一种明胶-壳聚糖-透明质酸-硫酸肝素复合三维支架及其制备方法

摘要

本发明涉及一种明胶-壳聚糖-透明质酸-硫酸肝素复合三维支架及制备方法，属于生物医学技术领域。本发明采用明胶、壳聚糖、透明质酸及硫酸肝素四种材料，以不同的配比混合得到不同浓度的混合物，通过冷冻干燥法制取的一类明胶-壳聚糖-透明质酸-硫酸肝素多孔三维复合支架，此支架的孔径、孔隙率、降解率、吸水率等可以通过各成分含量及冷冻干燥条件来调控，能满足支架材料基本要求，可用于NS/PCs的生长、增殖及分化的研究。透明质酸使得细胞在支架中分布均匀，硫酸肝素能够结合生长因子，从而使细胞的生长增殖情况与体内情况更为相似，而且复合支架中含有更多的氨基、羧基、羟基、磺酸基、酰胺基等官能团，更适合细胞的粘附、生长、增殖等。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种组织工程三维支架材料及制备，特别涉及构建一类适于神经干/祖细胞(neural stem/progenitor cells，NS/PCs)粘附、生长、增殖及分化的明胶-壳聚糖-透明质酸-硫酸肝素复合三维支架及其制备方法。

背景技术

组织工程包括三要素：种子细胞、三维支架和生长因子，其中三维支架材料的制备至关重要。生物材料包括无机材料、高分子不降解及降解材料、蛋白质类等。无机材料及有机不降解高分子材料由于硬度大、弹性差、降解缓慢，不适宜用作神经组织工程；有机可降解高分子材料在机体内降解产物有毒性，或降解产物不能被机体利用，仅用作周围神经再生导管，如聚丙烯-聚氯乙烯等；天然蛋白质包括胶原水凝胶等，由于来源多样，易导致机体免疫排斥。它们单独使用均不适于用作中枢神经组织工程支架材料。此外，无机物与有机物并不能化学键合，存在着相分离的缺点；合成材料存在缺乏细胞识别信号、亲和性差等缺陷，而天然生物高分子降解速率又过快(Tian WM et al.，TissueEngineering，2005，11(3-4)：513-525；Stokols Set al.，Biomaterials，2006，27(3)：443-451.)，因此结合各种材料优点的复合生物支架材料的制备存在着极大的优势。

明胶(gelatin，Gel)是胶原(collagen)的水解产物，胶原是软骨、骨、皮肤和结缔组织的主要蛋白质，是构成动物细胞外基质的主要部分。胶原由于其动物源性而具有抗原性，相比之下，其水解产物明胶由于热变性而消除了抗原性。明胶中含有大量的亲水性基团，交联后的明胶海绵能促进上皮化组织生成(Sio-Mei L et al.，Materials Science and Engineering C，2008，23：36-43.)，因而是理想的组织工程用生物材料。

壳聚糖(chitosan，Cs)是一种碱性氨基多糖，是由D-氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键结合而成的一种天然聚阳离子多糖。壳聚糖在体内可被降解为氨基葡萄糖被人体吸收，具有优良的生物相容性和生物可降解性，是理想的细胞外基质材料(Ryu JH et al.，Biomaterials，2005，26(3)：319-326.)。大量的研究表明，采用壳聚糖材料制作的生物支架由于具有良好的生物相容性、无免疫原性和可生物降解等性能，已经被广泛应用于基础生物医学与临床领域。

