氨基酸-(3,4-二羟基-Phe)-Ser-Leu伪肽及其合成方法和应用

摘要

本发明公开了氨基酸-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu伪肽及其合成方法和应用。其合成方法包括：(1)合成保护的(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu；(2)将甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，脯氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸或谷氨酸分别与保护基保护的(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu缩合，脱去保护基，即得。本发明伪肽化合物除具有良好的清除NO自由基活性外，还具有抑制血管舒张的性能，并且具有优秀的口服抗血栓活性，可作为清除自由基及抗血栓双重活性药物。

说明书

技术领域

本发明涉及伪肽，尤其涉及氨基酸与(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu伪三肽的氨基端缩合而得的清除自由基和抗血栓双重活性的伪肽，本发明还涉及它们的合成方法以及它们作为清除自由基的抗氧化剂、抑制血管舒张剂和抗血栓剂的应用，属于生物医药领域。

背景技术

含有邻苯二酚结构的化合物具有抗氧化的能力，可以清除自由基。而体内自由基过多的累积会引发各种疾病，例如心脑血管疾病、炎症、衰老、神经疾病等的发生。NO可以舒张血管，当有自由基清除剂存在，会抑制其舒血管作用。自由基与血小板的聚集也有关系，超氧自由基可以促进血小板的聚集。含有邻苯二酚结构的黄酮类化合物有清除自由基的作用，进而抑制血小板的聚集。所以设计一系列含有邻苯二酚结构的伪肽，发挥清除自由基并抑制血小板聚集的作用。

发明内容

本发明目的之一是提供一类水溶性良好的、生物半衰期长的、清除体内自由基并有抗血栓作用的伪肽。

本发明目的之二是提供一种合成上述伪肽的方法；

本发明目的是通过以下技术方案来实现的：

氨基酸-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu伪肽，其结构式为通式I所示：

通式I

其中，AA选自氢(H)，甘氨酸残基(Gly)，丙氨酸残基(Ala)，缬氨酸残基(Val)，亮氨酸残基(Leu)，异亮氨酸残基(Ile)，苯丙氨酸残基(Phe)，酪氨酸残基(Tyr)，色氨酸残基(Trp)，丝氨酸残基(Ser)，苏氨酸残基(Thr)，脯氨酸残基(Pro)，谷氨酰胺残基(Gln)，赖氨酸残基(Lys)，组氨酸残基(His)，天冬氨酸残基(Asp)或谷氨酸(Glu)残基；其中，所述的氨基酸或3，4-二羟基-Phe均为左旋。

本发明的另外一个目的是提供一种合成上述氨基酸-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu伪肽的方法；

一种合成上述氨基酸-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu伪肽的方法，包括：

(1)合成保护的(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu；

(2)将甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，缬氨酸(Val)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)，苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，色氨酸(Trp)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，脯氨酸(Pro)，谷氨酰胺(Gln)，赖氨酸(Lys)，组氨酸(His)，天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)分别与保护基保护的(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu缩合，脱去保护基，即得。

本发明结合了下述认识或依据完成了上述技术方案。自由基在体内的水平升高会导致诸如肿瘤疾病、自身免疫障碍、衰老、风湿样关节炎、心血管疾病以及神经退等疾病的发生，而抗氧化剂可以清除自由基，维持人体正常的生理机能。很多天然化合物都具备邻苯二酚结构，是优秀的抗氧化剂。黄酮类化合物就是一类含有邻苯二酚结构的抗氧化剂，可以有效清除自由基，并有实验证明其抗血小板聚集的活性。而3，4-二羟基-Phe也是含有邻苯二酚结构，具有清除自由基能力，加上其结构与氨基酸类似，可以作为氨基酸类似物缩合到小分子肽中，一方面发挥其清除自由基的活性，另一方面在其氨基端和羧基端的保护，使整个分子水溶性增加，不易将化合物中的3，4-二羟基-Phe部分代谢，提高了生物利用度。

