一种多引物直接退火构建RNA干扰载体的方法

摘要

本发明提出了一种多引物直接退火构建RNA干扰载体的方法，主要包括：载体的改造、寡核苷酸序列的退火以及退火产物克隆到RNAi载体三部分。该方法不需要合成长度大于50nt的寡核苷酸引物序列，不需要进行PCR、酶切回收小分子DNA以及连接酶处理等操作，而是依靠线性载体与退火产物各自突出的粘性末端在大肠杆菌体内的连接产生重组质粒。该方法简便快捷，经济直观，筛选方便，准确率高。

说明书

技术领域

本发明涉及的是生物基因克隆表达技术，特别是一种快速、高效、低成本、高通量构建RNA干扰(RNA interference，RNAi)载体的方法。尤其适合于大规模地构建动植物RNAi表达载体，用于动植物基因的功能研究。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种普遍存在于生物体内、序列特异性强、转录后水平的基因沉默过程。目前，采用RNAi技术快速实现生物体内基因沉默已经成为动植物基因功能研究中一种有力的实验工具。

由于动植物体内各自的特点及其RNAi作用机制的差异，当今用于动植物基因功能研究的RNAi的作用分子也有所不同。目前，应用较为普遍的发挥干扰作用的小RNA分子在动物体内主要有siRNA(small interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)以及amiRNA(artificial microRNA)等；而植物体内主要有hpRNA(hairpin RNA)和amiRNA。最早采用RNAi技术研究生物体内基因功能的方法是将体外制备好单链siRNA分子直接注入线虫体内，虽然这种方法后来在动植物的基因功能研究中被沿用，但是因其操作的复杂性以及干扰效果的短时性，现在的RNAi技术采用的方法多为构建一个特定的RNAi表达载体，该载体导入动植物细胞后能由RNA聚合酶II型或III型启动子转录出相应的shRNA、amiRNA以及hpRNA(hairpin RNA)等，进而干扰与其相关的基因的表达。

目前，RNA干扰表达载体的构建方法主要有以下三种：(I)寡核苷酸退火法：由化学合成法产生的两条特定的、部分碱基互补的寡核苷酸单链，在离体条件下退火形成双链DNA，退火产生两端突出的粘性末端，能与处理好的载体的突出末端互补，经连接转化后，得到含有RNA干扰表达单元的重组质粒。(II)PCR扩增法：①构建动物细胞RNA干扰载体时，先设计一对扩增控制RNA干扰单元表达的启动子的PCR引物，正向引物与启动子特异性匹配，反向引物5’末端额外加上针对目的基因的干扰靶序列，将PCR产物克隆到相应的载体上，得到RNA干扰表达载体；②构建植物人工微RNA(amiRNA)表达载体时，先按照需要设计三对引物，进行三轮独立的PCR，获得的三种PCR产物分别含有：待干扰目的基因的靶序列、amiRNA的环序列以及待干扰目的基因靶序列的互补序列，然后采用重叠延伸PCR的方法将获得的三种PCR产物拼接成完整的人工miRNA茎环结构序列，再将其克隆到相应的载体上。(III)寡核苷酸退火延伸法：化学合成两条部分互补的寡核苷酸单链，在非互补的单链区域分别含有干扰目的基因的靶序列及其互补序列，在特定条件下使两条单链退火，然后延伸形成完整的小双链DNA分子，经酶切处理后克隆到相应载体上。

以上三种方法虽然都能构建各种RNA干扰表达载体，但也存在不足之处，主要表现在以下几个方面：

一、步骤繁琐，克隆效率低。以上三种方法都是首先对克隆的目的片段和载体进行特殊处理，然后使目的片段与载体发生酶连反应。方法(I)需要化学合成的两条寡核苷酸单链体外退火，得到的产物需要纯化处理，然后与处理好的载体进行连接。由于待克隆的目的片段通常小于100bp，因此纯化难度高，而且得率低，从而较难获得正确的重组质粒，假阳性率高。方法(II)需要在PCR引物中加上针对靶基因的干扰序列，通常需要长引物(通常大于70nt)或者多轮的PCR扩增反应，扩增后的PCR产物也需要酶切纯化，然后与处理好的载体进行连接反应；方法(III)中两条寡核苷酸单链退火延伸得到的产物必须经过复杂的回收、酶切纯化等步骤后，才能克隆到相应载体。方法(II)(III)不仅花费时间，工序繁琐，而且载体与非目的片段连接或自连的几率很高，使后续的筛选鉴定过程复杂化。

