基于SPR干涉成像的生物分子相互作用检测方法及系统

摘要

本发明公开了一种生物分子相互作用的检测方法，包括以下步骤：1)获取准直光；2)使所述准直光的P偏振分量和S偏振分量之间的相位差被交替调制成为90°或-90°；3)使经相位调制的光再入射到生物传感单元从而激发表面等离子体共振，并使光由此反射；4)使所述反射光中的P偏振分量和S偏振分量发生干涉，产生干涉图像；5)使所述干涉图像成像，并采集成像干涉图像；6)交替采集附加90°和-90°相位差后产生的成像干涉图像；7)利用所采集到的相邻的2帧成像干涉图像计算反映折射率分布的分布函数。根据本发明，通过连续测量可以实时得到折射率分布随时间变化信息。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用来实现高通量、高精度、无标记、实时传感蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-效应物、抗原-抗体、配体-受体、药物-靶等生物分子相互作用的检测方法及其检测系统。

背景技术

生命过程的本质是一个各种生物分子相互作用的过程，疾病的发生和变化过程也无不与分子相互作用攸关。正因为如此，生物分子相互作用的检测已成为生命科学的研究热点之一。其中，蛋白质是基因的表达产物，执行着生命的功能，研究蛋白质分子之间及其与别的分子相互作用，对阐明生命过程和疾病发生与发展的机理，以及新药物发现都具有重要的意义。与基因相比，蛋白质不仅种类更多，而且有时空特性，检测基因的方法难以满足蛋白质检测的要求，从而急切需要高通量、高精度、无标记、实时并能保持蛋白质活性的新颖检测方法。

基于表面等离子体共振(surface plasmon resonance，简称SPR)的生物传感器是一种具有高灵敏度、实时、无标记等特点的光学检测方法，被认为是检测生物分子相互作用的较理想方法。SPR生物传感器的检测方法主要有角度扫描、光强检测和相位检测等，其中相位检测的灵敏较高。本专利发明人曾提出了基于塞曼激光器的外差干涉生物分子相互作用实时相位检测分析方法及系统(参见中国专利号ZL99107780.6，申请日期1999.5.28)，这种方法的特点是精度高，但每次只能检测1个样本，或通过逐点扫描的方法检测几个样本，无法实现高通量测量。针对该不足，本专利的发明人又提出了基于空间相位调制干涉阵列检测生物芯片的方法及系统(参见中国专利号ZL200410057323.0)，基本构成如图1所示。氦氖激光器101发出的线偏振平行光透过棱镜102、折射率匹配液103和传感芯片玻璃基底104，入射到玻璃基底104与镀在基底上的金膜105之间的界面，金膜的厚度为30-50nm。当入射角处在共振角时，入射光在金膜表面激发表面等离子体共振。光从玻璃基底104与镀在基底上的金膜105之间的界面上反射，透过一维扩束镜106，进入沃拉斯顿棱镜107；光在通过沃拉斯顿棱镜107时，其中的P偏振分量和S偏振分量被分开一个很小的角度，而后从沃拉斯顿棱镜107射出。接着，光在通过偏振棱镜108时，P偏振分量S偏振分量发生干涉，干涉条纹通过成像透镜109成像在CCD 110的靶面上，由计算机采集干涉图像并进行处理。如果金膜表面的折射率发生变化，反射光中的P偏振光和S偏振光之间的相位差随之变化，成像在CCD上的干涉条纹即对应移动。利用傅里叶条纹分析技术对所采集的干涉图像进行处理，解算相位变化，得到芯片表面的折射率变化信息，从而实现了阵列检测。这种方法是通过测量干涉条纹来获得相位变化，为了灵敏地测定相位变化，每一个传感点应至少包含3条干涉条纹，这样至少需要占据相邻的12个CCD像素。显然，CCD的行与列的像素都有限，检测通量自然受到了限制。

