包含Aβ40多肽和铝佐剂的制剂以及纯化Aβ40多肽的方法

摘要

本发明涉及一种制剂及其用途，所述制剂包含Aβ40多肽和铝佐剂。本发明的制剂在治疗阿尔茨海默氏症中大大降低了T细胞过度反应导致的大脑炎症不良反应。本发明还涉及淀粉样变多肽β40即Aβ40多肽的纯化方法。本发明的方法使得到的淀粉样变多肽β40即Aβ40多肽纯度很高，甚至能达到95％以上，从而实现了淀粉样变多肽β40即Aβ40多肽的大规模生物工程制备。

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗阿尔茨海默氏症的制剂，更具体而言，本发明涉及一种包含Aβ40多肽和铝佐剂的制剂及其用途。另外，本发明还涉及一种纯化淀粉样变多肽β40即Aβ40多肽的方法。

背景技术

阿尔茨海默氏症(Alzheimer Disease，简称为AD)是一种神经系统退行性疾病，其基本的病理学变化是患者大脑中与记忆和认知有关的区域产生神经性病变斑块，多数情况下斑块中还产生大量的神经纤维缠结。AD的主要特征是细胞内神经元纤维缠绕和细胞外老年斑。斑块主要成分是淀粉样变多肽β(即Aβ多肽)聚合而成的淀粉样物质和其引起的营养不良或变性的神经树突和轴突。Aβ多肽是引起神经元损伤的主要原因之一。

目前对于AD的防治主要从两个方面进行，一方面是抑制Aβ多肽的大量产生、聚积和形成纤维；另一方面是清除大脑病变区已经产生的Aβ多肽、纤维和淀粉样物质。针对这两个方面，人们开发研究治疗AD药物的一个方向是免疫治疗，特别是提出了主动免疫的疫苗方法。美国ELAN公司尝试用Aβ42多肽制备主动免疫疫苗，其中所使用的佐剂是免疫佐剂QS-21。但是该疫苗在临床实验中出现了T细胞过度反应导致的大脑炎症不良反应[LETTERS，Annals of Neurology，Vol 51，No.6，June 2002，p794，Wiley-Liss，Inc.]。

另外，Aβ40多肽本身的聚合倾向性低于Aβ42多肽，由于聚合会形成毒性更高的沉淀物，因此Aβ40多肽的毒性低于Aβ42多肽的毒性。根据这些发现，人们尝试将Aβ40多肽用于治疗AD。中国专利申请CN1635119A公开了一种生产AD致病物质Aβ多肽的方法及产物，其利用Aβ多肽作为疫苗刺激机体产生抗Aβ多肽抗体，从而治疗AD。该文献制备了由人Aβ多肽序列衍生的Aβ多肽，其中Aβ多肽具有Aβ42和Aβ40氨基酸序列。

但是现有技术中没有公开由Aβ40多肽制备的用于治疗AD的疫苗制剂。令人惊奇地，本发明的发明人发现了一种使用Aβ40多肽制备的用于治疗AD的制剂，其大大降低了T细胞过度反应导致的大脑炎症不良反应。

本发明制剂中的Aβ40多肽为小分子。虽然生物工程制备表达产物(疫苗)的成本一般情况下比人工合成的要低，可以大量制备表达产物，但是由于小分子的基因表达产品难以纯化，生物工程方法通常用于大分子的蛋白。另外，现有技术如CN1635119A使用亲合层析对所得的Aβ多肽进行提纯，由于亲合层析分辨率不高，分离操作较慢，分离的分子易脱落而不稳定，尤其在生物工程方法的规模放大后，亲合层析的缺点更加突出，使其效率更加降低，以至于无法在中试规模上正常使用，因此目前本领域在中试或以上规模中越来越多地关注开发避免使用亲合层析进行提纯的生物工程方法。

令人意想不到地，本发明人还开发了一种纯化淀粉样变多肽β40即Aβ40多肽的方法，其以很高的纯度纯化用生物工程技术制备的多肽抗原Aβ40。本发明的提纯方法使得本发明的小分子基因表达产品淀粉样变多肽β40即Aβ40多肽以很高的纯度得以纯化，从而使得本发明的制剂可以通过大规模的生物工程方法进行制备。

