检测转cp4-epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒

摘要

本发明是一种适用于检测加工食品中转cp4-epsps基因成份的方法及试剂盒。具体方法：样品DNA提取；PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测，其中PCR扩增的两对引物为：SEQ ID N

说明书

技术领域：

本发明涉及转基因大豆及其深加工产品，具体而言是一种适用于检测转cp4-epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒，属于食品安全转基因检测领域。

背景技术：

转基因作物自面世及大规模推广种植以来，就以其自身的优势为人类社会创造了巨大的经济效益。但转基因作物及其加工产品的生物安全性隐患也是一个不可忽视的事实。面对这把双刃剑，世界上许多国家纷纷出台了相应的法律法规来对转基因作物及其加工产品进行标识管理及安全性评价。

1983年人类成功培育了世界上第一种转基因植物——含抗生素药类抗体的烟草。但直到1994年，具有延熟保鲜功能的转基因番茄才成为首例批准进行商业化生产的转基因植物。此后，转基因作物正式走进了大众的视线，在全球得到了大面积推广。1996年全球仅有6个国家种植转基因作物，而到2008年数量激增至25个国家；与此同时，1996年全球转基因作物种植面积仅有170万公顷，而到2008年则累计达到8亿公顷(Clive James，2008)。

到目前为止，已经有超过100种以上的转基因植物被商业化种植，其中最广泛的是大豆、玉米、棉花和油菜。例如，2008年全球大豆种植面积约为九千五百万公顷，其中转基因大豆占70％份额(Clive James，2008)。

美国孟山都公司生产的抗草甘膦除草剂转基因大豆(Roundup Ready Soybean)，简称RR大豆，是世界上最早获准进行商业化种植的转基因大豆品种(1994年5月获准在美国进行商业化种植)。它的抗草甘膦除草剂特性是通过转入cp4-epsps基因并正确表达而获得的。

大豆类食品制品及相关产品一直以来都是为人民群众所热爱的。可以预见，随着我国经济的进一步发展，人民群众生活水平的提高，大豆类食品制品及相关产品的需求量必然上升。而国内的大豆产量与市场需求间一直存在着一定的差距。自1996年开始，中国成为大豆、豆粕和粮油的全面净进口国，现已是世界上最大的大豆进口国。2008年中国大豆总产量为1656万吨，而进口量已达到惊人的3743万吨(罗维燕，2009)。有证据表明，2008年，美国、阿根廷和巴西转基因大豆的种植率分别高达91.9％、90.4％和70.3％，而来自美国、巴西和阿根廷的大豆约占我国总进口大豆份额的90％(梁克红等，2009)。

转基因作物自面世以来，就其安全性各界一直存在着较大的争议。我国于2001和2002年相继颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，以此来规范农业转基因生物的监督监管机制。本发明不仅为转基因大豆及其深加工产品中转基因成份的检测提供了一种可行性高且可靠的方法，也为食品安全领域中的转基因安全性评价和标识管理提供了有力的支撑，具有很高的实际应用价值。

发明内容：

本发明目的：提供一种适用于快速检测转cp4-epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒，以克服蛋白层次检测时间长、成本高和易受产品基质影响等缺点。另外，本发明以内源基因的检测结果为参照来验证转基因大豆及其深加工产品中外源转基因成份检测结果的正确性，在一定程度上能有效避免PCR过程中的污染及假阳性问题，从而能够更有效的对检测结果做出科学和准确的判断。

本发明目的的实现：

一种检测转cp4-epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法，包括：提取样品中总DNA、PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳检测，其特征在于：

大豆内源lectin基因上游引物为SEQ ID N_O：1，下游引物为SEQ ID N_O：2；

cp4-epsps基因上游引物为SEQ ID N_O：3，下游引物为SEQ ID N_O：4。

在本发明中：在PCR扩增反应体系中，PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、引物和DNA之间的体积比为50∶1∶2∶1；在扩增反应中，变性：94℃3～10min；扩增：94℃30s，40～65℃30s，72℃20～60s；循环：30～45；后延伸：72℃10min。