针对上述不足，本专利发明人进一步提出了基于时域相位调制干涉的表面等离子体阵列生物传感方法(参见中国专利ZL200510086332.7)，基本原理如图2所示。光源201发出的平行光透过棱镜202和折射率匹配层203，入射到传感芯片的玻璃基底204和镀在其上的金膜205之间的界面上，并从该界面反射，金膜的厚度为30-50nm。当入射光处在共振角上时，激发金膜表面的等离子体共振，从玻璃基底204和金膜205之间的界面上发射的光的相位随金膜表面介质折射率的改变而剧烈变化。反射光透过折射率匹配层203、棱镜202和一维扩束镜206后，射入电光晶体207。电光晶体207由高压调制电源208控制，可以在其上施加5种不同的电压。随之，当光通过电光晶体207后，反射光的P和S偏振分量之间就被附加上对应的5个不同相位差。调制后的光在通过偏振棱镜209时，P偏振光和S偏振光发生干涉，干涉图像被成像透镜210成像在CCD 211的靶面上。CCD 211图像的采集与高压电源208输出的对应电压同步，高压电源208输出5个不同的电压为1个周期，对应采集5帧图像也为1个周期。高压电源208可以循环输出电压，对应的干涉图像也可以循环采集。接着，利用Hariharan算法，对所采集的相邻的5个电压下的5帧干涉图像进行解算，得到即时反射光的相位变化。理论上，利用这种方法，只需一个CCD的像素，就能检测传感芯片上的一个传感点，能实现高通量检测。然而，当在电光晶体上施加高电压时，随之会出现逆压电效应，造成电光晶体的结构发生微尺度的形变，引起光路微小偏移，即光斑位置移动，直接产生测量误差，影响阵列检测的一致性差，难以达到高精度检测的要求。这是电光晶体固有的缺陷，无法弥补。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术的不足，提供一种新的基于干涉成像的表面等离子体共振传感系统方法及系统，能够高通量、高精度、实时、无标记检测蛋白质芯片，获取蛋白质之间相互作用的信息。

根据本发明的一方面提供了一种基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)使半导体激光器发出的光经过光纤耦合和准直后，再通过偏振棱镜，得到偏振方向可调的线偏振的准直光束；

2)使所述的线偏振准直光束通过由计算机控制的四分之一波片切换装置，所述切换装置中的2个快轴方向正交的四分之一波片被交替定位在光路中，从而使准直光的P偏振分量和S偏振分量之间的相位差被交替调制成为90°或-90°；

3)使经过相位调制的准直光再入射到生物传感单元中的传感芯片的玻璃基底与金膜之间的界面上，从而激发表面等离子体共振，同时光从该界面反射；

4)使所述反射光通过检偏器，从而使其中的P偏振分量和S偏振分量发生干涉，产生干涉图像；

5)使所述干涉图像经成像镜头成像在CCD靶面上，并采集CCD靶面上的成像干涉图像；

6)由计算机控制波片切换机构，交替采集附加90°和-90°相位差后产生的成像干涉图像；

7)采集2帧图像为1个周期，利用所采集到的附加90°和-90°相位差的相邻的2帧成像干涉图像，通过下式计算反映折射率分布的分布函数，

$A=\frac{I_{+}-I_{-}}{I_{+}+I_{-}}---\left(1\right)$

式中，I₊为附加90°相位差的干涉图像的折射率，I_-为附加-90°相位差的干涉图像的折射率，A为反映折射率分布的分布函数。

根据本发明的一个实施例，还包括以下步骤：

8)重复步骤2)至步骤7)的操作，对循环采集到一系列成像干涉图像进行计算，并以计算所得的一系列分布函数与折射率进行绘图，从而得到一系列持续反映折射率分布的信号图。

通过本发明的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法，基于表面等离子体共振阵列生物传感原理，在入射光的P偏振分量和S偏振分量间，轮流附加90°和-90°相位差，获取对应的干涉图像，通过对2幅解算干涉图像，能够得到1张反应折射率分布信息图像。利用相邻的2帧干涉图像，可计算出1张反映折射率分布的A信号图；若一共采集n帧干涉图像，则可计算出n-1张反映折射率分布的信号图A。通过连续测量，就可以实时得到折射率分布随时间变化信息。

根据本发明的另一方面还提供了一种基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测系统，包括：产生准直光并对其交替附加相位差的入射臂；接受经附加相位差的准直光并激发表面等离子体共振的生物传感单元；接受由所述生物传感单元反射的光，使其产生干涉并将干涉图像成像的反射臂；以及获取干涉图像并进行后续处理的信号采集处理单元，其中，所述入射臂中依次设置有偏振激光准直装置、波片切换装置、以及扩束装置。