发明内容

本发明一方面涉及一种用于治疗AD的制剂，其特征在于所述制剂包含Aβ40多肽和铝佐剂。本发明的Aβ40多肽包括野生型Aβ40多肽和突变型Aβ40多肽。在一个优选的实施方案中，本发明制剂所用的Aβ40多肽是野生型Aβ40多肽，其序列为：

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV。

在本发明的范围内，本发明制剂中的突变型Aβ40多肽可以由野生型Aβ40多肽序列的任意位点进行点突变后获得。可以用于点突变野生型Aβ40多肽序列各位点的氨基酸可以选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P(Phe)、P(Pro)、S、T、W、Y和V。在一个优选的实施方案中，突变型Aβ40多肽是在其序列第22位被点突变。在一个特别优选的实施方案中，第22位氨基酸E突变为A。第22位氨基酸被点突变为A的突变型Aβ40多肽的序列为：

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAADVGSNKGAIIGLMVGGVV。

在本发明制剂中所使用的佐剂是铝佐剂，优选所使用的铝佐剂为氢氧化铝。

另一方面，本发明涉及一种纯化淀粉样变多肽β40即Aβ40多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(a)将发酵后的重组表达的工程菌体破碎，然后离心，收集沉淀获得包涵体，

(b)在pH值维持为中性条件下使得到的包涵体裂解，然后将裂解后产物离心，获得包含目的蛋白的上清液，

(c)对所得目的蛋白进行盐析，以及

(d)将盐析后的目的蛋白分离、浓缩并除盐，获得Aβ40多肽溶液。

在一个优选的实施方案中，所述Aβ40多肽是野生型Aβ40多肽或突变型Aβ40多肽，其中突变型Aβ40多肽由野生型Aβ40多肽序列的任意位点进行点突变后获得。还优选所述Aβ40多肽是是野生型Aβ40多肽序列的第22位点突变后的突变型Aβ40多肽，更优选所述Aβ40多肽是野生型Aβ40多肽序列的第22位点突变为A后的突变型Aβ40多肽。

在另一个优选的实施方案中，步骤(d)中的分离、浓缩和/或除盐通过凝胶柱层析进行，更优选除盐通过透析进行。另外，在本发明步骤(d)中也可以采用冷冻干燥法进行浓缩。

本发明纯化方法的步骤(b)中，可以使用缓冲液将pH值保持为中性，优选该缓冲液为磷酸缓冲液，还优选所述磷酸缓冲液包含DTT。缓冲液中DTT的含量可以由本领域技术人员根据具体条件进行选择，只要能实现本发明的目的。在一个具体的实施方案中，所述DTT含量为0.005mol/L，以磷酸缓冲液体积计。

另外，本发明纯化方法的步骤(b)中，裂解可以在常温下进行，优选裂解在常温下恒温进行。在一个特别优选的实施方案中，本发明纯化方法的步骤(b)中，裂解在37℃恒温进行。

通过本发明的纯化方法，使得到的淀粉样变多肽β40即Aβ40多肽纯度很高，甚至能达到95％以上，从而实现了淀粉样变多肽β40即Aβ40多肽的大规模生物工程制备。

附图简述

图1显示本发明制剂和现有技术的抗体效价测定结果比较，其中所用的免疫鼠血清按1∶4000稀释。

具体实施方案

通过以下非限制性实施例进一步阐述本发明。

实施例1.本发明制剂的制备和纯化

按照CN1635119A所述的方法构建相应DNA和表达质粒，并进行以下步骤。

一、发酵步骤

使用的发酵培养基为改良的LB培养基，其每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物：5g，NaCl：0.5g，Na₂HPO₄·7H₂O：12.8g，KH₂PO₄：3g。

将发酵罐的罐温控制在37±0.1℃，并用NH₄OH溶液调节体系pH值。在发酵后期根据工程菌生长情况可以适当调整温度，并根据需要补充培养基。根据工程菌生长情况确定发酵时间。发酵结束后放出菌液，并将发酵罐再进行一次灭菌并清洗。

用同样方法制备多个样品。

采用SDS PAGE和Western blot电泳并扫描分析方法进行检测，结果显示目的蛋白的表达量约为工程菌体总蛋白的30％。

发酵结束后，用离心方法收取工程菌体。将所得工程菌体称重，并在容器上标明批号、罐别、重量、日期。如果所得工程菌体在24小时内破菌裂解，则将样品保存于4～8℃冷库，否则应将样品置于-20℃冻存，保存时间不超过3个月。