在本发明中：PCR反应缓冲液由10×PCR buffer、MgCl₂、dNTP和dd H₂O组成，它们的体积比为5∶3∶1∶41。

在本发明中：所述的琼脂糖凝胶电泳检测是指制备琼脂糖凝胶，60～100V恒压电泳，30～60min。EB染色后于凝胶成像仪上观察和拍照。

在本发明中：提取样品中总DNA是指通过CTAB法、SDS法、酶裂解法、高盐低pH法或试剂盒法等方法提取样品中总DNA。

一种实现上述PCR扩增反应的试剂盒，其特征在于：包括A液、B液、C液和D液。其中，A液为PCR反应缓冲液，B液为Taq DNA聚合酶，C液为大豆内源基因lectin的上游引物和下游引物，D液为cp4-epsps基因片段的的上游引物和下游引物。所述的PCR反应缓冲液内含10×PCR Buffer、dNTPs、MgCl₂和ddH₂O。

在所述的试剂盒中：大豆内源lectin基因上游引物为SEQ ID N_O：1，下游引物为SEQ ID N_O：2；cp4-epsps基因上游引物为SEQ ID N_O：3，下游引物为SEQ ID N_O：4。

在所述的试剂盒中：PCR反应缓冲液中10×PCR buffer、MgCl₂、dNTPs、dd H₂O的体积比为5∶3∶1∶41。

在所述的试剂盒中：A液为50ml，B液为1ml，C液为2ml，D液为2ml。

在本发明中：针对lectin和cp4-epsps基因所设计的引物也可以应用于实时荧光定量PCR扩增反应。

本发明的优势在于：

本发明提供了一种具有高可行性的能够快速检测转基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒。lectin基因是大豆的内源基因，针对其进行PCR扩增可表征出实验样品中是否含有大豆成份，并可对所提样品DNA质量作出初步的判断。由此，本发明不仅可以根据lectin基因PCR扩增结果的有无来判断样品中是否含大豆成份，而且还可以判断出不同样品中DNA提取的质量情况。通过联立lectin及cp4-epsps基因PCR扩增结果，本发明不仅对食品中转基因成份有着高检出率，且通过PCR检测结果的相互印证能有效避免PCR过程中的污染及假阳性问题，从而能够更有效的对PCR检测结果做出科学和准确的判断。本发明不仅为转基因食品安全检测提供了一种高可行性的方法，也为食品安全领域中的转基因安全性评价和标识管理提供了有力的支撑，具有很高的实际应用价值。

附图说明

图1：本发明所述PCR体系的有效性及所用引物的特异性检测结果图。

图中：A：lectin基因引物PCR结果；B：cp4-epsps基因引物PCR结果。

图2：用转基因大豆制备的加工食品中转基因成份检测结果图。

图中：A：lectin基因引物PCR结果；B：cp4-epsps基因引物PCR结果。

图3：自由市场所购食品样品中转基因成份检测结果图。

图中：A：lectin基因引物PCR结果；B：cp4-epsps基因引物PCR结果。

图4：食用大豆油与腐乳中转基因成份检测结果图。

图中：A：lectin基因引物PCR结果；B：cp4-epsps基因引物PCR结果。

图5：行标引物对上述实验所购食品样品中转基因成份检测结果图。

图中：A：对应图1所用样品的行标cp4-epsps基因引物PCR结果；

B：对应图2所用样品的行标cp4-epsps基因引物PCR结果；

C：对应图3所用样品的行标cp4-epsps基因引物PCR结果；

D：对应图4所用样品的行标cp4-epsps基因引物PCR结果。

具体实施方式

实施例1

一、应用试剂盒法(TaKaRa D9093)提取Roundup Ready大豆粉和野生型大豆粉中总DNA：

(1)称取0.5g左右磨碎的样品放入Tube中，加入1.75ml Pretreatment Buffer和200μl5M Guanidinium Hydrochloride Solution，振荡混匀后，再加入50μl Proteinase K，颠倒混匀后，58℃保温1h，间隔10min颠倒混匀；