根据本发明的一个实施例，其中，所述偏振激光准直装置中依次设置有：半导体激光器、单模光纤、激光准直器和偏振棱镜。

根据本发明的一个实施例，其中，所述波片切换装置包括旋转电机、摆动架、波片旋转架以及两个四分之一波片，所述四分之一波片固定在波片旋转架中，所述波片旋转架安装在所述摆动架上，所述摆动架在所述旋转电机的驱动下，将两个所述四分之一波片轮流定位在光路中心，使所述四分之一波片与光轴垂直，以实现在P偏振分量和S偏振分量间轮流附加90°和-90°的相位差。

根据本发明的一个实施例，其中，所述扩束装置的扩束倍数为2-8倍。

根据本发明的一个实施例，其中，所述生物传感单元利用表面等离子体共振的原理，包括：直角或梯形的棱镜、传感芯片和置于所述传感芯片与所述棱镜之间的折射率匹配液，其中所述棱镜、折射率匹配液和传感芯片基底的折射率相同，且所述传感芯片表面镀有30-50nm厚的金膜。

根据本发明的一个实施例，其中，在所述金膜表面通过化学方法修饰有一层亲水的自组装膜。

根据本发明的一个实施例，其中，所述反射臂包含偏振棱镜和成像镜头，该镜头将金膜表面的干涉图像成像在CCD靶面上。

根据本发明的一个实施例，其中，所述信号采集处理单元包含CCD或CMOS、以及计算机，从所述CCD上采集到的所述成像干涉图像被输入所述计算机，所述计算机利用相邻2帧所述成像干涉图像计算出折射率分布。

通过本发明提供的这种基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法以及实现该方法的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测系统，可以高通量、高精度、实时、无标记检测，获取生物分子相互作用的信息，提供给生物医学和药物研究人员，进行蛋白组学研究、疾病诊断、药物发现与开发等。

附图说明

图1为现有技术的一种SPR空间相位调制检测原理示意图；

图2为现有技术的一种SPR时域调制相位检测原理示意图；

图3为本发明的一个实施例的计算方法的理论依据；

图4为本发明的一个实施例的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测系统结构的示意图；

图5为本发明的一个实施例的波片切换装置结构示意图，其中图5a为主视图，图5b为侧视图；

图6为本发明的一个实施例的检测及信号处理过程的流程图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明所述的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法以及用于实现该方法的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测系统举例进行说明。

本发明所述的计算方法是利用SPR反射光的振幅和相位随折射率剧烈变化的特性，通过公式(1)计算得到的反映折射率分布的信号图A和实际的折射率关系可通过菲涅尔公式仿真，仿真结果如图3所示。从图中可以看出，两者在一定区间内成线性关系。因此，A的变化能反映实际的折射率变化，线性区间的位置由入射角的大小决定，通过改变入射角可实现在不同折射率区间的测量。

图4显示了本发明的一个实施例的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测系统的结构示意图。在本实施例的检测系统中，包括入射臂、生物传感单元、反射臂和信号采集处理单元等四大部分。

根据本发明的一个实施例，所述入射臂位于生物传感单元的一侧，依次包括控温半导体激光器401、单模光纤402、激光准直器403、偏振棱镜404、波片转盘405、旋转电机406和激光扩束镜407。

根据本发明的一个实施例，在所述入射臂中，控温半导体激光器401在恒流电源的驱动下，发出光强稳定的激光，光通过格林透镜耦合到单模光纤402中，并在单模光纤402中传输一段距离之输出。接着，通过准直器403后成为光斑为3-10mm的准直光束，又透过偏振棱镜404，成为线偏振光，偏振方向可调。线偏振光通过波片移动机构405后，就在P偏振方向和S偏振方向之间交替附加上90°和-90°的相位差，即进行了相位调制。经过相位调制后的光束通过激光扩束镜407，扩束成为直径为10-30mm的准直光束，再射到生物传感单元中。

根据本发明的一个实施例，所述波片移动机构如图5所示，包括旋转电机405-1、摆动架405-2、压紧环405-3、波片旋转架405-4、垫片405-5和四分之一波片405-6组成。四分之一波片405-6和垫片405-5通过压紧环405-3固定在波片旋转架405-4中，波片旋转架405-4安装在摆动架405-2上，摆动架405-2在旋转电机405-1的驱动下，将2个波片405-6轮流定位在光路中心，波片与光轴垂直，实现在P偏振分量和S偏振分量间轮流附加90°和-90°的相位差。

根据本发明的一个实施例，所述生物传感单元为表面等离子体共振生物传感器，包括直角棱镜408、传感芯片410和置于传感芯片与棱镜之间的折射率匹配液409、芯片表面镀有40nm金膜411以及位于传感芯片410下面的流体池412，传感芯片410与流体池412紧贴并密封。

