一种从海藻中制备吲哚乙酸和脱落酸的方法

摘要

本发明涉及一种从海藻中制备吲哚乙酸和脱落酸的方法。所要解决的问题就是背景技术存在的：吲哚乙酸和脱落酸这两种植物激素在工业上大部分由化学合成得到，生物活性受到限制；或者植物成本高、溶剂消耗量大、收率低、纯度低等问题。解决该技术问题所采用的技术方案要点是：将海藻浸泡、大孔树脂吸附、解吸、浓缩、高速逆流色谱纯化、结晶获得吲哚乙酸和脱落酸。本发明可以用于从海藻中制备吲哚乙酸和脱落酸，具有利用天然生物资源，简便易行，成本低，收率高，环保效果好等显著优点。

说明书

技术领域：本发明涉及从海藻中制备植物促生长激素吲哚乙酸和植物生长激素脱落酸的方法。

背景技术：许多海藻体内含有丰富的天然植物生长素，因为在海洋独特的生态环境中，海藻属于被吞食的弱者，海藻为了对付海洋食草动物的大量吞食以维持自身的生存繁殖，往往体内会产生一些特殊的代谢物质，它们能促使自身大量快速繁殖。早在1940年，人们就发现海藻中含有生长调节剂如植物生长激素吲哚乙酸，还有脱落酸。然而，受到资源和技术的限制，这两种植物激素在工业上大部分由化学合成得到，生物活性受到限制。

吲哚乙酸(indole-3-acetic acid)用作植物生长刺激素及分析试剂，在自然界天然存在，英国科学家研究认为吲哚乙酸具有抗癌功能，有望用于研制治疗多种癌症的新药。实验表明，吲哚乙酸在受到光照激活之后，能够有效杀死癌细胞，效率达到99.9％。然而目前制备吲哚乙酸大部分是使用化工合成方法，其从天然产物获得的技术鲜见报道。

脱落酸(Abscisic acid)是一种具有全面生理功能的内源植物激素。到目前为止关于脱落酸生理机能的研究证实了它在植物生长中发挥了重要的作用，例如种子发展和成熟，环境逆因子的应答，起到重要调整作用。脱落酸能促进果子、谷物、豆类和成熟等等，能极大改进他们的生产力和质量，而且提高了它的面耐寒、耐旱和抗盐碱的功能。然而高纯度的天然脱落酸的来源受到了很大的制约，可以用于植物生理机能研究的天然脱落酸的获得变得更加困难。因此现在高纯度天然脱落酸的价格仍然极高，售价高达230.9美元/毫克(Sigma)。由于昂贵的价格和活性上的差异，脱落酸一直未被广泛应用于农业生产，各国科学家都在寻找天然型脱落酸廉价生产的方法。脱落酸有两种光学构型，但具有生理功能、存在于植物体内的天然脱落酸光学构型为(s)-(+)-脱落酸，其结构为：

据报道，人工合成脱落酸得到的是外消旋体，生物活性较低。至今报道的天然脱落酸制备都是利用植物原料提取和微生物发酵生产。利用植物原料提取天然脱落酸，首先将植物细胞磨碎，用有机溶剂抽提，萃取，提取液浓缩，再进行多种柱层析后，结晶得到天然脱落酸。该方法提取过程繁琐，而且由于每1公斤干植物仅含1-0.5毫克天然脱落酸，其植物中的天然脱落酸含量很低，因此用植物提取天然脱落酸耗费大量的植物资源，成本过高。利用微生物发酵法提取天然脱落酸，如J-P-A-63-296697公开的固体培养法，微生物发酵15天脱落酸的浓度是63mg/升，由于天然脱落酸的的发酵产量一直比较低。因此，微生物发酵生产脱落酸的重点在于菌株的筛选和培养，有关的工作开展得不多，如公开号CN 1944385A发明的从微生物发酵产物中用离子交换树脂分离提取天然脱落酸，但得到产量非常有限。再例如，JP-A-60-6629公开的用大量溶剂萃取天然脱落酸，其产品收率约54％。JP-A-3-6139公开的产品收率为73％。高纯度天然脱落酸的提取方法涉及很少。因此，直到现在高纯度天然脱落酸的制备没有简单有效的方法，从而影响了天然脱落酸这种具有全面生理功能的内源植物激素在农业生产上的应用。

发明内容：本发明的目的就是提出一种从海藻中制备吲哚乙酸和脱落酸的方法的技术方案，以解决背景技术存在的：吲哚乙酸和脱落酸这两种植物激素在工业上大部分由化学合成得到，生物活性受到限制；或者植物成本高、溶剂消耗量大、过程繁琐、收率低、纯度低等问题。解决该技术问题所采用的技术方案是：一种从海藻中制备吲哚乙酸和脱落酸的方法，其特征在于该方法按照如下步骤完成：

