一种根部特异性表达启动子及其植物表达载体

摘要

本发明涉及一种根部特异性表达启动子及其植物表达载体，该启动子长1496bp，具有序列表中1项下的序列，将其取代植物表达载体pBI121上的组成型CaMV35S启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为pBITG4；利用花序浸泡法成功导入拟南芥，获得转基因植株，GUS组织化学染色显示该启动子仅在根部特异高效表达，在其它组织细胞中都不表达。该启动子的获得，为利用基因工程获得抗病虫害、抗逆和营养高效利用型的新品种创造了条件，为外源基因在根中特异性表达提供了基础，具有潜在的商业价值和重要的理论实践意义。

说明书

技术领域

本发明涉及植物分子遗传生物学和基因工程领域，具体的说，涉及一种新型芥子酶TGG4基因启动子的获得和植物表达载体的构建，尤其涉及诱导外源基因在根部特异性表达，获得具有较高抗病虫害和营养高效利用型的新品种，具有潜在的应用价值。

背景技术

十字花科植物分布广泛，这种优势得益于其独特的芥子酶防御系统(硫代葡糖苷/芥子酶体系)，俗称“芥子炸弹”。当植物受到机械损伤、昆虫攻击或受到真菌和病原体的感染时，酶和底物(芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在不同的细胞中)相遇，硫代葡糖苷被降解为有毒化合物，参与对病虫害的防御，硫、氮的代谢以及生长调节等。目前在拟南芥中已发现的六个芥子酶基因TGG1、TGG2、TGG3、TGG4、TGG5、TGG6，其中已知芥子酶基因TGG1、TGG2、TGG3与新型芥子酶基因TGG4、TGG5、TGG6，它们在DNA序列、基因结构及编码蛋白特性等方面有较大差异，TGG1、TGG2、TGG4、TGG5被证实是有功能的基因，TGG3、TGG6是不能编码完整芥子酶的假基因。对新型芥子酶基因表达调控及功能的研究将进一步揭示芥子酶防御系统的功能。

启动子是位于结构基因5′端上游的一段DNA序列，由不同的调节元件组成，这些调节元件以不同方式可操作性地结合结构基因，控制基因表达的起始时间和表达的程度。在植物体内，启动子是天然基因和重组基因转录的调节物，管制基因的空间与时间性转录。随着功能基因组学研究的发展，更多的功能基因被克隆，但是要获得更好的转基因植株，首先要考虑的问题即选择适当的启动子并使其在特异部位高效表达。目前植物基因工程中常用的是组成型表达启动子，使外源基因在植物内各部位均表达。特异表达则是将目的基因在有需要的部位进行表达，使目的基因的作用更经济有效发挥；另外，研究植物组织特异性表达的调控方式对植物组织器官分化及基因调控具有重要意义；同时，作为食用植物，外源基因最好直接表达在食用部位以外的其他部位中，更加符合转基因植物的安全性。目前已从植物中分离出在叶片、根、花粉绒毡层、胚胎、内皮层、糊粉层以及韧皮部等器官或组织中特异性表达的多种类型的启动子。其中根特异性启动子相对较少，主要有：烟草RB7根启动子(U.S.Pat.No.5459252)，玉米MR7(U.S.Pat.No.5837848)，马铃薯PGT2的启动子(MEIKEKOSTER-TOPFER，WOLF B FROMME，MARIO ROCHA-SOSA，etal.A Class II patatin promoter is under developmental control in bothtransgenic potato and tobacco plants[J].Mol Gen Genet，1989，219：390-396.)等。

