一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液

摘要

本发明涉及一种可直接静脉用的间充质干细胞冻存液及其制备方法。该冻存液中不含胎牛血清，不仅价格低廉，而且可直接用于静脉注射，临床应用安全。本发明的冻存液可以保持间充质干细胞90％以上活力2个月以上，可以满足大多数间充质干细胞治疗一个疗程的需要。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种可直接静脉用的间充质干细胞冻存液及其制备方法。

技术背景

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，其在骨髓、胎盘、脐带、羊膜、肌肉、胎儿肝脏、脐血等组织中广泛存在。间充质干细胞不仅具有多向分化的能力，还具有支持造血、调节免疫等作用，因其具有来源广泛、取材方便、体外扩增简单迅速、扩增培养后分化能力不变等优点，在临床疾病的治疗中具有广阔的应用前景。目前，国内外已经将人间充质干细胞应用于大量的动物试验、临床试验及治疗中，结果表明了间充质干细胞应用于人体的安全性及其治疗疾病的有效性。

间充质干细胞应用于人体的途径有静脉输注、局部注射、介入给予细胞等方式，静脉输注这种方式因其操作简单、调节全身免疫状态效果好等优点成为比较常用的方法，临床间充质干细胞应用一个疗程通常需要输注间充质干细胞多次，每次输注相隔一定时间，一个疗程大约1-2个月完成。

国内现有冻存液技术是将胎牛血清、细胞培养基及DMSO(二甲基亚砜)按照一定比例混合长期保存间充质干细胞。由于DMSO具有一定的副作用，因此临床应用通常控制在5％-10％浓度范围内，临床使用的血小板冻存液中含有5％的DMSO，使用时直接将冰冻细胞融化后输入人体，用来治疗出血性疾病。骨髓移植是治疗血液系统疾病常用的方法，冻存骨髓干细胞的冻存液中通常含有10％DMSO，骨髓移植时将冷冻的干细胞直接融化后输注血液病患者，无须洗涤去除DMSO，因此10％DMSO直接应用于人体是安全的。但是冻存液中的胎牛血清及细胞培养基需要在间充质干细胞应用前经过反复洗涤去除。

另外一种间充质干细胞冻存液中虽然不含有胎牛血清，而是以细胞培养基、人白蛋白及DMSO配制成间充质干细胞冻存液，但是其保持细胞活力的时间比较短，无法满足临床应用1个疗程的时间要求，细胞使用前仍需去除其中的细胞培养基。

有文献报道细胞在接触胎牛血清时会内吞胎牛血清，因此，长期接触胎牛血清有可能引起细胞某些蛋白表达及特性的变化，细胞回输人体后有可能引起过敏反应，因此临床应用于人体的细胞制品最好不要接触动物源的异种血清。

细胞培养基通常被科研机构用来体外培养及冻存细胞，然而临床使用的细胞制品中不应该含有细胞培养基，一方面品质较好的细胞培养基价格不菲，另一方面细胞培养基因厂家及批号的不同性质不全相同，目前还没有被批准临床使用。

因此，利用现有技术冻存液冻存间充质干细胞，细胞使用前需要经过PBS缓冲液、生理盐水或者其他溶液稀释后离心洗涤，此种冻存液可以较好的保护细胞免受冷冻损害，但也存在不足之处。一方面如果洗涤不彻底会有胎牛血清及细胞培养基残留，应用于人体有引发过敏反应的风险，另一方面离心洗涤过程中如果操作不当、离心转速掌握不好也会对细胞造成一定的损伤。

现有另外一种保存间充质干细胞的溶液是细胞培养基、人白蛋白及肝素的混合液，此种保存液应用前无需洗涤可以直接应用于人体，但其保持间充质干细胞活性的时间短，大约在24-48小时左右，比较适合间充质干细胞应用前的临时保存。目前国内外已将间充质干细胞大量应用于临床研究及治疗中，大多数疾病的治疗1个疗程会进行1-2个月，每个疗程输注细胞不只1次，在此期间每隔一定时间输注间充质干细胞1次，因此，如果每次应用前都重新制备间充质干细胞，必然导致每次使用的细胞在制备条件及特性上有一定差异。

