经产生即具有与IgG抗体的结合活性和AP催化活性，且二者标记比例为1∶1；该融合蛋白的酶比活力为386±82U/mg；与兔IgG抗体的亲和常数Ka≌6.7×107L·mol-1。本发明的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的制备方法如下：(1)将IgG抗体亲和肽基因和碱性磷酸酶基因连接，构建重组载体；(2)电转化巴斯德毕赤酵母；(3)经G418抗性压力筛选高拷贝表达菌株；(4)培养菌株，诱导表达；(5)提取纯化IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能作为酶标记抗体用于免疫测定的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白，属于生物工程领域。

背景技术

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)和辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)是酶免疫测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)中较为常用的免疫标记用酶。在ELISA中应用，AP系统的敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，因此国内在ELISA中一般均采用HRP。

碱性磷酸酶在免疫测定中作为标记用酶，是通过催化相应底物显色实现的。常用标记用酶的AP有两个来源，分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取，牛小肠碱性磷酸酶比活高达2000U/mg蛋白，大肠杆菌碱性磷酸酶比活40-60U/mg蛋白。大肠杆菌为原核生物而不能对蛋白质进行糖基化。序列分析表明AP活性中心Asp101-Ser102-Ala103序列高度保守。糖基化可能是影响其活性的重要因素，但并未得到证实。

目前，免疫酶标试剂制备方式是采用双功能试剂(如戊二醛，过碘酸盐等)将抗体与酶偶联，按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量，故制备的结合物应予以纯化。因此，传统的抗体与酶的标记方式需要交联、纯化等多步蛋白质操作；而且偶联后往往存在蛋白质活性降低，抗体-酶结合物不均一，因而降低了检测的灵敏度。

利用基因工程技术生产免疫测定标记用酶，可改变从生物体分离提纯的生产方式，也是得到符合标记要求高纯度酶的一条新途径。而将标记酶直接与抗体融合表达的方式制备，可克服化学交联剂偶联方法的弊端。

理论上尽管将碱性磷酸酶与抗体融合表达，但目前研究主要集中在单链抗体(ScFv)与AP融合蛋白的构建，但是每检测一种抗原就要制备相应的融合抗体，在不能或不便构建抗体-酶融合蛋白时则融合标记受阻。因此，寻找一种可结合多种一抗的二抗并与酶以融合表达方式来制备免疫酶标试剂具有重要意义。

IgG抗体亲和肽是来自葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SpA)的ZZ结构域。SpA为金黄色葡萄球菌细胞壁的单链多肽，分子量为42kD，能通过疏水作用结合人、兔等多种动物IgG的Fc段，且这种结合不影响IgG的Fab段与抗原特异性结合的免疫活性，根据SpA这一特性，SpA不仅用于免疫球蛋白和单克隆抗体的纯化，还被多种标记物(HRP，AP，FITC，胶体金等)偶联标记用于免疫测定；因SpA与IgG结合不受种属限制，被称为“广泛二抗”。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种无需再次标记即可用于酶免疫测定的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白(IgG affibody-Alkaline Phosphatase fusion protein，简写IgG Ab-AP)。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白，是IgG抗体亲和肽和碱性磷酸酶构成的融合蛋白，其一经产生即具有与IgG抗体的结合活性和AP催化活性，且二者标记比例为1∶1；该融合蛋白的酶比活力为386±82U/mg；与兔IgG抗体的亲和常数Ka≌6.7×10⁷L·mol^-1。

本发明的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的制备方法，步骤如下：

(1)将IgG抗体亲和肽基因和碱性磷酸酶基因连接，然后构建重组载体；

(2)电转化巴斯德毕赤酵母，选取重组载体整合到酵母基因组上的菌株；

(3)经G418抗性压力筛选高拷贝表达菌株；

(4)培养菌株，诱导表达IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白；

(5)提取纯化IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白。

具体如下：

(1)构建重组载体：首先在分泌型碱性磷酸酶基因上游和下游提供限制性内切酶切割位点Sac I及Pst I，然后通过PCR扩增不带N-信号肽及C-末端扩展肽的碱性磷酸酶基因，将其插入到IgG抗体亲和肽下游；然后在IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶基因上游和下游提供限制性内切酶切割位点Not I，通过PCR扩增并插入pPIC9K的Not I位点，构建毕赤酵母表达载体pIgG Ab-AP/9k；