二、纯化步骤

在获得重组表达的工程菌体之后，按照以下步骤对每个样品进行纯化：

1.采用超声破碎方法获得包涵体

将发酵步骤所得的工程菌体与缓冲液A(50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA，pH8.5)以1∶30(g∶ml)的比例充分混匀后，进行超声破碎，然后在8000rpm，4℃，30min条件下离心。离心后弃去上清液，并将所得沉淀物在缓冲液B(50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA，pH8.5，0.1-0.3％SDS，2-5％Triton X-100，5-15％甘油)中于室温下重悬3小时或于4℃下重悬过夜，然后在8000rpm，4℃，30min条件下离心。离心后弃去上清液，并将所得沉淀物再用缓冲液A洗两次，得到较纯净的包涵体。

2.包涵体的裂解

用7-8mol/L的尿素将包涵体充分变性，并将所得产物在15000rpm，4℃，30min条件下离心。离心后弃去沉淀，将上清液与20mmol/L pH7.0的磷酸缓冲液(含0.005mol/L DTT)以1∶10-1∶20的比例混匀后，将所得混合物在37℃恒温箱中放置48-72小时。然后将所得产物在8000rpm，25℃，30min条件下离心，离心后弃去沉淀，得到上清液。或者将上述的所得混合物放于室温下以进行裂解，并将裂解时间控制在48h-72h。

3.盐析

向以上步骤所得的上清液中缓慢加入NaCl晶体使得最终NaCl浓度为3-4mol/L。将所得产物在室温下放置3小时以上，然后在8000rpm，25℃，30min条件下离心，离心后弃去上清。将所得沉淀物用7-8mol/L尿素充分溶解，再用缓冲液C(25mmol/L Tris-HCl，30mmol/L NaCl，pH8.5)进行透析。得到待纯化的样品。

4.凝胶层析过滤

以Sephacry-100作为层析介质，将以上盐析后的产品进行凝胶层析过滤，使用的条件为25mmol NaCl/25mmol Tris-Cl pH8.5，并收集相应的洗脱峰。具体操作如下：

用缓冲液C平衡S-100柱两个柱体积以上，然后以适当的流速上样(上样量不超过柱床体积的3％)，以缓冲液C洗脱，收集目的蛋白峰。

将收集到的目的蛋白溶液用缓冲液D(25mmol/L Tris-HCl pH8.5)透析，即得到待浓缩的样品。

采用SDS PAGE和Western blot电泳并扫描分析方法检测，结果表明所得目的蛋白的纯度达到95％以上。

5.浓缩

用Q-Sepharose离子交换层析将纯化后的样品进行浓缩，具体步骤如下：

将Q-Sepharose介质用缓冲液D平衡5-6个柱体积，然后以适当的流速将待浓缩的样品溶液进行上样。上样完成后，再用缓冲液D洗2个柱体积，然后用缓冲液D+300-500mmol/L NaCl进行洗脱，收集洗脱峰，得到浓缩的目的蛋白溶液。

6.除盐

将所得的目的蛋白浓溶液用20mmol/L pH7.0的磷酸缓冲液透析，即得到目的蛋白浓溶液最终产品。

实施例2.AD疫苗制剂不同配方对T淋巴细胞亚型(Th1)的抑制作用

目的和方法：用不同疫苗配方免疫刺激小鼠后，观察小鼠抗体产生、淋巴细胞增殖情况和不同淋巴细胞亚型分泌特有细胞因子的差异，分析不同疫苗配方对淋巴细胞亚型的不同刺激效果或抑制作用。

淋巴细胞亚型主要分为Th1和Th2两类，Th1细胞主要介导炎症、组织损伤和器官移植的排斥反应等，称为细胞免疫反应(或细胞毒性反应)；Th2细胞主要介导特异性抗体产生，称为体液免疫反应，Th2细胞可抑制Th1细胞介导的细胞免疫反应及其所引起的病理损伤。Aβ多肽疫苗的安全性主要应体现在：具有较高的Th2型体液免疫反应，同时尽量降低或抑制Th1型细胞毒性反应。