另外，现有技术冻存液中的有效成分为细胞培养基及胎牛血清等，除了应用于人体存在安全隐患外，价格也不菲，不同厂家、不同生产批号的试剂质量不一，因此有必要研究一种价格更低廉、使用更方便、应用更安全的间充质干细胞冻存液。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明人找到了胎牛血清的替代品，不仅价格低廉，而且可直接用于静脉注射，不会引起人体的异种蛋白免疫反应。本发明的冻存液可以保持间充质干细胞90％以上活力2个月以上，可以满足大多数间充质干细胞治疗一个疗程的需要。

本发明采用以下技术方案：

本发明的间充质干细胞冻存液采取以下方法制备，包括如下步骤：

1)将人AB血置于无菌离心管中，在1000rpm-1200rpm条件下离心15分钟；

2)吸取上清液，转移入新的离心管中，在4000g条件下离心20分钟，上清即为冻存用人AB血浆；

3)将二甲基亚砜、上述冻存用人AB血浆、勃脉力A注射液按体积比1∶3∶6混合均匀，即为间充质干细胞冻存液。

所述的间充质干细胞优选为脐带间充质干细胞，更优选是人脐带间充质干细胞。

本发明还包括用上述方法制备的间充质干细胞冻存液。

附图说明

图1：脐带间充质干细胞冻存复苏后流式细胞仪细胞表型检测结果。

技术效果

本发明间充质干细胞冻存液不含胎牛血清及细胞培养基，可直接用于静脉应用。人AB血浆原料来源方便，价格相比较进口胎牛血清而言比较低廉，并且不会引起人体的异种蛋白免疫反应；勃脉力A注射液临床上常作为一种水、电解质的补充液使用，可以加入正在输注的血液组分中，或者作为血细胞的稀释液使用。低浓度的DMSO也可以直接应用于人体。

本发明的冻存液可以保持间充质干细胞90％以上活力2个月，可以满足大多数间充质干细胞治疗一个疗程的需要，间充质干细胞治疗后2个月内任何时间可以随时取出细胞复温使用，随取随用，极大方便了临床的使用，并且临床应用安全可靠。

具体实施方式

1、冻存用人AB(型)血浆的制备

(1)将含有质量比2.5％枸橼酸钠(可不含，不影响本发明的技术效果)的人AB血(购自青岛市中心血站)置于容量为50ml的无菌离心管中，在1000rpm条件下离心15分钟；

(2)吸取上清液，转移入新的离心管中，在4000g条件下离心20分钟，去除血小板，上清即为冻存用人AB血浆，用于下述2步骤。

2、间充质干细胞冻存液的制备

I液：DMSO(二甲基亚砜，购自SIGMA)、冻存用人AB血浆、勃脉力A注射液(购自上海百特)按体积比1∶3∶6混合均匀，置于4℃备用；

II液：DMSO、胎牛血清(购自GIBCO)，DMEM培养基(购自Hyclone)按体积比1∶3∶6混合均匀，置于4℃备用。

3、人脐带间充质干细胞的冻存及复苏后活力的检测

(1)收集培养的脐带间充质干细胞，离心后分别用上述I液、II液重悬脐带间充质干细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/ml；

(2)将细胞先后在4℃条件下放置30分钟，-20℃放置2小时，-80℃放置16-18小时，然后置于液氮中。

(3)分别在冻存的第1个月、2个月、3个月从液氮中取出冻存的间充质干细胞，置于37-40℃水浴中，迅速摇晃至溶解，加入DMEM培养基，在1500rpm条件下离心10分钟，弃上清；

(4)DMEM培养基重悬脐带间充质干细胞，台盼兰染色计数细胞活性率(表1)。

(表1)

细胞存活率＝(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数×100％

结果：间充质干细胞在本发明冻存液I液中可保持细胞活力90％以上2个月，镜下观察复苏后的间充质干细胞大小均匀，细胞轮廓清晰完整，折光度好，与胎牛血清配制的冻存液冻存细胞形态无差别。

4、人脐带间充质干细胞复苏后细胞表型的检测

将冻存3个月的间充质干细胞复苏后以FITC标记的CD45、CD90、CD146(BD公司，美国)，PE标记的CD105、CD34(BD公司，美国)及HLA-DR(BD公司，美国)进行流式细胞仪检测。

结果：经过本发明冻存液I液冻存的脐带间充质干细胞高表达CD90、CD105、CD146，不表达CD45、CD34、及HLA-DR，符合间充质干细胞表型特征(如图1)。