寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法

摘要

本发明公开了一种寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法，包括下述步骤：对青霉素生产过程中产黄青霉菌细胞内的小分子代谢物进行测定；将各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；用Markerlynx软件对标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；利用本发明的方法可以快速地、准确地将青霉素发酵过程的生物标志物寻找出来，这些生物标志物为青霉菌代谢路径的改造提供靶点，从而为进一步获得高产菌株，提高青霉素产量提供理论基础。同时也为其他抗生素等生产菌的改造提供新的思路和方法。

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法。

背景技术

随着质谱技术的发展，细胞内小分子代谢物，包括有机酸，氨基酸，醇类化合物，胺类化合物，芳香族化合物及糖类等可以被高通量的检测。由于这种高通量的特点，可以从整体水平上检测细胞受到外界刺激或扰动而产生的包含上述各类物质的整体代谢水平上的变化。

青霉素是一种β-内酰胺类抗生素，尽管它是一种次级代谢产物，但由于初级碳中心代谢为青霉素的合成提供氨基酸前体，NADPH和ATP，因此它的合成与碳中心代谢密切相关。将基于高通量质谱技术的细胞内小分子代谢物的检测方法应用于工业生产过程的研究，并结合多元统计分析的方法寻找青霉素发酵过程中重要的生物标志物，更易于寻找改进工业生产的关键点。

发明内容

本发明的目的是提供一种寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法。

本发明的技术方案概述如下：

寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法，包括下述步骤：

(1)对青霉素生产过程中产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC No 3.4023细胞内的小分子代谢物进行测定：

①产黄青霉菌细胞收集及萃灭：

在产黄青霉菌的青霉素发酵过程的前期、中期和后期的各期中任选3-4个时间点，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮萃灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞；

②提取小分子代谢物：

取步骤①获得的破碎细胞20-100mg置于离心管中，加入0.5-2.0ml-40℃保存的体积浓度为50％的甲醇水溶液为提取液，并加入10μl-20μl的0.14mg/ml氘标记的丁二酸为内标物，混匀；置于液氮中反复冻融2-4次，每次冻0.5-3.0min；离心收集上清得到A液；再次加入体积浓度为50％的甲醇水溶液为提取液0.5-2.0ml，混合均匀，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混匀，并冷冻干燥；

③衍生化：

向步骤②获得的冻干的样品中加入40-60μl的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液，30-40℃水浴，进行肟化反应60-100min；再加入50-100μl的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，35-40℃水浴，进行硅烷化反应30-80min；

④用气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量：

将1μl步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度250℃-280℃，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为：初始50℃-80℃保持2min-5min，以4℃/min-8℃/min的速度升到260℃-300℃，保持3min-8min，使用EI电离源，源温230℃-260℃，检测器电压2300V-2700V，电离电压60eV-80eV，电流30μA-50μA；质谱检测范围50-800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到青霉素发酵过程中产黄青霉菌细胞内各个小分子代谢物的相对含量；

(2)主成分分析：

①将步骤(1)获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；

②用Markerlynx软件对步骤(2)中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较产黄青霉菌的青霉素生产过程中细胞内小分子代谢物的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在产黄青霉菌的青霉素生产过程中的差异就越大，便可作为青霉素发酵过程的生物标志物。

利用本发明的方法可以快速地、准确地将青霉素发酵过程的生物标志物寻找出来，这些生物标志物为青霉菌代谢路径的改造提供靶点，从而为进一步获得高产菌株，提高青霉素产量提供理论基础。同时也为其他抗生素等生产菌的改造提供新的思路和方法。

附图说明

图1为青霉素生产过程中的不同时期的青霉菌胞内小分子代谢物的主成分分析结果，1-1为青霉素工业生产过程的主成分分析得分图；1-2青霉素中试生产过程的主成分分析得分图；1-3青霉素中试&工业生产过程的主成分分析得分图；1-4青霉素中试&工业生产过程的主成分分析载荷图。