植物的生长与发育依赖根系从土壤中吸收水分和无机盐，根的发育对于植物起着至关重要的作用。根特异性启动子可以驱动其下游的目的基因特异表达在根部，通过转基因手段，可以将已经分离的与K⁺吸收相关的转运器特异地超表达于根部，将有效地提高施肥效率，提高养分的生物利用率。以根作为储藏器官的经济作物，如土豆，在根部特异的增强与淀粉和糖类代谢相关的基因的表达水平，从而提高其利用价值。根系作为植物体进行营养吸收、运输、储存与合成的重要器官，同时也是抵抗病虫害和抗逆环境下赖以生存的重要组成部分。许多植物病原体和害虫破坏植物的根，造成严重的作物损害和损失。只在受特定害虫或者病原体影响的器官或组织中表达有毒的肽的转基因植物提供了减少作物危害和损失的方法。例如，在转基因玉米中的苏云金芽孢杆菌蛋白质的表达提供了对欧洲玉米螟虫的抗性。组织特异性启动子也可以用于将选择的组织位点上杀虫剂原转化成活性形式。Hsu等报道了包含根特异性启动子TobRB7和β-葡糖苷酸酶基因的嵌合基因在优先将根中的杀虫剂原转化成活性形式方面的用途，将灭活的杀虫剂原(羟甲基草酰胺酰的葡糖苷酸)施用到叶片上，然后通过植物韧皮部将其运输到根部，在此由葡糖苷酸酶将其转化成有活性的杀线虫剂形式。植物基因在根中特异性表达的研究，有效揭示了植物根系发生、分化和发育机制，同时在植物营养利用及抗病虫害基因工程研究中具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种根部特异性表达启动子及其植物表达载体，属芥子酶根部特异性表达的启动子及其植物表达载体，该启动子大小1496bp，可有效地将有益目的基因(包括抗病虫害基因、抗逆性基因、促进次生物质代谢的基因、促进矿物质吸收的基因等)导入植物，提高植物抗病虫害的能力，并在植物根中特异高效的表达，从而得到具有较高抗根部病虫害和营养高效利用型的新品种，

本发明所涉及的设计方案为一种芥子酶根部特异性表达的启动子，具有序列表中<400>1项下的序列。通过拟南芥生态型Col-0中提取总DNA克隆获得的芥子酶TGG4基因启动子，经测序其长度为1496bp。通过软件分析，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件。

本发明还提供了一种根部特异性表达的载体，其特征在于转入了前述的拟南芥根部特异性表达的启动子。利用前述的拟南芥特异性表达的启动子置换植物表达载体pBI121上的CaMV35S启动子，构建成在启动子下游含有GUS基因的新的植物表达载体，命名为pBITG4。通过花序浸泡法转化模式植物拟南芥，成功获得转基因植株。RT-PCR结果表明TGG4基因在根部特异性表达，GUS组织化学染色鉴定进一步证实TGG4基因的启动子为根部特异性表达的启动子，pBITG4为一种根部特异性表达的载体。

以下我们分为两大部分详细介绍我们的发明内容。

一、TGG4基因启动子的克隆及表达载体的构建。

采用大连宝生物总DNA提取试剂盒提取拟南芥生态型Col-0基因组DNA。根据数据库中的TGG4基因的序列，设计两个特异性的引物(含有HindIII和BamHI酶切位点)

AP13：5′AGAGAAGCTTGTCGGTTTTGATTGGGTGAGAGA3′；

AP14：5′AGTTGGATCCGGTTTGTATTTTCTTTATTGATGTGCTTC3′

进行PCR扩增，得到一条长约1500bp的产物，双酶切后置换植物表达载体pBI121上的CaMV 35S启动子，得到新的植物表达载体，于上海闪晶测序，测序结果该启动子长1496bp，序列参照序列表<400>1中。通过软件分析，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件，如TATA盒、CAAT盒等。新的植物表达载体命名为pBITG4。

二、转基因植株的获得及GUS组织化学染色。

1)转基因植株的获得

通过电击转化法将上述表达载体转入农杆菌C58，抗性筛选后进行PCR鉴定。鉴定为阳性的转化子通过花序浸泡法转化拟南芥，收取T₀代种子进行抗性筛选，对转基因植株进一步进行PCR鉴定。选择PCR鉴定为阳性的植株继续培养得到转基因纯系。

2)GUS组织化学检测

取T₁代种子抗性分离比为3∶1的小苗进行GUS组织化学染色，观察GUS基因在转基因拟南芥各个植物器官的表达情况，照相。

本发明提供的根部特异性表达的启动子及其植物表达载体，将该启动子取代植物表达载体上的组成型CaMV35S启动子，构建一个新的植物表达载体在根中表达。该启动子的获得，为外源基因(对根部或根部生长发育有影响的基因)在根中特异性表达提供了基础，外源基因可以是改变根组织功能的基因(包括可增强或修饰根的营养价值的基因)、编码杀昆虫或病原体毒素(靶向偏好攻击根的昆虫或病原体)的基因、抗除草剂或不良环境条件特性的基因等。同时利用基因工程技术还可获得抗病虫害、抗逆和营养高效利用型的新品种，因此对于根部特异性表达启动子的研究具有潜在的商业价值和重要的应用价值。