透明质酸(hyaluronate，Ha)是细胞外基质的组分之一，具有多种作用，如保护细胞，影响细胞迁移、增殖、分化以及通过反馈作用调节合成细胞的合成能力等等，因此在组织培养中也起到关键性的作用(Schagemann JC et al.，Biomaterials，2010，31(10)：2798-2805；Masashi A et al.，Journal of BiomedicalMaterials Research Part A，2005，75(2)：494-499.)。在神经组织工程方面，Ha具有良好的神经相容性且能利于神经的再生与重建，因此在支架的形成、支架结构及改善生物性能方面发挥着重要作用。研究表明，Ha明显影响着细胞的迁移，其过程为：透明质酸→构成基质→细胞开始移动→开始合成透明质酸酶→Ha开始降解→细胞移动停止→细胞聚集(Neufang KF et al.，Rontgenblatter，1989，42(4)：180-186.)。Ha水溶性较好，容易降解，但若形成凝胶则较稳定，因此通常与胶原、明胶、壳聚糖等其它材料复合来构建支架材料。

硫酸肝素(heparin，He)是细胞外基质的重要组成部分。它具有调节渗透压、调控大分子物质的转运、形成物理屏障以及调节细胞功能等生理功能。另外，它可快速可逆地结合bFGF，从而影响bFGF的转运速度和释放速度，并保护bFGF以免其受热、酸、蛋白酶等的降解(van Wijk XM et al.，Experimental CellResearch，2010[Epub ahead of print]；Xu X et al.，The Journal of BiologicalChemistry，2007，282(4)：2363-2373.)。以硫酸肝素复合胶原蛋白结合冷冻干燥技术制备的支架材料具有纵行的、平行排列的微管结构，高度仿生神经内部空间三维结构，其微管直径为180μm，孔隙率达91％，NS/PCs在支架材料微管内呈线性平行排列，类似于神经基底膜与NS/PCs形成的Bunger带(王树森等，中华外科杂志，2005，21(2)：175-179.；陈兴泳等，中国康复医学杂志，2008，23(2)：135-137.)。

迄今为止，文献已报道采用壳聚糖-明胶、硫酸肝素-胶原、胶原-透明质酸等为材料构建的支架，但是还没有综合利用壳聚糖、明胶、透明质酸及硫酸肝素四种材料的优点制作的明胶-壳聚糖-透明质酸-硫酸肝素复合三维支架。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了以明胶(Gel)、壳聚糖(Cs)、透明质酸(Ha)、硫酸肝素(He)四种生物材料的复合三维支架及其制备方法。该三维复合支架空隙均匀，孔贯穿性好，空隙率均大于90％，有一定的机械强度，可降解，最重要的是NS/PCs在支架上的粘附率较高。

本发明将明胶-壳聚糖-透明质酸-硫酸肝素(Gel-Cs-Ha-He)复合三维支架用于NS/PCs的生长、增殖及分化的研究。NS/PCs在支架内粘附率较高，分布较均匀，生长增殖状态较好，并保持分化潜能。因此，Gel-Cs-Ha-He复合支架与NS/PCs以及含有生长因子的培养基构成了良好的体外三维环境。

本发明的技术方案包括以下内容：

一种Gel-Cs-Ha-He复合三维支架，含有如下成份：明胶1.4％～2％(W/V)，壳聚糖1.4％～2％(W/V)，透明质酸0.028％～0.04％(W/V)，硫酸肝素0.028％～0.04％(W/V)。

上述的Gel-Cs-Ha-He复合三维支架的制备方法如下：

①在60℃的水浴下，用玻璃棒搅拌，使适量的明胶、透明质酸、硫酸肝素溶于水，制成其含量分别为：1.4％～2％明胶(W/V)，0.028％～0.04％透明质酸(W/V)，0.028％～0.04％硫酸肝素(W/V)的混合溶液，静置脱泡。