图2为青霉素中试和工业生产过程中与青霉素合成密切相关的前体氨基酸的变化图。2-1为半胱氨酸，2-2为缬氨酸，2-3为赖氨酸。

图3为青霉素中试和工业生产过程中差异表达的多胺类化合物变化图。3-1为1，4-丁二胺，3-2为1，5-戊二胺，3-3为精胺。

图4为青霉素中试和工业生产过程中差异表达的多元醇变化图。4-1为赤藓醇，4-2为木糖醇，4-3为核糖醇，4-4为山梨醇。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法，包括下述步骤：

(1)对中试和工业青霉素生产过程中产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC No3.4023(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)细胞内的小分子代谢物进行测定：

①产黄青霉菌细胞收集及萃灭：

在产黄青霉菌中试发酵或工业发酵过程的前期、中期和后期的各期中任选3-4个时间点，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮萃灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞；

②提取小分子代谢物：

取步骤①获得的破碎细胞50mg置于离心管中，加入1.0ml-40℃保存的体积比为50％的甲醇水溶液为提取液，并加入15μl的0.14mg/ml氘标记的丁二酸为内标物，混匀；置于液氮中反复冻融3次，每次冻2.0min；离心收集上清得到A液；再次加入体积比为50％的甲醇水溶液为提取液1.0ml，混合均匀，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混匀，并冷冻干燥；

③衍生化：

向步骤②获得的冻干的样品中加入50μl的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液，35℃水浴，进行肟化反应80min；再加入80μl的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，37℃水浴，进行硅烷化反应60min；

④用气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量：

将1μl步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度270℃，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为：初始70℃保持3min，以5℃/min的速度升到290℃，保持5min，使用EI电离源，源温250℃，检测器电压2500V，电离电压70eV，电流40μA；质谱检测范围50-800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到产黄青霉菌中试发酵或工业发酵过程产黄青霉菌胞内各个小分子代谢物的相对含量；一共检测到130多种青霉菌细胞内小分子代谢物，其中能鉴定到74种，见表1。

(2)主成分分析：

①将步骤(1)获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化，以消除同一样品中不同小分子代谢物之间含量的较大差异对主成分分析结果的影响。

②用Markerlynx软件对步骤(2)中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较产黄青霉菌中试和工业生产过程中细胞的代谢状态的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在产黄青霉菌中试和工业生产过程中的差异越大，便可作为区分中试与工业青霉素发酵过程的生物标志物。

从图1-1(青霉素工业生产过程的主成分分析得分图)，图1-2(青霉素中试生产过程的主成分分析得分图)，和图1-3(青霉素中试&工业生产过程的主成分分析得分图)中可以得到：青霉素中试和工业发酵两个过程中的不同阶段(前期，中期和后期)都能各自区分开，并且两个过程的前期可以明显的区分开，而中期和后期都聚在一起，这说明两种不同的发酵模式的差异主要发生在发酵前期，而中、后期的差别不大，可以通过调节发酵前期的工艺过程和参数来提高工业过程中青霉素的产量。从图1-4(青霉素中试&工业生产过程的主成分分析载荷图)中可见，区分中试与工业青霉素发酵过程的生物标志物包括半胱氨酸，缬氨酸，赖氨酸，1，4-丁二胺，1，5-戊二胺，精胺，山梨醇，核糖醇，木糖醇和赤藓醇。

从图2中可见，与青霉素合成密切相关的前体氨基酸(半胱氨酸，缬氨酸和赖氨酸)的含量在中试和工业过程中的青霉菌细胞内差别明显，工业发酵过程中，三个前体氨基酸在前期略低于中试过程；在中期(50-130h)工业过程的氨基酸出现明显的增加，而中试中只有一个很微小的增加。这三个前体氨基酸在两个过程中的差异可能与青霉素生产的差别密切相关。

从图3中可见，青霉菌细胞内的多胺类化合物(1，4-丁二胺，1，5-戊二胺和精胺)在工业过程一直处于较低水平；在中试过程中的前期含量很高，中期开始迅速下降，后期含量和中试的结果相近。他们的含量在中试与工业青霉素发酵过程差别仍发生在发酵前期。