实验中Aβ40指未突变的Aβ40多肽(野生型Aβ40多肽)，(E22A)指多肽中第22位氨基酸E被突变为A。所用的Al佐剂为氢氧化铝佐剂。突变可以根据现有基因分子生物学技术，用Overlap PCR技术方法进行。

一、抗体效价测定结果

所得结果显示于图1，各试验组均能刺激小鼠产生特异抗体且随时间增加，至10周左右可达预期高峰值，其中Aβ40(E22A)+Al佐剂组产生的抗体效价最高，其次为Aβ42+CFA组，Aβ42+Al组和Aβ40+Al组产生的抗体效价略低。结果表明各种配方的疫苗均能刺激抗体产生，而Aβ40突变型的抗体产生效率更优于其它各组。

二、脾细胞增殖实验结果：

用本领域常规方法进行脾细胞增殖实验，实验结果如表1所示。

表1

  组别  SI(刺激指数)均值±标准差  Aβ42+CFA  1.92±0.45  Aβ42+Al  2.10±0.42  Aβ40+Al  1.81±0.31  Aβ40(E22A)+Al  1.38±0.17  Al佐剂对照组  1.02±0.13

CFA：福氏佐剂；Al：铝佐剂，其中SI＝(加抗原刺激OD值-空白组OD值)/(未加抗原刺激OD值-空白组OD值)，用SPSS13.0软件，采用LSD法分析。所得结果如表1所示。

根据表1显示的结果可以看出：各试验组均有脾淋巴细胞增殖(与单纯Al佐剂阴性对照组比较有显著性差异，P＜0.05)，Aβ40(E22A)+Al组与其他三个疫苗配方组比较增殖率有降低，差异有显著性(P＜0.05)，提示可能仅有部分淋巴细胞增殖(主要是B细胞而缺乏T细胞)。

三、T淋巴细胞亚型检测

Th1细胞可以分泌干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子；Th2型细胞则分泌白介素4(IL-4)细胞因子。检测淋巴细胞经抗原刺激后这几种细胞因子分泌的情况，即可了解各种疫苗配方刺激淋巴细胞免疫反应的类型及强度差异。

1.Th1细胞因子测定结果

1)IFN-γ(单位：pg/ml)

表2A

 组别  均值±标准差 Aβ42+CFA  452.55±133.44  Aβ42+Al  36.56±8.15  Aβ40+Al  26.87±8.05  Aβ40(E22A)+Al  0  Al佐剂对照组  0

CFA：福氏佐剂；Al：铝佐剂；用SPSS13.0软件，采用LSD法分析。

表2A的结果显示：Aβ40+铝佐剂各组的淋巴细胞分泌IFN-γ因子明显低于Aβ42+福氏佐剂组，仅为后者的8％～6％，经统计学分析，差异具有非常显著性(P＜0.01)；而铝佐剂组之间比较，Aβ40组比Aβ42组降低28％；Aβ40之间比较，突变的Aβ40(E22A)又比未突变的低(突变Aβ40与单纯佐剂的一样，已检测不到IFN-γ的分泌)，差异具有非常显著性(P＜0.01)。

为了进行更全面比较，发明人进行另一组Th1细胞因子(IFN-γ)测定，结果如下：

IFN-γ(单位：pg/ml)

表2B

 组别  均值±标准差 Aβ40(E22A)+CFA(福氏佐剂)  333.230±177.259 Aβ42+Al  234.028±120.748 Aβ40+Al(铝佐剂)  117.563±115.696 Aβ40(E22A)+Al  53.056±24.479 Al佐剂对照组  0

CFA：福氏佐剂；Al：铝佐剂；用SPSS13.0软件，采用LSD法分析。

表2B的结果显示：Aβ40突变(E22A+Al)组与未突变的Aβ40(40+Al)组比较，代表T细胞炎症反应的Th1亚型降低50％，与Aβ42(42+Al)比较降低77％，与福氏佐剂比较(E22A+CFA)降低84％。差异均有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。

2)IL-2(单位：pg/ml)

表3

 组别  均值±标准差 Aβ42+CFA  650.19±258.53 Aβ42+Al  110.88±54.19  Aβ40+Al  57.90±32.90  Aβ40(E22A)+Al  48.85±18.97  Al佐剂对照组  0