本发明人基于上述认识，把十六种氨基酸与(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu伪肽的氨端缩合，使制得的分子获得四种性能，即依赖于肽的良好的水溶性、依赖于3，4-二羟基-Phe结构中的邻苯二酚结构的抗氧化性和清除自由基能力和抗血小板聚集的能力和依赖于AA和Ser-Leu二肽对3，4-二羟基-Phe结构的保护作用。这样一来，把(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu伪肽与十六种氨基酸缩合制得的分子便成为水溶性良好的、在体内稳定的发挥清除自由基和抗血栓药物。

在大鼠血栓形成模型上的评价表明，本发明自由基清除剂具有优秀的口服抗血栓活性，可作为抗血栓剂应用；ESR(电子自旋共振)法测定自由基的清除试验结果表明，本发明伪肽具有优秀的清除自由基的能力，可作为自由基清除剂；抑制大鼠胸主动脉动脉环舒张实验，表明本发明伪肽有优秀的抑制血管舒张的活性。

本发明的又一目的是提供一种含有本发明伪肽化合物的药物组合物，该药物组合物由治疗上有效剂量的本发明伪肽化合物与药学上可接受的赋型剂或者辅加剂组成；即：将有效量的本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的本发明伪肽化合物。

附图说明

图1本发明伪肽的合成路线图。i)DCC、HOBt、NMM；ii)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4N)；iii)10％钯碳和氢气(0.02Mba).其中AA＝甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，缬氨酸(Val)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)，苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，色氨酸(Trp)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，脯氨酸(Pro)，谷氨酰胺(Gln)，赖氨酸(Lys)，组氨酸(His)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)残基。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4q)的制备

1)Boc-Ser-Leu-OBzl的制备

将4.00g(10.18mmol)Leu-OBzl、1.90g(9.25mmol)Boc-Ser和1.44g(10.69mmol)HOBt置于100mL茄瓶中，加入50mLTHF，冰浴条件下滴入约20滴N甲基吗啉，待溶液澄清，滴加2.28g(11.12mmol)DCC和15mL无水THF构成的溶液。再向得到的溶液中滴入NMM约20滴调pH值8～9。反应混合物0℃搅拌10分钟后，撤去冰浴，于室温下反应4小时后抽滤，滤液减压浓缩至干。得到的残余物用70mL乙酸乙酯溶解、置于100mL分液漏斗中、依次用5％碳酸氢钠水溶液洗(20mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(20mL×3)、5％硫酸氢钾水溶液洗(20mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(20mL×3)、5％碳酸氢钠水溶液洗(20mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(20mL×3)。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液减压浓缩得到的油状物用石油醚浸泡一段时间后，磨洗得到3.62g(96.02％)标题化合物，为无色固体。ESI⁺-MS(m/e)409[M+H]⁺.

2)HCl·Ser-Leu-OBzl的制备

将1gBoc-Ser-Leu-OBzl(2.45mmol)置于50mL茄瓶中，用约6mL无水乙醚将之溶解，冰浴条件下滴加4N HCl/EtOAc约5mL，滴加完毕加盖干燥管，撤去冰浴，使反应于室温下进行。约十分钟后，观察到反应液析出白色固体，即反应液由澄清变为浑浊，1.5小时后反应结束。向反应液中加入约10mL无水乙醚，减压浓缩至干。再加入无水乙醚搅拌均匀，静置，倾去上清液，反复操作3次，沉淀减压抽干，得到0.80g(95.24％)标题化合物，为无色固体。ESI⁺-MS(m/e)309[M+H]⁺3)Boc-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(1)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由3.44g(9.99mmol)Ser-Leu-OBzl和2.70g(9.08mmol)Boc-(3，4-二羟基-Phe)-OH得4.11g(93％)标题化合物，为淡黄色固体。Mp 130-132℃；ESI⁺-MS(m/e)588[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-31.48(c＝0.115，甲醇).

4)HCl·H-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(2)的制备

按照HCl·Ser-Leu-OBzl的制备方法由2g(3.41mmol)1得1.65g(92.43％)标题化合物，为无色固体。ESI⁺-MS(m/e)488[M+H]⁺.