(2)室温下8,000rpm离心5min，取500μl上清放入1.5ml Microtube中；

(3)室温下14,000rpm离心10min，取300μl上清放入2ml Microtube中；

(4)加入100μl Solution I，振荡混匀后，再加入200μl 0.2％SDS以及1ml Silica GelSolution，轻轻颠倒混匀5～6min；

(5)室温下12,000rpm离心30s，去上清；

(6)加入300μl 1×Wash Solution，充分混匀后，室温下12,000rpm离心30s，去上清，重复两次(最后一次离心3min)；

(7)向沉淀中加入70℃预热的100μl TE Buffer，混匀后，室温静置5min；

(8)室温下14,000rpm离心3min，取上清，即为样品DNA溶液。

二、PCR扩增反应：

PCR反应体系：PCR反应缓冲液、上游引物、下游引物、DNA、Taq DNA聚合酶和dd H₂O。

扩增反应按下表进行：

三、琼脂糖凝胶电泳检测：制备1.5％琼脂糖凝胶，60～100V恒压电泳，30～60min。EB染色，于凝胶成像仪上观察和拍照。

四、按下列试剂制备转基因成份检测试剂盒：

(1)：A液

PCR反应缓冲液：内含10×PCR Buffer、dNTPs(5～15mM each)、MgCl₂(15～35mM)和ddH₂O

(2)：B液

Taq DNA聚合酶(3～10U/μl)

(3)：C液(15～40μM)

lectin上游：TCCTCGGGAAAGTTACAA

lectin下游：GGCATAGAAGGTGAAGT

(4)：D液(15～40μM)

cp4-epsps上游：CGGGGTCTACGATTTCGA

cp4-epsps下游：GCCCTGCAGCATCTTTTC

PCR扩增反应结果表明：样品中均能检测到lectin基因，说明样品中含有大豆成份且所提DNA质量较高。转基因大豆粉中能检测到cp4-epsps基因，而野生型大豆粉中则检测不到转基因成份。这一结果表明本发明建立的PCR体系是高效和可行的，且实验过程中没有发生污染情况。

结果见附图1。图中M：DL 2000DNA Marker；1：转基因大豆粉；2：野生型大豆粉。

实施例2

一、应用改良SDS法提取Roundup Ready大豆粉、豆浆、豆腐、豆干、千张和野生型大豆粉中总DNA(此处豆浆、豆腐、豆干和千张均为转基因大豆所制备)：

(1)称取100mg样品在液氮中充分研磨成粉状，置于2ml离心管中，加入600μlSDS提取液(100mM Tris-HCl、500mM NaCl、50mM EDTA、10mM β-巯基乙醇和1.5％SDS，pH 8.0)，混匀，65℃下保温20min；

(2)加入200μl 5M KAC，冰浴20min；

(3)加入300μl氯仿，混匀；

(4)12,000g离心10min，转移上清至新离心管中，再加入等体积氯仿抽提一次；

(5)12,000g离心10min，转移上清于等体积的异丙醇(-20℃预冷)中，并在-20℃下静置30min，11,500g离心20min以沉淀DNA；

(6)弃上清，加入TE缓冲液溶解沉淀后，再加入RNaseA溶液处理；

(7)7,500g离心5min，取上清至新离心管中，加入1ml无水乙醇(-20℃预冷)沉淀DNA；

(8)11,500g离心5min，重复洗涤过程一次；

(9)置于吸水纸巾上风干。干燥后加入30μl TE缓冲液，-20℃保存备用。

二、PCR扩增反应：

PCR反应体系：PCR反应缓冲液、上游引物、下游引物、DNA、Taq DNA聚合酶和dd H₂O。

扩增反应按下表进行：

三、琼脂糖凝胶电泳检测：制备1.5％琼脂糖凝胶，60～100V恒压电泳，30～60min。EB染色后，于凝胶成像仪上观察和拍照。

四、按下列试剂制备转基因成份检测试剂盒：

(1)：A液

PCR反应缓冲液：内含10×PCRBuffer、dNTPs(5～15mM each)、MgCl₂(15～35mM)和ddH₂O

(2)：B液

Taq DNA聚合酶(3～10U/μl)