(2)电转化，并选取整合成功的菌株：

①挑取巴斯德毕赤酵母单菌落，接种于5mLYPD培养基中，30℃，250rpm培养过夜，得过夜培养物；

②取100～500μL的过夜培养物接种至500mLYPD培养基中，30℃，250rpm培养至OD₆₀₀达到1.3-1.5，得菌液；

③将菌液于4℃，3000rpm离心5min，然后用500mL冰预冷的无菌水重悬菌体；

④按步骤③离心，用250mL冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

⑤按步骤③离心，用20mL冰预冷的1M的山梨醇将菌体沉淀重悬；

⑥按步骤③离心，用1mL冰预冷的1M的山梨醇重悬菌体；将细胞置于冰上；

⑦将1μg经Sal I线性化的pAb-AP/9k载体DNA加入到80μL细胞中，将混合物移至预冷的电转杯中；

⑧电转参数：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω；Gene Pulser Xcell电转进行毕赤酵母的电转化，将目的基因导入到毕赤酵母中；

⑨通过组氨酸缺陷型突变的互补筛选转化子：将电转化后的细胞立即涂布到缺少组氨酸的MD琼脂平板上，在30℃孵育48-72h；

⑩挑取MD平板的酵母单菌落，通过菌落PCR直接检查载体是否与基因组整合，选取载体与基因组整合的菌落进行下一步操作；

(3)筛选高拷贝表达菌株：将上述⑩验证正确的单菌落，用枪尖点种于含有不同G418浓度(1.0mg/mL-4.0mg/mL)的YPD平板上，30℃培养2-5天，出现G418抗性克隆；

(4)诱导表达：将通过G418压力筛选的高拷贝单菌落(G418浓度4.0mg/mL平板生长的菌落)，接种于BMGY培养基中，30℃，280rpm培养至OD₆₀₀达到2～6；3000g离心5min收集细胞，弃去上清，用BMMY培养基重悬细胞，转入BMMY培养基中，30℃，280rpm诱导蛋白表达；每24h补加一次甲醇至甲醇浓度为0.5％，120小时结束诱导；

(5)提取纯化：

①取诱导后的发酵液，4℃，10000rpm，离心10min；

②收集上清，并用0.22μm滤膜过滤，使用Millipore超滤器，4℃，4000rpm，离心30min浓缩，得浓缩发酵液；

③将10mL Ni-NTA倒入2.5×10cm柱中，用3个柱床体积的缓冲液A在4℃进行柱平衡；

④将浓缩发酵液上样，用6个柱床体积的缓冲液B清洗；

⑤用6个柱床体积的缓冲液C洗脱目的蛋白；

⑥使用Millipore超滤器，4℃，4000rpm，离心30min浓缩，将浓缩液以0.01MTBS稀释，得稀释液；

⑦将稀释液加入IgG-Sepharose-4B柱，流速0.2ml/min，以0.01MTBS洗至OD_280nm＜0.02为止，然后换用0.1mol/L pH2.3甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，流速0.2ml/min，收集洗脱液；

⑧使用Millipore超滤器，4℃，4000rpm，离心30min浓缩，即得IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白。

所述缓冲液A为50mM Tris，pH 8.0的溶液，其中，含有10mM咪唑及0.3M氯化钠。

所述缓冲液B为50mM Tris，pH 8.0的溶液，其中，含有20mM咪唑及0.3M氯化钠。

所述缓冲液C为50mM Tris，pH 8.0的溶液，其中，含有250mM咪唑及0.3M氯化钠。

经上述制备方法得到的IgG亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白具有高度均一性，无需体外标记即可用于酶免疫测定；在Dot-ELISA检测兔IgG抗体中，与常规标记的山羊抗兔IgG-AP检测效果相当。

本发明的IgG亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白是利用毕赤酵母表达的，为糖基化产物，其碱性磷酸酶活性高于从大肠杆菌提取的天然碱性磷酸酶。

本发明是利用基因工程技术直接将抗体或抗原与酶以融合的方式表达，不但避免了繁琐且低效率的酶与蛋白质的化学交联，而且无需得到纯化的酶和抗体或抗原。

本发明将碱性磷酸酶基因与IgG亲和肽重组构建IgG亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白，并利用巴斯德毕赤酵母分泌表达，该融合蛋白一经产生即具有与IgG抗体的结合活性和AP催化活性，无需再次标记即可用于酶免疫测定；同时，IgG亲和肽仅与IgG的Fc段结合，提高了与IgG亲和特异性，且无需每检测一种抗原而制备相应的融合抗体。

由背景技术可知，SpA被称为“广泛二抗”，但尽管SPA已作为一种“广泛二抗”或“替代二抗”在免疫测定中应用，但SpA的IgG结合活性来自E、D、A、B、C 5个高度同源的IgG结合结构域。研究发现，其IgG结合结构域不仅与IgG的Fc段结合，也与某些IgG的Fab段(如人IgG1的F(ab′)₂)结合。为克服其弊端，以ZZ亲和肽结构域代替SpA的5个同源IgG结合结构域，使IgG结合结构域的分子量减小到14kD，也克服了SpA与某些IgG的Fab段结合的缺点。因此本发明采用仅与IgG Fc段结合的ZZ结构域-IgG抗体亲和肽，避免对IgG的Fab段与抗原特异性结合的影响。