5)(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4q)的制备

将89mg(17.0μmol)2置于25mL茄瓶，用8mL甲醇将之溶解，加入10％的钯碳10mg，待混合均匀后，用三通将反应瓶、真空泵、氢气袋相连，先用真空泵抽真空，再通入H₂，反复操作3～4次，使反应瓶中充满H₂，室温反应约8小时，将反应液减压过滤，滤液减压浓缩，乙醚浸泡一段时间后，析出固体，倾去上清液，沉淀真空除去乙醚得到约65mg(96.31％)标题化合物，为无色固体Mp 150-151℃；ESI^-MS(m/e)396[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-5.40(c＝0.115，甲醇).

实施例2Gly-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4a)的制备

1)Boc-Gly-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3a)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由1.5g(2.865mmol)2、0.55g(3.15mmol)Boc-Gly得1.73g(93.61％)标题化合物，为无色固体Mp 107-108℃；ESI⁺-MS(m/e)646[M+H]⁺，668[M+Na]⁺；[α]_D²⁰＝-30.43(c＝0.100，甲醇).

2)Gly-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4a)的制备

将100mg(15.5μmol)3a置于25mL茄瓶，用8mL甲醇将之溶解，加入10％的钯碳10mg，待混合均匀后，用三通将反应瓶抽真空，再通入H₂，反复操作3～4次，使反应瓶中充满H₂，室温反应约8小时，将反应液减压过滤，滤液减压浓缩，乙醚浸泡一段时间后，析出固体，倾去上清液，沉淀真空除去乙醚得到无色固体。冰浴条件下，向该固体粉末中缓慢滴加4mL 4N HCl/乙酸乙酯，加盖干燥管，撤去冰浴，室温下混悬反应2小时。反应结束后，加入8mL无水乙醚，减压浓缩，得到固体再用无水乙醚浸泡，倾去上清，反复操作3次，得到的固体真空除去乙醚得到约67mg(94.97％)标题化合物，为无色固体Mp 162-164℃；ESI^-MS(m/e)454[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-12.09(c＝0.115，甲醇).

实施例3Ala-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4b)的制备

1)Boc-Ala-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3b)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由0.60g(3.15mmol)Boc-Ala制得1.70g(90.17％)标题化合物，为无色固体。Mp 107-108℃；ESI⁺-MS(m/e)658[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-31.48(c＝0.115，甲醇).

2)Ala-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4b)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(15.2μmol)3b制得68mg(95.61％)标题化合物，为无色固体。Mp 163-165℃；ESI^--MS(m/e)467[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-4.25(c＝0.105，甲醇).

实施例4Val-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4c)的制备

1)Boc-Val-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3c)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由0.68g(3.15mmol)Boc-Val制得1.78g(90.56％)标题化合物，为无色固体。Mp 84-86℃；ESI⁺-MS(m/e)687[M+H]⁺，709[M+Na]⁺，725[M+K]⁺；[α]_D²⁰＝-41.44°(c＝0.130，甲醇).

2)Val-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4c)的制备

按照4a的制备方法由100mg(14.9μmol)3c制得66mg(91.28％)标题化合物，为无色固体。Mp 155-157℃；ESI^--MS(m/e)495[M-H]^-；[α]_D²⁰＝17.20(c＝0.125，甲醇).

实施例5Leu-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4d)的制备

1)Boc-Leu-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3d)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由0.73g(3.15mmol)Boc-Leu制得1.82g(90.74％)标题化合物，为无色固体。Mp 132-134℃；ESI⁺-MS(m/e)701[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-42.77(c＝0.135，甲醇).

2)Leu-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4d)的制备

按照4a的制备方法由100mg(14.3μmol)3d制得67mg(91.96％)标题化合物，为无色固体。Mp 145-147℃；ESI^--MS(m/e)509[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-16.38°(c＝0.105，甲醇).