从图4中可见，青霉菌细胞内的多元醇(山梨醇，木糖醇，核糖醇和赤藓醇)在中试和工业过程中都呈现出增加的趋势。但从整体上看，中试过程醇类的含量高于工业过程。中试发酵在前期(20h左右)多元醇就增加到最高的水平；而工业过程中，前期较稳定，直到80h才迅速增加到比较高的水平。多元醇对细胞具有保护作用，中试中较高的水平可能有利于细胞生长和代谢。

表1：实施例1所测得的青霉菌细胞内小分子代谢物的种类

实施例2

寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法，其特征是包括下述步骤：

(1)对中试和工业青霉素生产过程中产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC No3.4023细胞内的小分子代谢物进行测定：

①产黄青霉菌细胞收集及萃灭：

在产黄青霉菌中试发酵或工业发酵过程的前期、中期和后期的各期中任选3-4个时间点，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮萃灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞；

②提取小分子代谢物：

取步骤①获得的破碎细胞20mg置于离心管中，加入0.5ml-40℃保存的体积比为50％的甲醇水溶液为提取液，并加入10μl的0.14mg/ml氘标记的丁二酸为内标物，混匀；置于液氮中反复冻融2次，每次冻3.0min；离心收集上清得到A液；再次加入体积比为50％的甲醇水溶液为提取液0.5ml，混合均匀，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混匀，并冷冻干燥；

③衍生化：

向步骤②获得的冻干的样品中加入40μl的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液，30℃水浴，进行肟化反应100min；再加入50μl的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，40℃水浴，进行硅烷化反应30min；

④用气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量：

将1μl步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度250℃，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为：初始50℃保持2min，以5℃/min的速度升到260℃，保持3min，使用EI电离源，源温230，检测器电压2300V，电离电压60eV，电流30μA；质谱检测范围50-800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到产黄青霉菌中试发酵或工业发酵过程产黄青霉菌胞内各个小分子代谢物的相对含量；

(2)主成分分析：

①将步骤(1)获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；

②用Markerlynx软件对步骤(2)中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较产黄青霉菌中试和工业生产过程中细胞的代谢状态的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在产黄青霉菌中试和工业生产过程中的差异就越大，便可作为区分中试与工业青霉素发酵过程的生物标志物。

通过实验证明，本实施例的方法也可以得到与实施例1相似的结果。

实施例3

1.寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法，其特征是包括下述步骤：

(2)对中试和工业青霉素生产过程中产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC No3.4023细胞内的小分子代谢物进行测定：

①产黄青霉菌细胞收集及萃灭：

在产黄青霉菌中试发酵或工业发酵过程的前期、中期和后期的各期中任选3-4个时间点，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮萃灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞；

②提取小分子代谢物：

取步骤①获得的破碎细胞100mg置于离心管中，加入2.0ml-40℃保存的体积比为50％的甲醇水溶液为提取液，并加入20μl的0.14mg/ml氘标记的丁二酸为内标物，混匀；置于液氮中反复冻融4次，每次冻0.5min；离心收集上清得到A液；再次加入体积比为50％的甲醇水溶液为提取液2.0ml，混合均匀，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混匀，并冷冻干燥；

③衍生化：

向步骤②获得的冻干的样品中加入60μl的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液，40℃水浴，进行肟化反应60min；再加入100μl的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，35℃水浴，进行硅烷化反应80min；

④用气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量：

将1μl步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度280℃，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为：初始80℃保持5min，以8℃/min的速度升到300℃，保持5min，使用EI电离源，源温260℃，检测器电压2700V，电离电压80eV，电流50μA；质谱检测范围50-800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到产黄青霉菌中试发酵或工业发酵过程产黄青霉菌胞内各个小分子代谢物的相对含量；

(2)主成分分析：

①将步骤(1)获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；

②用Markerlynx软件对步骤(2)中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较产黄青霉菌中试和工业生产过程中细胞的代谢状态的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在产黄青霉菌中试和工业生产过程中的差异就越大，便可作为区分中试与工业青霉素发酵过程的生物标志物。

通过实验证明，本实施例的方法也可以得到与实施例1相似的结果。

各实施例中产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC No 3.4023是为了说明本发明并不用于限制本发明，实验证明本发明的方法也可以寻找其它微生物发酵过程的生物标志物。