本发明的IgG亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白，具有IgG亲和肽和碱性磷酸酶的生物学活性，无需体外标记即可用于酶免疫测定，且其活性较常规大肠杆菌提取的碱性磷酸酶更高，本发明具有活性高、使用方便、效果好等优点。

附图说明

图1为含有融合蛋白基因的表达载体pIgG Ab-AP/9k的质粒图；

图2为IgG Ab-AP融合蛋白-山羊抗兔IgG-HRP百分结合率抑制标准曲线；

图3为IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白、山羊抗兔IgG-AP检测兔IgG抗体的对比示意图。

本发明中涉及的培养基的配方如下：

YPD：1％east Extract；2％Peptone；2％Dextrose；2％Agar；

MD：1.34％YNB；4×10^-5％Biotin；2％Dextrose；1.5％Agar；

BMGY：1％Yeast Extract；2％Peptone；100mM potassium phosphate buffer，pH6.0；1.34％YNB；4×10-5％Biotin；1％glycerol；

BMMY：1％Yeast Extract；2％Peptone；100mM potassium phosphate buffer，pH6.0；1.34％YNB；4×10^-5％Biotin；0.5％methanol。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1 IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白基因表达载体的构建

为将碱性磷酸酶基因与IgG亲和肽基因连接，首先在分泌型碱性磷酸酶基因(secreted alkaline phos-phatase，SEAP，GenBank Accession No：U35316)上游和下游提供限制性内切酶切割位点Sac I及Pst I，通过PCR扩增不带N-信号肽及C-末端扩展肽的碱性磷酸酶基因(1467bp)，插入IgG亲和肽下游(pEZZ18的Sac I及Pst I位点)；第二步在IgG亲和肽-AP基因上游和下游提供限制性内切酶切割位点Not I，通过PCR扩增并插入pPIC9K的Not I位点，构建毕赤酵母表达载体pIgG Ab-AP/9k，如图1所示。

实施例2 电转化巴斯德毕赤酵母GS115

为在巴斯德毕赤酵母GS115中转化pAb-AP/9k并随后整合进基因组中，载体首先用Sal I线性化，使用Gene Pulser Xcell电转仪电转化进行：

1)挑取酵母单菌落，接种于5mLYPD培养基中，30℃，250rpm培养过夜；

2)取100-500μL的过夜培养物接种至500mLYPD培养基中，30℃，250rpm培养至OD₆₀₀达到1.3-1.5；

3)将菌液于4℃，3000rpm离心5min，用500mL冰预冷的无菌水重悬菌体；

4)按步骤3离心，用250mL冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

5)按步骤3离心，用20mL冰预冷的1M的山梨醇将菌体沉淀重悬；

6)按步骤3离心，用1mL冰预冷的1M的山梨醇重悬菌体；将细胞置于冰上；

7)约1μg经Sal I线性化的pAb-AP/9k载体DNA加入80μL细胞，将混合物移至预冷的电转杯中；

8)按照Gene Pulser Xcell电转仪操作要求，进行毕赤酵母的电转化，将目的基因导入到毕赤酵母中；

9)通过组氨酸缺陷型突变的互补筛选转化子。将细胞立即涂布到缺少组氨酸的MD琼脂平板上，在30℃孵育48-72h；

10)挑取MD平板的酵母单菌落，通过菌落PCR直接检查载体是否与基因组整合。

实施例3高拷贝菌株的筛选及目的蛋白的表达

为了获得高拷贝的基因工程菌，使用选择压力进行筛选。将验证正确的单菌落，用枪尖点种于含有不同G418浓度的YPD平板上。点种时，按照G418浓度由低到高顺序点种平板，30℃培养。

将通过G418(4.0mg/mL)压力筛选的高拷贝单菌落，接种于25mL BMGY中，30℃，280rpm培养至OD₆₀₀达到2-6。3000g离心5min收集细胞。弃去上清，用BMMY培养基重悬细胞，转入50mL BMMY中，30℃，280rpm诱导蛋白表达；.每24h取样1mL，并补加一次甲醇至甲醇浓度0.5％，120小时结束诱导。

实施例4IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的纯化

1)取诱导一定时间的发酵液，4℃，10000rpm，离心10min。

2)收集上清，并用0.22μm滤膜过滤，使用Millipore超滤器(截留分子量为10kDa)，4℃，4000rpm，离心30min浓缩。

3)将10mL Ni-NTA倒入2.5×10cm柱中，用3个柱床体积的缓冲液A(50mM Tris，pH 8.0；0.3M氯化钠；10mM咪唑)在4℃进行柱平衡。