实施例6Ile-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4e)的制备

1)Boc-Ile-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3e)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由0.73g(3.15mmol)Boc-Ile制得1.78g(88.75％)标题化合物，为无色固体。Mp 68-70℃；ESI⁺-MS(m/e)701[M+H]⁺，723[M+Na]⁺，739[M+K]⁺；[α]_D²⁰＝-38.06(c＝0.120，甲醇).

2)Ile-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4e)的制备

按照4a的制备方法由100mg(14.3μmol)3e制得64mg(87.84％)标题化合物，为无色固体。Mp 148-149℃；ESI^--MS(m/e)509[M-H]^-；[α]_D²⁰＝7.30°(c＝0.115，甲醇).

实施例7Phe-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4f)的制备

1)Boc-Phe-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3f)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由0.84g(3.15mmol)Boc-Phe制得1.92g(91.29％)标题化合物，为无色固体。Mp 173-175℃；ESI⁺-MS(m/e)735[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-35.91(c＝0.110，甲醇)

2)Phe-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4f)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(15.2μmol)3f制得70mg(94.45％)目标化合物，为无色固体。Mp 143-145℃；ESI^--MS(m/e)543[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-9.57(c＝0.115，甲醇).

实施例8Tyr-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4g)的制备

1)Boc-Tyr-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3g)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由0.89g(3.15mmol)Boc-Tyr制得1.95g(90.74％)标题化合物，为无色固体。Mp 153-154℃；ESI⁺-MS(m/e)751[M+H]⁺，773[M+Na]⁺；[α]_D²⁰＝-35.19(c＝0.115，甲醇).

2)Tyr-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4g)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(13.3μmol)3g制得69mg(92.41％)标题化合物，为无色固体。Mp 151-153℃；ESI^--MS(m/e)559[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-23.01(c＝0.125，甲醇).

实施例9Trp-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4h)的制备

1)Boc-Trp-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3h)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由由0.96g(3.15mmol)Boc-Trp制得2.00g(90.30％)标题化合物，为无色固体。Mp 160-162℃；ESI⁺-MS(m/e)774[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-37.07(c＝0.100，甲醇).

2)Trp-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4h)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(12.9μmol)3h制得70mg(92.81％)标题化合物，为无色固体。Mp 169-171℃；ESI^--MS(m/e)582[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-10.43(c＝0.100，甲醇).

实施例10Ser-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4i)的制备

1)Boc-Ser-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3i)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由由0.65g(3.15mmol)Boc-Ser制得1.80g(93.20％)标题化合物，为无色固体。Mp 93-95℃；ESI⁺-MS(m/e)675[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-37.16(c＝0.115，甲醇).

2)Ser-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4i)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(14.8μmol)3i制得66mg(91.91％)标题化合物，为无色固体。Mp 149-151℃；ESI^--MS(m/e)483[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-16.97(c＝0.110，甲醇).

实施例11T-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4j)的制备

1)Boc-Thr-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3j)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由0.69g(3.15mmol)Boc-Thr制得1.83g(92.83％)标题化合物，为无色固体。Mp 123-125℃；ESI⁺-MS(m/e)689[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-37.90(c＝0.100，甲醇).

2)Thr-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4j)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(14.5μmol)3j制得67mg(92.56％)标题化合物，为无色固体。Mp 148-150℃；ESI^--MS(m/e)497[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-10.18(c＝0.110，甲醇).

实施例12P-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4k)的制备

1)Boc-Pro-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3k)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由0.68g(3.15mmol)Boc-Pro制得1.78g(90.82％)标题化合物，为无色固体。Mp 81-83℃；ESI⁺-MS(m/e)685[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-27.96(c＝0.095，甲醇).

2)Pro-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4k)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(14.6μmol)3k制得69mg(95.54％)标题化合物，为无色固体。Mp 135-137℃；ESI^--MS(m/e)493[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-44.09(c＝0.110，甲醇).