附图说明

图1为TGG4启动子驱动GUS基因在根部特异表达的染色图(表达的GUS细胞经染色呈蓝色)。

A，在植株的茎、叶中都检测不到GUS基因的表达；

B和C，在植株的根部检测到GUS基因的表达；

D，在植株的花、角果中都检测不到GUS基因的表达；

E，在植株的种仁中检测不到GUS基因的表达；

F，在初萌发的种仁中检测不到GUS基因的表达；

G和H，在植株的初生根中检测到GUS基因的表达；G为种子春化后萌发3天的植株在根中检测到GUS基因的表达；H为种子春化后萌发4天的植株在根中检测到GUS基因的表达。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明。

本发明提供了一种拟南芥根部特异性表达启动子及其植物表达载体。该启动子是利用生物信息学的方法分析初步确认、通过PCR方法由拟南芥生态型Col-0总DNA中扩增获得、并通过科学实验验证为根部特异表达(图1)。

1、拟南芥生态型和种植方法是将来自Nottingham ArabidopsisStock Center，England的拟南芥生态型Col-0种子播种在标准营养土上，4℃放置3天后转到培养室培养，温度为白天25℃，晚上22℃，光照16小时/天，光照强度5000lx。拟南芥种子消毒是在1.5ml的Eppendorf管中加入少量种子，用1ml 75％乙醇浸泡数秒，吸出上清液；加入1ml无菌水，上下颠倒数次，静置数秒，吸出上清液；再加入1ml 5％的次氯酸钠溶液，颠倒混匀6～8min，用无菌水冲洗5次；消毒后的种子用1ml灭菌的0.1％琼脂糖混匀，用无菌滴管滴到培养基上；4℃冰箱内春化3天，放入到光照8h/d的人工气候箱萌发，温度为白天25℃，晚上22℃，20天后转入14h/d光照培养箱，温度同上；萌发后30天，选取健壮、生长一致的苗移栽到事先灭菌的培养土中，覆盖保鲜膜，等苗生长正常后(一般需3～5d)去保鲜膜培养(温度为白天25℃，晚上22℃，14h/d光照)。

2、TGG4基因启动子的克隆及载体的构建是取拟南芥生态型Col-0植株的叶片，液氮研磨，采用大连宝生物公司总DNA提取试剂盒提取拟南芥总DNA。以基因特异引物(并分别加上HindIII和BamHI酶切位点)AP13：5′AGAGAAGCTTGTCGGTTTTGATTGGGTGAGAGA3′；AP14：5′AGTTGGATCCGGTTTGTATTTTCTTTATTGATGTGCTTC 3′扩增TGG4启动子片段。引物由上海闪晶生物公司合成，DNA聚合酶LA Taq来自大连宝生物公司。

目的片段的PCR扩增：在PCR管中依次加入

10×PCR Buffer    5μl

dNTP              4μl

Template          1μl

Primer 1                    1μl

Primer 2                    1μl

Taq E                       0.5μl

Sterilized distilled water  37.5μl

Total                       50μl

轻轻混匀，瞬时离心，将Eppendorf管置PCR扩增仪中，盖上加热帽。反应程序：94℃变性2min；94℃变性40s，62℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min结束反应。取5μl PCR扩增反应液进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，5V/cm恒电压条件下电泳30min后，通过凝胶成像系统观察并照相。采用大连宝生物小片段纯化试剂盒回收纯化产物。将纯化产物和植物表达载体pBI121双酶切。酶切反应体系如下：

1×K Buffer                   5μl

Hind III                      1.5μl

BamH I                        1.5μl

纯化PCR产物                   30μl   

Sterilized distilled water    12μl

Total                         50μl

1×K Buffer                   5μl

Hind III                      1.5μl

BamH I                        1.5μl

酶切底物    pBI121表达载体质粒40μl

Sterilized distilled water    2μl

Total                         50μl

30℃反应3h，纯化后40μl ddH₂O洗脱得到各酶切产物。酶切反应全部结束后对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳、照相、检查片段大小，切胶回收大片段、浓缩，进行连接反应。反应体系如下：