二、不适合高通量的操作。

以上三种方法中的待克隆片段都需要预先纯化处理，都依赖于载体与外源片段的连接反应，这对于构建单个或少数RNA干扰载体虽然可行，但是对于大规模地构建RNA干扰载体来讲却非常困难，而且效率低下。方法(I)和(II)中使用的寡核苷酸单链通常为60-100nt，合成这种长度的寡核苷酸单链不仅合成费用大大提高，而且碱基合成错误率大大增加，进而大大增加了重组质粒筛选的工作量，费时费力。方法(II)和(III)中的外源片段都需要经过复杂的双酶切、回收等步骤，因外源片段一般都较小(200bp以内)，回收纯化效率较低，这两种方法不仅实验成本昂贵，而且后续筛选困难，工作量大。(参见刊物“RNA.20028：1454-1460”；“Plant Cell.2006May；18(5)：1121-33.”；″PhysiolGenomics.2007Nov 14；31(3)：554-62.″参见网页www.invitrogen.com或Invitrogen公司产品目录)

发明内容

本发明的目的是提供一种采用多引物直接退火的方法来构建RNA干扰(RNA interference，RNAi)载体。该方法主要包括：载体的改造、寡核苷酸序列的退火以及退火产物克隆到RNAi载体三部分。该方法不需要合成长度大于50nt的寡核苷酸引物序列，不需要进行PCR、酶切回收小分子DNA以及连接酶处理等操作，而是依靠线性载体与退火产物各自突出的粘性末端在大肠杆菌体内的连接产生重组质粒。该方法简便快捷，经济直观，筛选方便，准确率高。

本发明中构建RNA干扰载体的具体方法为：

1)载体的改造

首先选定一目标载体，按照传统的分子克隆操作方法，在目标载体中插入“启动子-限制性核酸内切酶酶切位点1-填充片段-限制性核酸内切酶酶切位点2-终止子”序列。该插入序列中的启动子和终止子将负责含有siRNA、shRNA或者amiRNA的RNA分子的转录；序列中的限制性核酸内切酶酶切位点1和2相同，或者不同。当该限制性核酸内切酶为普通的II型酶时：构建好的载体经限制性核酸内切酶1和2切割后产生的末端分别含有13bp左右、由三种碱基组成的一段序列，以便于后续的具有3’→5’外切酶活性的酶(如：T4DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow DNA聚合酶等)处理；当该限制性核酸内切酶为II型酶中的切口酶时，其填充片段两端还应添加两酶切位点3和4，3和4可以相同，或者不同，构建好的载体经限制性核酸内切酶1、2、3和4切割后产生的末端分别含有13nt左右的突出碱基，后续不需具有3’→5’外切酶活性的酶处理。

2)寡核苷酸序列退火

根据siRNA、shRNA或者amiRNA前体分子的DNA序列组成，设计一组能相互退火的引物，将这些引物等浓度混合，并让其相互退火(退火产物5’末端有13Nt左右、能与线性载体末端互补的突出碱基)。

3)线性化载体与退火产物的直接转化

将步骤一)中改造好的载体经限制性核酸内切酶1和2酶切成线性DNA分子后，用具有3’→5’外切酶活性的酶(如：T4DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow DNA聚合酶等)处理该线性DNA载体分子，得到具有5’突出末端的线性DNA(如果限制性核酸内切酶为切口酶则不需要3’→5’外切酶活性处理)，然后将该线性DNA载体分子与步骤二中得到的退火产物混合后直接转入大肠杆菌感受态细胞，通过填充片段能显示的表型的消失，筛选出含有RNA干扰载体的重组子，最后通过测序鉴定RNA干扰载体序列的正确性。

本发明与现有技术相比具有明显的优势：

一、本发明中，在改造后的RNAi载体中插入了易于筛选的填充片段(如：抗性基因、gfp等)，经酶切后填充片段丢失，这样在重组子筛选过程中使得因酶切不完全造成的背景很容易被识别。

二、本发明采用多引物直接退火的方法获得含有siRNA、shRNA或者amiRNA的前体RNA分子对应的DNA序列，省去了传统的PCR、酶切和回收纯化等反应步骤，操作过程大大简化，避免了PCR过程中可能出现的碱基合成错误；而且所用引物长度大都控制在40-50nt，引物序列合成的出错几率大幅度降低，从而极大程度地提高了重组子的准确率，节约了大量的时间和成本。

三、本发明中的线性载体DNA和退火产物直接混合后随即转化大肠杆菌细胞，省去了传统的需要连接酶对两者进行连接的过程，简化了操作步骤，节约了时间。

四、本发明在用于构建植物RNAi表达载体时，改造后的植物表达载体经线性化处理后直接与退火产物混合，转化大肠杆菌即获得想要的植物RNAi表达载体，省去了目前广泛使用的先在小的入口载体上构建RNAi表达单元、然后再通过Gateway的克隆方式转移到植物双元表达载体的克隆步骤。本发明操作步骤更为简单，过程更加快速，而且构建的植物RNAi表达载体不含有除在植物中使用的筛选标记之外的任何筛选标记，实用性更强。

五、本发明的整个过程操作简单方便，实验周期短，成本低，筛选方便、直观、快捷，很容易实现自动化和高通量操作。

附图说明

图1为本发明实施例1中的载体pYH1301-miR528^PDS的具体过程；

其中“35S”表示能在植物体内发挥转录作用的35S启动子序列；“NOS”表示能在植物体发挥作用的终止子序列；“gfp cassette”表示填充片段gfp表达单元；“miR528^PDS”表示成功插入载体的退火产物；