实施例13Gln-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4l)的制备

1)Boc-Gln-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3l)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由0.78g(3.15mmol)Boc-Gln制得1.87g(91.28％)标题化合物，为无色固体。Mp 168-169℃；ESI⁺-MS(m/e)716[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-37.68(c＝0.105，甲醇).

2)Gln-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4l)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(14.00μmol)3l制得67mg(91.25％)标题化合物，为无色固体。Mp 150-152℃；ESI^--MS(m/e)524[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-1.26(c＝0.095，甲醇).

实施例14Lys-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4m)的制备

1)Boc-Lys(Boc)-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3m)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由1.09g(3.15mmol)Boc-Lys(Boc)制得2.07g(88.64％)标题化合物，为无色固体。Mp 106-108℃；ESI⁺-MS(m/e)816[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-31.48(c＝0.115，甲醇).

2)Lys-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu的制备

按照4a的制备方法，由100mg(12.3μmol)3m制得60mg(93.14％)标题化合物，为无色固体。Mp 162-163℃；ESI^--MS(m/e)524[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-21.24(c＝0.110，甲醇).

实施例15His-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4n)的制备

1)Boc-His(Boc)-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3n)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由1.12g(3.15mmol)Boc-His(Boc)制得2.18g(92.33％)标题化合物，为无色固体。Mp 115-117℃；ESI⁺-MS(m/e)825[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-26.79(c＝0.105，甲醇).

2)His-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4n)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(12.1μmol)3n制得59mg(91.04％)标题化合物，为无色固体。Mp 151-153℃；ESI^--MS(m/e)533[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-16.23(c＝0.115，甲醇).

实施例16Asp-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4o)的制备

1)Boc-Asp(OBzl)-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3o)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由1.06g(3.15mmol)Boc-Asp(OBzl)制得2.06g(89.20％)标题化合物，为无色固体。Mp 136-138℃；ESI⁺-MS(m/e)807[M+H]⁺，829[M+Na]⁺；[α]_D²⁰＝-35.23(c＝0.095，甲醇).

2)Asp-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4o)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(12.6μmol)3o制得62mg(95.91％)标题化合物，为无色固体。Mp 147-149℃；ESI^--MS(m/e)511[M-H]^-；[α]_D²⁰＝21.68(c＝0.125，甲醇).

实施例17Glu-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4p)的制备

1)Boc-Glu(OBzl)-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3p)的制备

按照Boc-Ser-Leu-OBzl的制备方法由1.02g(3.15mmol)Boc-Glu(OBzl)制得2.11g(92.98％)标题化合物，为无色固体。Mp 67-68℃；ESI⁺-MS(m/e)793[M+H]⁺；[α]_D²⁰＝-38.06(c＝0.120，甲醇).

2)Glu-(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu(4p)的制备

按照4a的制备方法，由100mg(12.4μmol)3p制得63mg(96.54％)标题化合物，为无色固体。Mp 133-135℃；ESI^--MS(m/e)525[M-H]^-；[α]_D²⁰＝-5.64(c＝0.115，甲醇).

试验例1本发明化合物口服给药的抗血栓活性试验

1)大鼠手术与器械

SD大鼠(雄性，220～230g)按10nmol·kg^-1剂量口服本发明的化合物，30min后按1200mg-kg^-1剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，准备在远心端插管。

2)插管

插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段，中段为聚乙烯胶管，长60.0mm，内径3.5mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm。将编好号的干净青霉素小瓶中分别装入6cm长的黑色手术线，称重；然后取出丝线，按照编号放入准备好的插管的中段较粗的插管中。

打开大鼠右侧动脉夹，用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU·kg^-1)，然后将插管的动脉端插入大鼠右侧颈总动脉，将计算量的肝素缓缓注入大鼠体内。

3)给药溶液

药品：生理盐水(3ml·kg^-1，口服给予)、阿斯匹林(剂量为30mg/kg，按试验例1的方法静脉给予)的生理盐水溶液、本发明化合物(剂量为10nmol/kg，口服给予)的生理盐水溶液。