4)将浓缩发酵液上样，用6个柱床体积的缓冲液(50mM Tris，pH 8.0；20mM咪唑；0.3M氯化钠)清洗。

5)用6个柱床体积的缓冲液(50mM Tris，pH 8.0；250mM咪唑；0.3M氯化钠)洗脱目的蛋白。

6)使用Millipore超滤器(截留分子量为10kD)，4℃，4000rpm，离心30min浓缩，将浓缩液以适当0.01MTBS稀释。

7)将步骤6溶液加入IgG-Sepharose-4B柱，流速0.2ml/min，以0.01MTBS洗至OD280nm＜0.02为止，换用0.1mol/L pH2.3甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，流速0.2ml/min，收集洗脱液。

8)使用Millipore超滤器(截留分子量为10kDa)，4℃，4000rpm，离心30min浓缩，12％SDS-PAGE检测纯化效果。

实施例5 IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白活性鉴定

IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白是一双功能蛋白质，具有碱性磷酸酶的催化活性及与IgG抗体结合的活性。

碱性磷酸酶活性检测原理：

360μLpNPP溶液(50mM的Tris-HCl中含2mM乙酸镁，pNPP浓度0.25～10mM，pH10.0)，加入IgG Ab-AP溶液40μL(BCA法定量，武汉博士德生物公司)，37℃反应10min，3.6mL1MNaOH终止反应，测定405nm的吸光度值。

酶活力单位：在上述条件下，每分钟催化产生1μmol/L pNP所需的酶量定义为1个活性单位(U)。1mg酶所含有酶的单位数称为比活力。

根据下式计算计算活力单位

U＝M×A^-1×ε×b

其中，M＝IgG Ab-AP融合蛋白质量；A＝405nm吸光度；ε＝18700[L×mol^-1×cm^-1]；b＝1cm经测定，IgG Ab-AP融合蛋白的碱性磷酸酶比活力为386±82U/mg蛋白，比活力高于市售大肠杆菌提取天然碱性磷酸酶。

与兔IgG抗体亲和活性测定：

1)兔IgG抗体用包被稀释液稀释后(100ng/mL)包被酶标板，每孔100μL，4℃温育过夜，TBST(含0.5％Tween-20的0.01M TBS溶液，pH8.0)×5min×3次；

2)每孔加入封闭液200μL，于37℃封闭1h，TBST×5min×3次；

3将纯化的IgG Ab-AP融合蛋白以适当梯度稀释后，与山羊抗兔IgG-HRP(1∶5000)按体积比1∶1混匀；每孔加入上述混合液100μL，于37℃反应结合1h，TBST×5min×3次；

4)每孔加入TMB底物液100μL，37℃避光显色，当对照孔出现明显颜色反应时，每孔加入终止液50μL，于20min内测定450/630nm；

5)以未包被兔IgG抗体的孔为空白值，以只加山羊抗兔IgG-HRP孔的A_450/620值为B₀值，加入不同浓度的IgG Ab-AP融合蛋白与山羊抗兔IgG-HRP混合液的A_450/620值为B值。以IgG Ab-AP融合蛋白的浓度负对数(-LogC)为横坐标，以山羊抗兔IgG-HRP百分结合率(B/B₀％)为纵坐标，绘制抑制标准曲线，如图2所示。当山羊抗兔IgG-HRP百分结合率为50％时所对应的IgG Ab-AP融合蛋白浓度倒数，即为IgG Ab-AP融合蛋白与兔IgG抗体的亲和常数。

经测定，IgG Ab-AP融合蛋白与兔IgG抗体的亲和常数Ka≌6.7×10⁷L·mol^-1。

实施例6IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白在Dot-ELISA应用

1)取NC膜用铅笔作好加样方格(5mm×5mm)并作好相应标记；

2)将膜浸入0.01mol/L pH7.4的TBS中15～30min，取出用滤纸吸干；

3)将要包被的抗体(兔IgG抗体)包被稀释液稀释至工作浓度；

4)加样0.5μL于相应格内，室温自然干燥后，将NC膜片放入封闭液中振荡封闭30min；

5)将膜片放入洗涤液中振荡洗涤3次，每次30min；

6)用滤纸吸干，将膜片放入酶标记抗体溶液(山羊抗兔IgG-AP，1∶2000)或IgG Ab-AP溶液中，室温振荡30min；

7)将膜片放入洗涤液中振荡洗涤4次，每次30min；

8)将膜片浸入BCIP/NBT碱性磷酸酶显色溶液中，在振荡条件下充分显色，用流水冲洗数分钟，放入蒸馏水中终止反应。

如图3所示，IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白与山羊抗兔IgG-AP检测效果相当。