(3)：C液(15～40μM)

lectin上游：TCCTCGGGAAAGTTACAA

lectin下游：GGCATAGAAGGTGAAGT

(4)：D液(15～40μM)

cp4-epsps上游：CGGGGTCTACGATTTCGA

cp4-epsps下游：GCCCTGCAGCATCTTTTC

PCR扩增反应结果表明：样品中均能检测到lectin基因，说明样品中含有大豆成份且所提DNA可用。除野生型大豆粉外，所有由转基因大豆加工而成的样品均检测到了转基因成分。这表明，本发明建立的PCR体系是高效和可行的，且能够对深加工食品中的转基因成份进行有效的检测检出。

结果见附图2。图中M：DL2000DNAMarker；1：转基因大豆粉；2：豆浆；3：豆腐；4：豆干；5：千张；6：野生型大豆粉。

实施例3

一、应用酶裂解法提取Roundup Ready大豆粉、豆浆、豆腐、豆干、千张、豆泡、腐乳和野生型大豆粉中总DNA(此处加工食品均购于自由市场)：

(1)称取100mg样品在液氮中研磨成粉状，置于2ml离心管中，加入1ml蛋白酶K抽提液(用灭过菌的50mMpH8.0Tris-HCl和1.5mM乙酸钙溶液配制20mg/ml蛋白酶K溶液，-20℃保存待用)，充分混匀后置60℃恒温水浴锅中温育3h；

(2)12,000g室温下离心10min，取上清至新离心管中，用等体积酚∶氯仿∶异戊醇溶液(25∶24∶1)抽提，充分混匀；

(3)11,500g离心10min，取上清后，加入等体积氯仿，混合30s；

(4)12,000g离心10min，转移上清至新离心管中，再加入等体积氯仿抽提一次；

(5)12,000g离心10min，转移上清于0.6倍体积的异丙醇(-20℃预冷)中，并在-20℃下静置30min，11,500g离心20min以沉淀DNA；

(6)弃上清，加入1ml无水乙醇(-20℃预冷)清洗沉淀物，11,500g离心5min，重复洗涤过程一次；

(7)置于吸水纸巾上风干。干燥后加入30μl TE缓冲液，-20℃保存备用。

二、PCR扩增反应：

PCR反应体系：PCR反应缓冲液、上游引物、下游引物、DNA、Taq DNA聚合酶和dd H₂O。

扩增反应按下表进行：

三、琼脂糖凝胶电泳检测：制备1.2％琼脂糖凝胶，80V恒压电泳，45min。EB染色，于凝胶成像仪上观察和拍照。

四、按下列试剂制备转基因成份检测试剂盒：

(1)：A液

PCR反应缓冲液：内含10×PCR Buffer、dNTPs(5～15mM each)、MgCl₂(15～35mM)和ddH₂O

(2)：B液

Taq DNA聚合酶(3～10U/μl)

(3)：C液(15～40μM)

lectin上游：TCCTCGGGAAAGTTACAA

lectin下游：GGCATAGAAGGTGAAGT

(4)：D液(15～40μM)

cp4-epsps上游：CGGGGTCTACGATTTCGA

cp4-epsps下游：GCCCTGCAGCATCTTTTC

PCR扩增反应结果和测序验证表明：与实施例2的结果相比较，自由市场上所购的豆浆及千张为非转cp4-epsps基因大豆食品制品，而其中的豆腐、豆干、豆泡和腐乳中均检测到了转基因成份。表明本发明不仅能够对大豆加工产品等食品中的转基因成份进行有效的检测检出，且对于未标识的食品样品中的转基因成份也能有效的检测检出。