在本发明所述的生物传感单元中，棱镜408与传感芯片410的玻璃基底使用相同的K9或ZF5玻璃，折射率匹配液409的折射率与棱镜408和芯片410的玻璃基质折射率一致。芯片410在玻璃基底上镀有30-50nm的金膜411，金膜411表面使用化学方法修饰一层亲水的自组装膜，用于偶联被检测的蛋白质分子。流体池412与金膜411紧贴并密封，金膜411的表面成为流体池的其中一面的壁。当被检测生物分子的溶液从其中流过时，溶液中的生物分子与芯片表面偶联的分子相互作用，引起芯片表面结构改变，随之对应的折射率变化。准直光束透过棱镜408、折射率匹配液409和芯片410，在芯片410和金膜411的界面处发生全反射，在入射角为共振角时，入射光的能量由倏逝波耦合到金膜411，形成表面等离子体共振。

根据本发明的一个实施例，位于生物传感单元的另一侧设置有反射臂，所述反射臂中依次包含偏振棱镜413和成像镜头414。由生物传感单元反射的光，通过反射臂上的偏振棱镜413时，P偏振光和S偏振光发生干涉，干涉图像由成像镜头414成像在CCD 415上，该干涉图像为传感表面的实像。

根据本发明的一个实施例，所述信号采集处理单元包含CCD 415和用于图像采集和数据分析的计算机。当然，代替CCD，也可以使用CMOS。在所述信号采集处理单元中，从CCD 415上采集到的干涉图像被输入计算机，进行实时处理。旋转电机405-1的运动和CCD 415的采集都由计算机控制，交替获取附加了90°和-90°相位差的干涉图像。计算机利用相邻的2帧干涉图像，可计算出1张反映折射率分布的A信号图，若一共采集n帧干涉图像，则可计算出n-1张反映折射率分布的A信号图。很明显，与传统的五步相移法相比，解算效率提高了4倍。相邻的2帧图像之间的采集时间间隔小，可认为在采集相邻的2帧干涉图像时入射光强不变，这样计算得到的反映折射率变化的信号分布图与初始的光强分布无关，避免了光强分布的不均匀性带来的误差，同时还能抑制光强漂移造成的测量误差。

下面结合附图具体说明根据本发明的一个实施例的检测及信号处理过程。图6为本发明的一个实施例的检测及信号处理过程的流程图。

在测量开始时，计算机首先控制旋转电机405-1，将一块波片定位在光路中心，在P和S偏振分量之间附加上90°或-90°相位差，CCD 415传感对应的干涉图像，由计算机读入。

紧接着，旋转电机405-1将另一块波片定位在光路中心，在P和S分量之间附加上-90°或90°相位差，CCD 415传感对应的干涉图像，由计算机读入。其后，计算机利用2帧干涉图像，根据公式(1)，计算反映折射率分布的A分布函数，并由此得到1张分别以分布函数A和折射率为纵坐标和横坐标的信号图。同时，还可以选择芯片上的传感点，确定该点的折射率变化，绘制对应的测量曲线。至此，完成了一个操作周期。

重复上述操作过程，又可以得到1张新的反映折射率分布的信号图。计算这2张信号图之间的差异，便得到在对应传感点上发生分子相互作用时引起的折射率变化。

循环进行，就可以实时检测生物分子的相互作用，并绘出对应传感点的折射率随时间变化的曲线，继而提供给生物医学研究人员进行相关解析。

通过本发明的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法，基于表面等离子体共振阵列生物传感原理，在入射光的P偏振分量和S偏振分量间，轮流附加90°和-90°相位差，获取对应的干涉图像，通过对2幅干涉图像进行计算，能够得到1张分别以分布函数A和折射率为纵坐标和横坐标的信号图。利用相邻的2帧干涉图像，可计算出1张反映折射率分布的信号图；若一共采集n帧干涉图像，则可计算出n-1张反映折射率分布的信号图。通过连续测量，就可以实时得到折射率分布随时间变化信息。

通过本发明提供的这种基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法以及实现该方法的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测系统，可以高通量、高精度、实时、无标记检测，获取生物分子相互作用的信息，提供给生物医学和药物研究人员，进行蛋白组学研究、疾病诊断、药物发现与开发等。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同限定。