4)血栓称重

计时开始15分钟后，剪断动静脉插管，停止循环，用眼科镊小心取出丝线，在滤纸上轻轻蘸掉血滴，放入事先称重好的青霉素小瓶中，精确称重并记录。计算出血栓的湿重。每个药品重复11次给药。统计各组的血栓湿重，并做t检验。

5)结果

经口服给药，本发明的化合物都具有很好的抗栓活性。结果列入表2。

表1.本发明的化合物经口服给药的抗血栓活性

n＝10；NS＝生理盐水；ASP＝阿司匹林；a.与生理盐水相比，P＜0.01。

试验例2本发明化合物4i口服给药的量效关系

1)大鼠手术与器械

SD大鼠(雄性，220～230g)按10nmol·kg^-1，1nmol·kg^-1和0.1nmol·kg^-1剂量口服4i，30min后按1200mg-kg^-1剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，准备在远心端插管。

2)插管

插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段，中段为聚乙烯胶管，长60.0mm，内径3.5mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm。将编好号的干净青霉素小瓶中分别装入6cm长的黑色手术线，称重；然后取出丝线，按照编号放入准备好的插管的中段较粗的插管中。

打开大鼠右侧动脉夹，用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU·kg^-1)，然后将插管的动脉端插入大鼠右侧颈总动脉，将计算量的肝素缓缓注入大鼠体内。

3)给药溶液

药品：将4i按10nmol·kg^-1，1nmol·kg^-1和0.1nmol·kg^-1剂量配置生理盐水溶液，供口服给药。

4)血栓称重

计时开始15分钟后，剪断动静脉插管，停止循环，用眼科镊小心取出丝线，在滤纸上轻轻蘸掉血滴，放入事先称重好的青霉素小瓶中，精确称重并记录。计算出血栓的湿重。每个药品重复11次给药。统计各组的血栓湿重，并做t检验。

5)结果

经口服给药，在10nmol·kg^-1，1nmol·kg^-1，0.1nmol·kg^-1剂量下，4i依赖地发挥抗血栓作用。结果列入表3。

表2口服给予4i的量效关系

试验例3本发明的化合物用ESR法检测清除NO自由基

a.溶液的配制：

①MGD溶液的配制：取7.325mg MGD溶于1mL纯净水中，制得浓度为25mM的MGD溶液；

②FeSO₄溶液的配制：取FeSO₄·7H₂O 3.475mg溶于1mL纯净水中，制得浓度为12.5mM的FeSO₄溶液；

③SNAP溶液的配制：将SNAP 25mg溶于1mL纯净水中，得到浓度为110μM的母液(绿色)，取10μL母液，稀释到1mL，制得浓度为1μM的SNAP溶液；

④样品溶液的配制：取约1mg待测样品溶于1mL纯净水中，得到浓度为1mM的样品溶液。

b.ESR参数设定：

表3ESR参数设定

c.数据测定：

(1)将①和②按体积比1∶1均匀混合，制得棕色的[(MGD)₂-Fe²⁺]络合⑤；

(2)依次将⑤，④，③等比例混合，其中，空白组用相同体积的纯净水代替④；

(3)将混合液于37℃下孵育30min后，用2mm石英管吸取各个混合液，置于ESR波谱仪的谐振腔进行测定。

d.对NO自由基的清除百分率的计算：

记录谱图中三个主峰中第一个峰的PH值(峰强度)，空白组(纯净水组)记为PH^BLANK，待测化合物组为PH^Drug，根据公式“自由基的清除百分率＝(PH^BLANK-PH^Drug)/PH^BLANK×100％”来计算待测化合物对NO自由基的清除百分率(n＝3)。

e.实验结果：本发明化合物均有很好的清除NO自由基的能力

表4ESR测定化合物对NO自由基的清除百分率

其中，化合物的浓度为10^-3mol/L(n＝3)；统计学方法：t检验法

^a表示化合物对NO自由基的清除百分率与3，4-二羟基-Phe相比，P＜0.05；^b表示化合物对NO自由基的清除百分率与3，4-二羟基-Phe相比，P＜0.01；^c表示化合物对NO自由基的清除百分率与4q相比，P＜0.05；^d表示化合物对NO自由基的清除百分率与4q相比，P＜0.01。