结果见附图3。图中M：DL 2000DNAMarker；1：转基因大豆粉；2：豆浆；3：豆腐；4：豆干；5：千张；6：豆泡；7：腐乳；8：野生型大豆粉。

实施例4

一、应用改良CTAB法提取Roundup Ready大豆粉、食用大豆油、腐乳和野生型大豆粉中总DNA(此处加工食品均购于超市)：

(1)称取100mg样品在液氮中研磨成粉状，置于2ml离心管中，加入1ml 60℃预热的CTAB抽提缓冲液，充分混匀后置60℃恒温水浴锅中温育30min；

(2)12,000g室温下离心10min，取上清至新离心管中，用等体积酚∶氯仿∶异戊醇溶液(25∶24∶1)抽提，充分混匀；

(3)11,500g离心10min，取上清后，加入等体积氯仿，混合30s；

(4)12,000g离心10min，转移上清至新离心管中，再加入等体积氯仿抽提一次；

(5)12,000g离心10min，转移上清于0.6倍体积的异丙醇(-20℃预冷)中，并在-20℃下静置30min，11,500g离心20min以沉淀DNA；

(6)弃上清，加入1ml无水乙醇(-20℃预冷)清洗沉淀物，11,500g离心5min，重复洗涤过程一次；

(7)置于吸水纸巾上风干。干燥后加入30μl TE缓冲液，-20℃保存备用。

(食用大豆油用pH 7.0TE等体积间隔混匀30min后，12,000g离心，10min，取清液；并用上述改良的CTAB法提取其中的DNA)

二、PCR扩增反应：

PCR反应体系：PCR反应缓冲液、上游引物、下游引物、DNA、Taq DNA聚合酶和dd H₂O。

扩增反应按下表进行：

三、琼脂糖凝胶电泳检测：制备1.5％琼脂糖凝胶，60～100V恒压电泳，30～60min。

EB染色，于凝胶成像仪上观察和拍照。

四、按下列试剂制备转基因成份检测试剂盒：

(1)：A液

PCR反应缓冲液：内含10×PCR Buffer、dNTPs(5～15mM each)、MgCl₂(15～35mM)和ddH₂O。

(2)：B液

Taq DNA聚合酶(3～10U/μl)

(3)：C液(15～40μM)

lectin上游：TCCTCGGGAAAGTTACAA

lectin下游：GGCATAGAAGGTGAAGT

(4)：D液(15～40μM)

cp4-epsps上游：CGGGGTCTACGATTTCGA

cp4-epsps下游：GCCCTGCAGCATCTTTTC

PCR扩增反应结果表明：样品中均能检测到lectin基因，说明样品中含有大豆成份且所提DNA可用。除了野生型大豆粉外，食用大豆油和腐乳均检测到了转基因成分，说明本发明能够对大豆深加工产品等食品中的转基因成份进行有效的检测检出。

结果见附图4。图中M：DL 2000DNAMarker；1：转基因大豆粉；2：豆油；3：腐乳；4：野生型大豆粉。

实施例5

前述实施例所涉及样品的行标引物PCR扩增结果图(行业标准NY/T 675-2003中cp4-epsps基因ORF区段引物)。

一、应用改良CTAB法分别提取实施例1、2、3、4中样品总DNA：

(1)称取100mg样品在液氮中研磨成粉状，置于2ml离心管中，加入1ml 60℃预热的CTAB抽提缓冲液，充分混匀后置60℃恒温水浴锅中温育30min；

(2)12,000g室温下离心10min，取上清至新离心管中，用等体积酚∶氯仿∶异戊醇溶液(25∶24∶1)抽提，充分混匀；

(3)11,500g离心10min，取上清后，加入等体积氯仿，混合30s；

(4)12,000g离心10min，转移上清至新离心管中，再加入等体积氯仿抽提一次；

(5)12,000g离心10min，转移上清于0.6倍体积的异丙醇(-20℃预冷)中，并在-20℃下静置30min，11,500g离心20min以沉淀DNA；

(6)弃上清，加入1ml无水乙醇(-20℃预冷)清洗沉淀物，11,500g离心5min，重复洗涤过程一次；

(7)置于吸水纸巾上风干。干燥后加入30μl TE缓冲液，-20℃保存备用。

(食用大豆油用pH 7.0TE等体积间隔混匀30min后，12,000g离心，10min，取清液；并用上述改良的CTAB法提取其中的DNA)