CFA：福氏佐剂；Al：铝佐剂；用SPSS13.0软件，采用LSD法分析。

表3的结果显示：Aβ40+铝佐剂各组的淋巴细胞分泌IFN-γ因子明显低于Aβ42+福氏佐剂组，仅为后者的17％～8％，经统计学分析，差异具有非常显著性(P＜0.01)；铝佐剂组之间比较，Aβ40组又比Aβ42组低50％，差异具有显著性(P＜0.05)。

3)TNF-α(单位：pg/ml)

表4

  组别  均值±标准差  Aβ42+CFA  246.35±103.52  Aβ42+Al  86.48±32.38  Aβ40+Al  35.95±11.73  Aβ40(E22A)+Al  28.98±9.45  Al佐剂对照组  0

CFA：福氏佐剂；Al：铝佐剂；用SPSS13.0软件，采用LSD法分析。

表4的结果显示：Aβ40+铝佐剂各组的淋巴细胞分泌IFN-γ因子明显低于Aβ42+福氏佐剂组，仅为后者的35％～12％，经统计学分析，差异具有非常显著性(P＜0.01)；铝佐剂组之间比较，Aβ40组明显低于Aβ42组，差异具有非常显著性差异(P＜0.01)。

2.Th2细胞因子(IL-4)测定结果

IL-4(单位：pg/ml)

表5A

  组别  均值±标准差  Aβ42+CFA  28.96±15.01  Aβ42+Al  16.85±8.84  Aβ40+Al  22.87±12.45  Aβ40(E22A)+Al  21.94±10.02  Al佐剂对照组  0

CFA：福氏佐剂；Al：铝佐剂；用SPSS13.0软件，采用LSD法分析。

表5A的结果显示：福氏佐剂组的IL-4量略高于铝佐剂组，但经统计学分析，各试验组之间没有显著性差异(P≥0.05)，提示各组之间对B细胞的刺激作用没有显著差异。

为了进行更全面比较，发明人进行另一组Th2细胞因子(IL-4)测定，结果如下：

IL-4(单位：pg/ml)

表5B

 组别  均值±标准差 Aβ40+Al  86.875±7.955 Aβ42+Al  77.333±21.530 Aβ40(E22A)+Al  95.250±2.121 Aβ40(E22A)+CFA  86.250±12.374 Al佐剂对照组  0

CFA：福氏佐剂；Al：铝佐剂；用SPSS13.0软件，采用LSD法分析。

表5B的结果显示：各试验组之间没有显著性差异(P≥0.05)。

二.小鼠左侧大脑皮质中细胞因子检测结果

1.TNF-α(单位：pg/ml)

表6

  组别  均值±标准差  Aβ42+CFA  128.35±19.57  Aβ42+Al  125.85±28.47  Aβ40+Al  113.92±36.49  Aβ40(E22A)+Al  120.37±30.79  Al佐剂对照组  120.85±42.40  正常鼠对照组  119.12±22.61

表6的结果显示：各试验组之间经统计学分析没有显著性差异(P≥0.05)。

2.IL-6(单位：pg/ml)

表7

 组别  均值±标准差 Aβ42+CFA  20.29±9.17 Aβ42+Al  16.64±4.19 Aβ40+Al  31.79±22.13 E22A Aβ40+Al  25.79±12.13  Al佐剂对照组  29.14±13.13  正常鼠对照组  29.00±11.45

CFA：福氏佐剂；Al：铝佐剂；用SPSS13.0软件，采用LSD法分析。

表7的结果显示：各组之间标准差较大，经统计学分析，各试验组之间没有显著性差异(P≥0.05)。

从实施例2的实验结果可以得出以下结论：

1、Aβ40多肽突变(E22A+Al)组与其它各组比较，代表T细胞炎症反应的Th1亚型有明显降低，差异有显著性(P＜0.05)。

2、各种疫苗配方对淋巴细胞的增殖总数和抗体产生的刺激均没有显著差异，但对淋巴细胞的亚型(主要代表T细胞反应的Th1亚型)刺激有明显的差异。Aβ40多肽突变型加氢氧化铝佐剂配方可明显降低T细胞炎症反应。

应该理解以上是对本发明优选实施方案的举例说明，本发明的范围不仅限于此。对于在本发明精神、主旨、实质范围内所作的任何修改、变化和变型，都应当包含在本发明范围内。本申请要求保护的范围由本申请权利要求所限定的范围确定。