②壳聚糖粉末溶于2％(V/V)的乙酸，制成1.4％～2％(W/V)的壳聚糖溶液，离心、除渣、脱泡。

③将①与②中将制备的混合溶液和壳聚糖溶液按8∶2～2∶8混合，迅速高速旋转震荡使四种成分充分混匀，制得明胶-壳聚糖-透明质酸-硫酸肝素混合溶液，静置脱泡。

④将③中制备的混合溶液注入模具，-80℃预冻4h，冷冻干燥24h，制作支架。

⑤支架成型后，以含50mmol/L 2-吗啉乙烷磺酸、50mmol/L碳化二亚胺，50mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺和40％(V/V)乙醇的交联剂室温交联支架6h；移去交联剂，以pH值7.4、0.1mol/L的Na₂HPO₄缓冲液室温孵育2h，中和残留乙酸；用40％(V/V)的乙醇清洗，双蒸水冲洗至中性，预冻2h，再次冷冻干燥24h，即得Gel-Cs-Ha-He复合三维支架。(不加透明质酸和硫酸肝素原料制备的Gel-Cs复合支架作为对照)。

选择结构较好的Gel-Cs-Ha-He复合支架和不含透明质酸、硫酸肝素的Gel-Cs复合支架，将其修剪为直径0.4cm，高0.4cm的圆柱体，该支架经环氧乙烷消毒，4℃保存备用。通过电镜扫描检测等方法来确定支架的孔形貌、孔分布情况，测定支架的孔径、孔隙率、降解率、吸水率等。

NS/PCs的体外分离培养及鉴定：选用孕14天(E14)小鼠引颈处死，无菌操作取出胚胎海马组织，制成分离细胞悬液。在无血清DMEM/F12培养基中采用悬浮培养方式培养，培养液中添加EGF和bFGF。7～10天后将形成NS/PCs所特有的“神经球”形态，当“神经球”长成直径约为150μm时进行传代培养。实验采用第三代细胞，应用免疫细胞化学方法鉴定NS/PCs：Nestin染色检测神经干细胞、Tuj1染色检测神经元、GFAP染色检测星形胶质细胞、GalC染色检测少突胶质细胞以及BrdU染色标记增殖的细胞。

NS/PCs在Gel-Cs-Ha-He复合支架内三维培养：选择已灭菌的Gel-Cs-Ha-He复合支架和不含透明质酸、硫酸肝素的Gel-Cs复合支架，置于96孔板内。用基础培养基(DMEM∶F12∶RPMI1640＝1∶1∶1)浸泡12h。用无菌滤纸吸干支架表面的水分，置于另一个孔板(i号)中，选择培养第三代的神经干细胞，酶解，计数，调整细胞密度，将NS/PCs灌注滴加到支架上，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱内孵育0.5h，待细胞黏附后，补加新鲜无血清培养基，4h后将支架移至另一孔板(ii号)内，再孵育12h后，将支架移至24孔板内，补加无血清神经干细胞培养基，同时将i号板内的细胞计数为a₁，ii号板内的细胞计数为a₂。支架上实际的细胞吸附数量＝接种细胞总数-a₁-a₂，

粘附率＝上架细胞数/接种细胞总数×100％。

同时采用CCK-8试剂盒检测复合支架内NS/PCs的生长曲线，免疫荧光技术鉴定细胞的死活及其分化潜能。

本发明的效果和益处是在Gel-Cs-Ha-He复合支架基本性能参数和NS/PCs在支架内的生存增殖两方面进行严格论证，对其中蕴含的大量生物学信息也进行了深入探讨，其优点显著：

(1)Gel-Cs-Ha-He复合支架孔径主要为80-120μm，孔隙率大于90％，在体外可以降解，符合三维支架材料的基本要求。

(2)Gel-Cs-Ha-He复合支架的孔贯穿性较好，细胞在支架上的粘附率较大，约为Gel-Cs支架的2倍。

(3)Gel-Cs-Ha-He复合支架内细胞分布均匀，细胞在支架上增殖生长状态良好，细胞增殖速率为Gel-Cs支架的1.3倍。

(4)NS/PCs在Gel-Cs-Ha-He复合支架中仍然保持良好的干细胞特性，培养至第6天时增殖达到最高峰，之后进入平台区，并且在随后的14天内，细胞的数量虽然没有增加，但也没有明显减少，基本维持在平台期，显示了广泛的神经组织工程应用前景。