二、PCR扩增反应：

PCR反应体系：PCR反应缓冲液、上游引物、下游引物、DNA、Taq DNA聚合酶和dd H₂O。

扩增反应按下表进行：

三、琼脂糖凝胶电泳检测：制备1.5％琼脂糖凝胶，60～100V恒压电泳，30～60min。EB染色，于凝胶成像仪上观察和拍照。

结果见附图5。图中A：实施例1样品的行标引物PCR扩增结果；B：实施例2样品的行标引物PCR扩增结果；C：实施例3样品的行标引物PCR扩增结果；D：实施例4样品的行标引物PCR扩增结果。其中，A中各泳道与图1对应，B中各泳道与图2对应，C中各泳道与图3对应，D中各泳道与图4对应。

实施例1-5的结果表明：同等条件下，相较于行业标准NY/T 675-2003中涉及的cp4-epsps基因ORF区段引物，本发明不仅能更广泛的检测到加工食品中的转基因成份，且同时能对食用大豆油和腐乳等大豆深加工食品中的转基因成份进行有效的检测检出。

实施例6

一、应用改良CTAB法提取Roundup Ready大豆粉、豆浆、豆腐、豆干、千张、食用大豆油、腐乳和野生型大豆粉中总DNA[此处豆浆、豆腐、豆干和千张均为转基因大豆所制备，豆油与腐乳(与实施例4中品牌不同)均购于超市]：

(1)称取100mg样品在液氮中研磨成粉状，置于2ml离心管中，加入1ml 60℃预热的CTAB抽提缓冲液，充分混匀后置60℃恒温水浴锅中温育30min；

(2)12,000g室温下离心10min，取上清至新离心管中，用等体积酚∶氯仿∶异戊醇溶液(25∶24∶1)抽提，充分混匀；

(3)11,500g离心10min，取上清后，加入等体积氯仿，混合30s；

(4)12,000g离心10min，转移上清至新离心管中，再加入等体积氯仿抽提一次；

(5)12,000g离心10min，转移上清于0.6倍体积的异丙醇(-20℃预冷)中，并在-20℃下静置30min，11,500g离心20min以沉淀DNA；

(6)弃上清，加入1ml无水乙醇(-20℃预冷)清洗沉淀物，11,500g离心5min，重复洗涤过程一次；

(7)置于吸水纸巾上风干。干燥后加入30μl TE缓冲液，-20℃保存备用。

(食用大豆油用pH 7.0TE等体积混匀30min后，12,000g离心，10min，取清液。改良CTAB法提取其中的DNA)

二、实时荧光定量PCR扩增反应：

Real-time PCR仪：ABI 7500

Real-time PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq(5～10μl)、ddH₂O(5～10μl)、上下游引物各(0.1～0.5μl)、模板DNA(0.5～2μl)

Real-time PCR扩增程序：50℃2～4min，95℃8～12min，95℃10～30s，50～60℃1min；35～45cycle。

在进行实时荧光定量PCR扩增反应时，所述的引物为：

lectin上游：TCCTCGGGAAAGTTACAA

lectin下游：GGCATAGAAGGTGAAGT

cp4-epsps上游：CGGGGTCTACGATTTCGA

cp4-epsps下游：GCCCTGCAGCATCTTTTC

lectin基因Real-time PCR扩增结果

cp4-epsps基因Real-time PCR扩增结果

Real-time PCR扩增反应结果表明：本发明针对lectin和cp4-epsps基因设计的引物能够有效的应用于Real-time PCR反应。

以上实施例仅仅是本发明所述的两对引物(SEQ ID N_O：1、SEQ ID N_O：2、SEQ IDN_O：3和SEQ ID N_O：4)在转基因食品安全检测领域中应用的有限实施例，而不是对本发明进行的具体限定。公众只要运用本领域的基本知识，在检测转cp4-epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份时涉及到本发明所述的两对引物，均在本发明的保护范围内。例如：在检测中利用两对引物进行PCR扩增前，涉及的样品中总DNA绝不限于上述实施例涵盖的有限提取方法，还包括通过高盐低pH法等其他公知方法；涉及的检测对象也绝不限于上述实施例涵盖的有限制品，还应该延伸到各种大豆制品。