第一步、将海藻晒干，按照取1∶20-30的重量比，加入乙醇浸提8天以上；

第二步、将海藻浸提液蒸发，设水浴温度为55-75℃，蒸干得到浸膏；

第三步、将浸膏使用30％-50％乙醇溶解，经过滤除去不溶物，滤液上已经预处理的大孔树脂柱层析；

第四步、用70％-80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干；

第五步、将上步浓缩至干的物质，由配备了恒流泵，紫外检测仪，数据采集系统的高速逆流色谱仪进行纯化；即在室温条件下，配备正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，其体积比为3-5∶5-6∶5-6∶4-6的溶剂体系，将此体系置于分液漏斗中充分混匀，使用前将上下相溶液分开，分别超声处理除去气泡，先以流速为8-10ml/min的速度泵入上相(固定相)，待固定相充满所有管路之后，停止泵入固定相，打开高速逆流色谱仪，转速调到700-900r/min。再打开柱塞泵，流速调到1-2ml/min，泵入下相(流动相)，待流动相连续流出时，使用流动相溶解上述浓缩至干的物质，从上样口进样，馏分收集；

第六步、检测高速逆流色谱纯化后的馏分得到天然吲哚乙酸和脱落酸。

上述方法中，在第三步中，大孔树脂的预处理程序如下：取大孔树脂置于三角瓶中，先用30％-50％乙醇浸泡让树脂吸饱水，使树脂充分展开；更换乙醇溶液，将充分展开后的树脂放在摇床振荡，摇床振荡频率200r/min以上，用清水对树脂进行反复清洗，洗至出水清澈无混浊、无杂质为止；将三角瓶置于摇床上，加入上述树脂体积2倍的2％-4％的NaOH浸泡，同时在摇床上振荡使其浸泡充分，纯净水洗至中性；再加入上述树脂2倍体积的2％-4％的HCl溶液在摇床上振荡使其浸泡充分，吸干溶液，再加2％-4％HCl溶液刚好浸没树脂，装柱，用纯净水洗脱层析柱使其均匀。在第二步中，回收乙醇，重复利用溶剂。在第四步中，回收乙醇。第六步中使用高效液相色谱检测识别吲哚乙酸和脱落酸。第五步中优化后的溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，其体积比为4∶6∶5.5∶5。第五步中上相(固定相)的优化流速为10ml/min，下相(流动相)优化流速2ml/min，高速逆流色谱仪优化转速850r/min。

本发明与背景技术比较所具有的有益效果是：由于采用上述技术方案，利用海藻资源，主要使用大孔树脂结合高速逆流色谱的科学手段，选择合理数值范围的工艺参数，使得乙醇浓度、溶剂体系的体积比、泵入上下相的速度等参数形成有机配合，解决了背景技术问题，实现了发明目的。其有益效果归纳如下：第一、从海藻中提取植物激素，充分利用海藻资源，既解决了成本问题，又保护了环境。第二、提取方法简单合理、可行，溶剂可回收，重复使用，节约能源。第三、本方法采用大孔树脂分离和高速逆流色谱纯化一次性从海藻中获得到高纯的吲哚乙酸和脱落酸两种植物激素，吲哚乙酸的纯度达到98.1％，回收率达到94.1％；脱落酸的纯度达到99.3％，回收率达到94.0％。

附图说明：图1是本发明方法的流程图。

具体实施方式：

实施例1：参考图1，取10kg晒干的海带，用20倍于海带重量的乙醇浸提10天，浸提液旋转蒸发，设水浴温度为55℃，蒸干得到浸膏，回收乙醇，浸膏使用30％乙醇溶解，经滤纸过滤除去不溶物，滤液上大孔树脂柱层析。树脂的预处理程序如下：取大孔树脂AB-8 1000ml置于3000ml三角瓶中，预处理先用30％乙醇浸泡20h让树脂吸饱水，使树脂充分展开。更换乙醇溶液，将充分展开后的树脂放在摇床振荡2h，摇床振荡频率200r/min，用清水对树脂进行反复清洗，洗至出水清澈无混浊、无杂质为止。用超纯水清洗树脂，在摇床上振荡2h，更换超纯水。将三角瓶置于摇床上，用2倍体积的2％的NaOH浸泡在摇床上振荡2h，用纯净水清洗至中性。再用2倍体积的2％的HCl溶液在摇床上振荡2h，吸干溶液，再加4％HCl溶液刚好浸没树脂，备用。处理过的树脂放入烧杯，加少量水搅拌，把树脂沿壁缓缓灌入层析柱。用70％的乙醇洗脱，流速2ml/min，收集3000ml洗脱液。浓缩至干，回收乙醇。将浓缩至干的物质，由配备了恒流泵，紫外检测仪，记录仪及数据采集系统的高速逆流色谱仪进行纯化，溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶5∶5∶4)，即在室温条件下，将溶剂体系的有机相和水相置于分液漏斗中充分混匀过夜。使用前30分钟将两相溶液分开并超声10分钟除去气泡。。先以流速为8ml/min的速度泵入上相(固定相)，待固定相充满所有管路之后，停止泵入固定相，打开高速逆流色谱仪转速调到700r/min。再打开柱塞泵，流速调到1ml/min，泵入下相(流动相)，待流动相连续流出时，使用流动相溶解上述浓缩至干的物质，从上样口进样，馏分收集；高速逆流色谱纯化后得到的馏分使用高效液相色谱检测识别，共得到天然吲哚乙酸和脱落酸分别是7.8克和10.6克。吲哚乙酸的纯度达到97.1％，回收率达到93.1％；脱落酸的纯度达到98.3％，回收率达到93.0％。

