转Bt融合抗虫蛋白基因和Cp4-EPSPS抗草甘膦基因玉米转化事件中高表达株系的筛选及分子检测

摘要

玉米(Zea mays L.)是世界性的粮食作物和重要的饲料作物。玉米螟(Ostriniafurnacalis H.)等农业害虫的为害直接影响玉米的产量和品质。提高玉米产量和品质可以有效解决世界粮食问题，促进畜牧业的发展，因而研究如何经济有效的控制玉米田间病虫害具有重要意义。利用转基因技术培育的抗虫转基因玉米新品种，能够有效减少化学农药的使用，具有保护全面，有效周期长，环境友好等优点而成为控制玉米病虫害的理想手段。近20年来，人们通过植物转基因技术成功培育了一批具有抗虫、抗病、耐除草剂等优良性状的转基因玉米新品种，他们中的一部分已经实现了商业化生产，并取得了令人瞩目的成就。
　　 然而，获得一个具有商业化推广价值的转化株系，需要对大量的转化事件进行筛选和鉴定，选拔出各方面性状均较优良的转化株系，并对其遗传背景、目的基因表达水平和遗传稳定性进行透彻的研究分析，才能够用于新品种繁育。快速筛选出目的基因有效表达并稳定遗传的株系，是转基因玉米从实验室走向产业化应用的第一步。
　　 本研究，对采用农杆菌介导法获得的178个转Cry1AbNJB杀虫蛋白基因和EPSPS抗草甘膦基因的抗虫耐除草剂玉米G3-NJB株系，进行抗虫生物测定、PCR分析、Western blot、Southern blot等一系列筛选检测，得到11个抗虫和抗除草剂基因都高表达，且目的基因单拷贝插入的转基因玉米株系;并选取了其中6个进行T1代的抗虫抗除草剂活性实验，初步探究其后代遗传稳定性。具体操作及结果如下:
　　 (1)采用叶片饲喂法，以鳞翅目模式昆虫棉铃虫(Helicoverpa armigeraH.)为供试虫对G3-NJB进行抗虫活性生物测定，淘汰抗虫能力较差的64个转化株系;
　　 (2)将所有能收到种子的具有抗虫活性的转基因玉米进行PCR检测，结果证明44个能收到种子的转化株系都已转入目的基因;
　　 (3)将44个具有抗虫活性的转基因玉米进行抗虫基因和抗除草剂基因的蛋白表达western检测，筛选出抗虫蛋白和抗除草剂蛋白同时高表达的转化株系19个。
　　 (4)运用southern杂交技术，鉴定这19个转化子基因组中目的基因的拷贝数，筛选出了T0代高表达单拷贝的双抗转基因株系11个。并在T1代通过室内和田间抗虫和耐除草剂实验对其中6个株系的后代的抗虫和抗除草剂活性进行测定。筛选获得具有良好抗虫活性和除草剂抗性的双抗转基因玉米。

目录

声明

致谢

摘要

1．文献综述

1．1 转基因玉米研究进展

1．1．1 转基因抗虫玉米研究进展

1．1．2 抗除草剂转基因玉米研究进展

1．2 转基因玉米外源基因及表达蛋白检测技术研究进展

1．2．1 外源基因检测技术

1．2．2 外源基因表达蛋白检测技术

1．3 转基因玉米产业化现状

1．4 研究思路、目的与意义

2．材料与方法

2．1 材料

2．1．1 转化材料

2．1．2 供试昆虫

2．1．3 菌株与载体

2．1．4 试剂、溶液及主要培养基

2．1．5 仪器、设备及实验耗材

2．2 方法

2．2．1 表达载体的构建

2．2．2 农杆菌介导法玉米转化

2．2．3 高抗性玉米转化植株的筛选与分子检测

3．结果与分析

3．1 T0代G3-NJB玉米转化植株的获得

3．2 T0代G3-NJB玉米转化子高抗虫活性株系的筛选结果

3．3 T0代G3-NJB高抗虫活性玉米转化株系的分子检测

3．3．1 T0代G3-NJB玉米转化株系的定性PCR检测结果

3．3．2 T0代G3-NJB玉米转化株系的Western检测结果

3．3．3 T0代双基因高表达G3-NJB株系的Southern杂交分析

3．4 T1代转基因玉米G3-NJB抗虫抗除草剂活性测定

3．4．1 T1代转基因玉米G3-NJB的抗虫活性生物测定结果

3．4．2 T1代转基因玉米G3-NJB除草剂耐受性试验结果

4．总结与讨论

参考文献

作者简历