图2为本发明实施例1中的改造载体pYH1301-gfp结构图；

图3为本发明实施例2中的载体pGsilG-Lic-shRNA的具体过程；

其中，“hU6promoter”表示能在哺乳动物细胞体内发挥转录作用的启动子序列；“SV40ployA”表示能在哺乳动物细胞体内发挥作用的终止子序列；“gfp cassette”表示填充片段gfp表达单元。“shRNA前体DNA序列”表示成功插入载体的退火产物；

图4为本发明实施例2中的改造载体pGsilG-Lic结构图

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：

利用本发明，构建以水稻的miR528前体分子为骨架、以八青番茄红素脱氢酶(PDS)基因作为干扰靶基因的植物人工微RNA(amiRNA)表达载体(具体过程见图1)。

1)载体的改造

本实验选取植物双元载体pCAMBIA1301为出发载体，将该载体用EcoRI和BstEII双酶切处理后与下列片段连接：35S启动子-HindIII酶切位点-gfp表达单元-NcoI酶切位点(详细序列附后)，获得通用型植物RNAi表达载体pYH1301-gfp(见图2)。

2)寡核苷酸序列的设计与退火

根据文献(PLoS One.2008Mar 19；3(3)：e1829.)报道的水稻miR528前体序列，设计能转录出干扰pds基因的小RNA的序列，并合成一组(此例为8条)长度为50nt左右的寡核苷酸序列(详细序列附后)。

合成的8条寡核苷酸序列首先分别稀释成10μM的浓度，然后分别取2μL至一PCR管内，最后加双蒸水至终体积30μL。在PCR仪上按照94℃2min→80℃10min→70℃10min→55℃10min→4℃逐步降温的程序对混合物进行处理，得到退火产物。

3)线性化载体与退火产物的直接转化

载体pYH1301-gfp首先经HindIII与NcoI双酶切，然后用外切酶T4DNA聚合酶、或者大肠杆菌DNA聚合酶I、或者Klenow DNA聚合酶处理得到5’端突出13nt左右碱基的线性载体。其中加入G作为保护碱基。最后将处理好的线性载体与步骤2)中的退火产物混合，放置30分钟后转化大肠杆菌感受态细胞，涂布LB+Kanamycin(50μg/ml)平板，待菌落长出后挑选在紫外灯下不发光的菌落抽提质粒进行验证。验证结果表明，挑取的菌落含有大小正确的重组质粒的概率为80％以上。正确的重组子送至Invitrogen公司测序。测序结果表明，表达载体pYH1301-miR528^PDS中含有的mi^PDS表达单元碱基正确率为100％。

实施例2：

利用本发明构建以哺乳动物干扰载体pGenesil-1(武汉晶赛生物工程有限公司)为骨架，以GCTGTACTCCCTTACATTA为干扰靶序列的动物shRNA表达载体(具体过程见图3)。

1)克隆载体的改造

分析载体序列，首先选取哺乳动物干扰载体pGenesil-1为出发载体，将其用BamH I和Xho I双酶切线性化后，与片段“Nb.BbvCI酶切位点--前端退火序列--EcoRV酶切位点--gfp表达单元--EcoRV酶切位点--后端退火序列--Nb.BbvCI酶切位点”连接(详细序列附后)，得到可用于构建动物shRNA表达载体的通用型载体pGsilG-Lic(图4)；

2)寡核苷酸序列的设计与退火

按照本发明具体方法步骤二)中的原则，设计并合成一对长度为50nt左右的寡核苷酸特异性引物pF&pR(详细序列附后)，混合两条引物，退火得小DNA片段。得到的产物即为含干扰序列的小DNA片段。

合成的2条寡核苷酸序列首先分别稀释成10-的浓度，然后分别取2μL至一PCR管内，最后加双蒸水至终体积30μL。在PCR仪上按照94℃2min→80℃10min→70℃10min→55℃10min→4℃逐步降温的程序对混合物进行处理，得到退火产物。

3)线性化载体与退火产物的直接转化

将步骤1)中改造好的载体pGsilG-Lic经Nb.BbvCI和EcoRV酶切，酶切产物经回收纯化后与步骤2)中退火形成的小DNA片段混合，放置30分钟后转化大肠杆菌感受态细胞，涂布LB+Kanamycin(50μg/ml)平板，待菌落长出后挑选在紫外灯下不发光的菌落抽提质粒进行验证。验证结果表明，挑取的菌落含有大小正确的重组质粒的概率为80％以上。正确的重组子送至Invitrogen公司测序。测序结果表明，表达载体pGsilG-Lic-shRNA中含有的shRNA表达单元碱基正确率为100％。测序正确的重组质粒即可用于下一步的哺乳动物细胞瞬间表达检测。