实施例2：参考图1，参考图1，取10kg晒干的海带，用30倍于海带重量的乙醇浸提12天，浸提液旋转蒸发，设水浴温度为75℃，蒸干得到浸膏，回收乙醇，浸膏使用50％乙醇溶解，经滤纸过滤除去不溶物，滤液上大孔树脂柱层析。树脂的预处理程序如下：取大孔树脂AB-81000ml置于3000ml三角瓶中，预处理先用50％乙醇浸泡20h让树脂吸饱水，使树脂充分展开。更换乙醇溶液，将充分展开后的树脂放在摇床振荡2h，摇床振荡频率200r/min，用清水对树脂进行反复清洗，洗至出水清澈无混浊、无杂质为止。用超纯水清洗树脂，在摇床上振荡2h，更换超纯水。将三角瓶置于摇床上，用2倍体积的4％的NaOH浸泡在摇床上振荡2h，用纯净水清洗至中性。再用2倍体积的4％的HCl溶液在摇床上振荡2h，吸干溶液，再加4％HCl溶液刚好浸没树脂，备用。处理过的树脂放入烧杯，加少量水搅拌，把树脂沿壁缓缓灌入层析柱。用80％的乙醇洗脱，流速2ml/min，收集3000ml洗脱液。浓缩至干，回收乙醇。将浓缩至干的物质，由配备了恒流泵，紫外检测仪，记录仪及数据采集系统的高速逆流色谱仪进行纯化，溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶6∶6∶6)，即在室温条件下，将溶剂体系的有机相和水相置于分液漏斗中充分混匀过夜。使用前30分钟将两相溶液分开并超声10分钟除去气泡。先以流速为9ml/min的速度泵入上相(固定相)，待固定相充满所有管路之后，停止泵入固定相，打开高速逆流色谱仪，转速调到900r/min。再打开柱塞泵，流速调到1.5ml/min，泵入下相(流动相)，待流动相连续流出时，使用流动相溶解上述浓缩至干的物质，从上样口进样，馏分收集；高速逆流色谱纯化后得到的馏分使用高效液相色谱检测识别，共得到天然吲哚乙酸和脱落酸分别是8.0克和10.4克。吲哚乙酸的纯度达到97.5％，回收率达到92.4％；脱落酸的纯度达到98.6％，回收率达到92.6％。

实施例3：参考图1，取10kg晒干的海带，用25倍于海带重量的乙醇浸提10天，浸提液旋转蒸发，设水浴温度为60℃，蒸干得到浸膏，回收乙醇，浸膏使用40％乙醇溶解，经滤纸过滤除去不溶物，滤液上大孔树脂柱层析。树脂的预处理程序如下：取大孔树脂AB-8 1000ml置于3000ml三角瓶中，预处理先用40％乙醇浸泡20h让树脂吸饱水，使树脂充分展开。更换乙醇溶液，将充分展开后的树脂放在摇床振荡2h，摇床振荡频率200r/min，用清水对树脂进行反复清洗，洗至出水清澈无混浊、无杂质为止。用超纯水清洗树脂，在摇床上振荡2h，更换超纯水。将三角瓶置于摇床上，用2倍体积的4％的NaOH浸泡在摇床上振荡2h，用纯净水清洗至中性。再用2倍体积的4％的HCl溶液在摇床上振荡2h，吸干溶液，再加4％HCl溶液刚好浸没树脂，备用。处理过的树脂放入烧杯，加少量水搅拌，把树脂沿壁缓缓灌入层析柱。用75％的乙醇洗脱，流速2ml/min，收集3000ml洗脱液。浓缩至干，回收乙醇。将浓缩至干的物质，由配备了恒流泵，紫外检测仪，记录仪及数据采集系统的高速逆流色谱仪进行纯化，溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5.5∶5)，即在室温条件下，将溶剂体系的有机相和水相置于分液漏斗中充分混匀过夜。使用前30分钟将两相溶液分开并超声10分钟除去气泡。先以流速为10ml/min的速度泵入上相(固定相)，待固定相充满所有管路之后，停止泵入固定相，打开高速逆流色谱仪，转速调到850r/min。再打开柱塞泵，流速调到2ml/min，泵入下相(流动相)，待流动相连续流出时，使用流动相溶解上述浓缩至干的物质，从上样口进样，馏分收集；高速逆流色谱纯化后得到的馏分使用高效液相色谱检测识别，共得到吲哚乙酸和脱落酸分别是8.1克和11.0克。吲哚乙酸的纯度达到98.1％，回收率达到94.1％；脱落酸的纯度达到99.3％，回收率达到94.0％。