10×连接酶Buffer               2μl

PCR片段                        5μl

载体片段                       1μl

T₄DNA连接酶                    1μl

Sterilized distilled water     11μl

Total                          20μl

轻弹混匀瞬时离心后，16℃过夜反应，次日全部用作转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，酶切鉴定后，由上海闪晶生物公司测序鉴定。每个片段至少测3个克隆，以排除PCR错误对序列的影响。测序结果为该启动子长1496bp，序列参照序列表<400>1中。通过软件分析，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件，如TATA盒、CAAT盒等。测序正确的载体命名为pBITG4。

3、表达载体导入农杆菌C58是采用电击转化法，分别吸取1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态细胞于离心管中，充分混匀，置冰上10min；将上述混和液转移到经紫外照射灭菌的电极杯中，进行电击脉冲放电(电压1.8kv，电容25μf，阻抗400Ω)；电击结束后，分别加入500l液体YEP培养基，轻轻混匀后，吸出混和液到10ml离心管中，28℃，200rpm，培养4～6h；吸取200μl菌液，涂布到含有相应抗生素的固体YEP培养基上，28℃培养1～2d。对单菌落进行菌液PCR鉴定筛选阳性转化子。

4、农杆菌介导法转化拟南芥是通过花序浸泡的方法侵染拟南芥生态型Col-0，并引入组成型表达的35S启动子作为一个参照。选取健壮、生长一致、抽苔的的苗，头天浇水浇透；农杆菌先摇30ml，再取25ml放入500ml YEP+Km(相应抗生素)中，摇菌24h以上(OD₆₀₀值在1.8～2.0)；4000rpm离心15min(室温)集菌；用2倍体积(1L)转化Buffer(1000ml 1/2MS+10μl BA(1mg/mL)+Tween20400μl+5％蔗糖，用KOH调PH5.8)溶解，混匀后用来转化；取花序15cm左右的拟南芥植株，剪掉果荚及已开的花，整个花序轴浸入到转化溶液中10min或将整个花序轴浸入到转化溶液后置于真空装置中抽真空5min；取出后让植物平躺，覆盖保鲜膜，置于黑暗中，隔天再立起；约一个半月后可以收种子(25℃/22℃，16h/8h光/暗)；转化植株收种后，根据转化质粒抗性筛选转基因植株，进一步种植筛选得到转基因植株纯系。

5、转基因植株的筛选是根据转化质粒抗性筛选转基因植株，抗性筛选(卡那霉素50μg/ml)得到的转基因植株通过SDS法进行PCR鉴定初步确定转化成功的植株。取新生叶片1片(约10mg)，置于1.5ml Epppendorf管中，室温下，用塑料小杵将叶片迅速研磨成匀浆(20s之内)；加入提取液(200mmol/L Tris-HCl pH8.0；250mmol/LNaCL；25mmol/L EDTA；0.5％SDS；121℃，高压蒸汽灭菌20min)400μl，剧烈摇动震荡混匀；在微型离心机上，12000rpm，离心2min；取上清液300μl，转移到另一个1.5mlEpppendorf管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后，室温下静置2min；室温，12000rpm，离心5min，弃上清，开盖放置15min左右，使异丙醇挥发，但是时间不易过长，否则沉淀的DNA难以回溶；加入50μlddH₂0，溶解沉淀，得到DNA粗提液；离心样品1min，上清液用于PCR反应；取5μl样品电泳，检测DNA提取质量；取1μl DNA为模板，其它成分按标准程序进行PCR反应；取5μl PCR产物电泳检测。继续种植收获T1代拟南芥植株上的成熟种子，取100～200颗消毒后播种于含相应抗生素的培养基上，春化后光照培养，10～20天后分别计数抗性苗和非抗性苗的数目，计算抗性苗与非抗性苗的比率(分离比)，3∶1即符合孟德尔遗传定律。

转基因植株的GUS检测是对转基因植株进行GUS染色分析。取T1代种子抗性分离比为3∶1的小苗直接加入适量新鲜配制的X-gluc溶液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0，1mmol/L X-gluc，0.1％TritonX-100，0.1mmol/L亚铁氰化钾，0.1mmol/L铁氰化钾，20％甲醇)中，37℃温育1h至过夜；然后脱色：分别用30％、50％、70％和100％乙醇漂洗，每次5min，继续用100％乙醇脱色至背景白色或无色为止；最后将脱好色的材料放在70％乙醇中保存或照相。