试验例4本发明的化合物抑制大鼠胸主动脉环舒张实验

1、实验准备：

a.手术器械：眼科剪(直)，眼科镊(直)，眼科镊(弯)，16cm手术剪，表面皿

b.仪器：LMS-2B型二道生理记录仪(成都仪器厂)；

肌肉张力换能器(北京新航兴业科贸有限公司)；

THS-15型数控超级恒温槽(宁波天恒仪器厂)。

c.试剂：NE，Ach(上海试剂三厂)

NaCl，CaCl₂，NaHCO₃，NaH₂PO₄，MgC1₂·6H₂O，EDTA-2Na(北京化工厂)

KCl(北京益利精细化学品有限公司)

无水葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)

a.实验动物：健康SD雄性大鼠(首都医科大学实验动物部，约200g)

2、实验步骤：

a.Krebs-Henseleit(K-H)液的制备：

①盐储备液：NaCl 95.5g+KCl 5.5g+MgCl₂·6H₂O 3.3g+CaCl₂ 3.7g与1000mL H₂O混合，超声溶解。

②磷酸二氢钠溶液：NaH₂PO₄ 1.56g与100mL H₂O混合，超声溶解。

③乙二胺四乙酸二钠溶液：EDTA-2Na 1.12g与100mL H₂O混合，超声溶解。

④K-H液：NaHCO₃ 5.04g+无水葡萄糖6.00g+1500mL H₂O+36mL②溶液+3mL③溶液+225mL①溶液+1236mL H₂O

其中，H₂O为蒸馏水，溶液①②③均要避光保存；④一定要按顺序配制，每步保证固体完全溶解，并且要当天配制，当天使用。每种溶液都要保证完全溶解，澄清透明。

b.大鼠胸主动脉环的制备：

200g左右雄性SD大鼠断颈处死、剪开胸骨、暴露出心脏、用镊子夹起心脏、沿胸椎取下胸主动脉。立即在K-H缓冲液中将胸主动脉与其它组织分离，并保持血管内皮完整。在K-H缓冲液中把胸主动脉剪成2mm宽的数段血管环待用。

在肌肉张力换能器(量程5g)上悬挂一个1g的砝码，记录指针移动的格数。把胸主动脉环悬挂于肌肉张力换能器上、浸入持续通氧(95％O₂+5％CO₂)的浴槽中、调节胸主动脉环的张力使指针的移动格数与挂1g砝码移动的格数相同。

c.目标物4a-q抑制血管条Ach舒张活性的测定

待1g预张力的基线走平后，往浴槽中加NE(0.2mg/mL，10μL，终浓度0.1μmol/L)，血管条收缩，稳定后，加入目标化合物4a-q的水溶液(1mg/mL，15μL，终浓度1μmol/L)以及Ach(1mg/mL，15μL，终浓度5×10^-5mol/L)舒张平稳后记录结果。用K-H缓冲液将主动脉环洗3-5次。重复实验。

3、抑制舒张百分率计算：

Ach引起的舒张格数L^Ach，加入待测化合物和Ach引起的舒张格数L^Drug，NE引起的收缩格数L^NE。根据公式“抑制舒张百分率＝(L^Ach-L^Drug)/L^NE×100％”来计算待测化合物对Ach引起的血管条舒张的抑制百分率(n＝3)。

4、实验结果：实验结果表明，本发明化合物均有很好的抑制血管舒张的活性。

表5本发明化合物对Ach引起的血管舒张的抑制百分率

其中，化合物的终浓度为10^-6mol/L(n＝3)；统计学方法：t检验法

^a表示化合物对Ach引起的血管舒张的抑制百分率与3，4-二羟基-Phe相比，P＜0.01；^b表示化合物对Ach引起的血管舒张的抑制百分率与(3，4-二羟基-Phe)-Ser-Leu相比，P＜0.01。