附图说明

图1为Gel-Cs-Ha-He复合支架的制备流程图。

图2为Gel-Cs-Ha-He复合支架的电镜扫描图。

图3为NS/PCs在Gel-Cs-Ha-He复合支架内的电镜扫描图。

具体实施方式

以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施。

实例1：

在60℃的水浴下，将明胶、透明质酸、硫酸肝素一起溶于水，制成1.4％明胶(W/V)、0.028％透明质酸(W/V)、硫酸肝素0.028％(W/V)的混合溶液；将壳聚糖粉末溶于2％(V/V)的乙酸，制成1.4％(W/V)的壳聚糖溶液，离心、除渣、脱泡；再将前面的两种溶液按5∶5的比例快速混合均匀。将此混合溶液以200μL/孔注入96孔板，-80℃预冻4h，冷冻干燥24h。支架成型之后，以含50mmol/L 2-吗啉乙烷磺酸、50mmol/L碳化二亚胺，50mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺的40％乙醇的交联剂室温交联支架6h。移去交联剂，以pH值7.4、0.1mol/L的Na₂HPO₄缓冲液室温孵育2h，以中和残留乙酸；用40％(V/V)乙醇清洗4次，30min/次，双蒸水反复冲洗至中性，预冻2h，再次冷冻干燥24h，即制得Gel-Cs-Ha-He复合三维支架。支架灭菌，将NS/PCs注入此支架，培养检测。

实例2：

在60℃的水浴下，将明胶、透明质酸、硫酸肝素一起溶于水，制成1.8％明胶(W/V)、0.036％透明质酸(W/V)、硫酸肝素0.036％(W/V)的混合溶液；将壳聚糖粉末溶于2％(V/V)的乙酸，制成1.8％(W/V)的壳聚糖溶液，离心、除渣、脱泡；再将前面的两种溶液按5∶5的比例快速混合均匀。将此混合溶液以200μL/孔注入96孔板，-80℃预冻4h，冷冻干燥24h。支架成型之后，以含50mmol/L 2-吗啉乙烷磺酸、50mmol/L碳化二亚胺，50mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺的40％乙醇的交联剂室温交联支架6h。移去交联剂，以pH值7.4、0.1mol/L的Na₂HPO₄缓冲液室温孵育2h，以中和残留乙酸；用40％(V/V)乙醇清洗4次，30min/次，双蒸水反复冲洗至中性，预冻2h，再次冷冻干燥24h，即制得Gel-Cs-Ha-He复合三维支架。支架灭菌，将NS/PCs注入此支架，培养检测。

实例3：

在60℃的水浴下，将明胶、透明质酸、硫酸肝素一起溶于水，制成2％明胶(W/V)、0.04％透明质酸(W/V)、硫酸肝素0.04％(W/V)的混合溶液；将壳聚糖粉末溶于2％(V/V)的乙酸，制成2％(W/V)的壳聚糖溶液，离心、除渣、脱泡；再将前面的两种溶液按5∶5的比例快速混合均匀。将此混合溶液以200μL/孔注入96孔板，-80℃预冻4h，冷冻干燥24h。支架成型之后，以含50mmol/L 2-吗啉乙烷磺酸、50mmol/L碳化二亚胺，50mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺的40％乙醇的交联剂室温交联支架6h。移去交联剂，以pH值7.4、0.1mol/L的Na₂HPO₄缓冲液室温孵育2h，以中和残留乙酸；用40％(V/V)乙醇清洗4次，30min/次，双蒸水反复冲洗至中性，预冻2h，再次冷冻干燥24h，即制得Gel-Cs-Ha-He复合三维支架。支架灭菌，将NS/PCs注入此支架，培养检测。

尽管本发明是一种明胶-壳聚糖-透明质酸-硫酸肝素复合三维支架和制备方法及在NS/PCs三维培养方面的用途为例来描述的，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，其它种类的细胞以及实施例的其它变形，对于本领域技术人员都是可以预料的。因此，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。