一种可眼内注射的原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的应用

摘要

本发明公开了一种原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的应用；所述原位交联水凝胶，是由式(I)所示四臂端巯基聚乙二醇的溶液和式(II)所示聚合物的溶液混合后，原位交联制成的；其中，式(I)中的m为大于1的整数；式(II)中的n为大于1的整数。将上述两种溶液混合后在无玻璃体眼内进行填充，可有效形成凝胶。经细胞实验和动物体内实验验证均未引起明显炎性反应和眼内组织毒性反应，可作为人工玻璃体使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可眼内注射的原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的应用。

背景技术

玻璃体切除术是临床上常用的治疗视网膜脱离、玻璃体出血、眼后段外伤等眼底疾患的手术方法。玻璃体被切除后，需要注入眼内填充物来进行视网膜的顶压复位和维持眼球外形。常用的眼内填充物有硅油和惰性气体(如SF₆、C₂F₆和C₃F₈等)。但硅油填充存在硅油乳化、继发性青光眼、角膜带状变性及并发性白内障等并发症，必须二次手术取出。对于那些硅油依赖眼，硅油取出后即眼球萎缩者，则无能为力。而气体眼内填充的时间比较短暂，因为气体会不断被眼内组织吸收，所以在眼内的容积逐渐缩小，不超过2个月的时间内，气体会完全吸收。因此，迄今为止，临床上缺乏比较理想的眼内填充物。

发明内容

本发明的目的是提供一种原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的应用。

所述原位交联水凝胶，是由式(I)所示四臂端巯基聚乙二醇(4ARM-PEG-SH)的溶液和式(II)所示聚合物(PEG-S-EMA)的溶液混合后，原位交联制成的；

式(I)

式(II)

其中，式(I)中的m为大于1的整数；式(II)中的n为大于1的整数。

式(I)所示的4ARM-PEG-SH，其数均分子量具体可为10000，可购于JenChem，货号4ARM-SH-10K。

式(II)所示的PEG-S-EMA，其聚合度n优选为大于30小于60的整数。

上述两种溶液中的溶剂均选自下述任意一种：水、质量浓度0.9％的氯化钠水溶液和pH值为7.0-8.0且浓度为0.01-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

所述四臂端巯基聚乙二醇的溶液中四臂端巯基聚乙二醇的质量浓度为0.1-500mg/mL，优选为140-160mg/ml；所述PEG-S-EMA溶液中PEG-S-EMA的质量浓度为0.1-500mg/mL，优选为140-160mg/ml。

所述四臂端巯基聚乙二醇的溶液和所述PEG-S-EMA的溶液的体积比为1∶10-10∶1，优选为2∶1-3∶1。

本发明所提供的人工玻璃体替代材料与传统的人工玻璃体替代材料相比，在眼内可持续填充，无明显毒性反应的优点，并且在结构上模拟原始的天然玻璃体结构，为亲水性。

附图说明

图1为本发明所制备的PEG-S-EMA的核磁共振氢谱谱图。

图2为实施例2中使用本发明提供的水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔25后的玻璃体腔凝胶照相。

图3为实施例2中使用本发明提供的水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔25天后的眼底照相。

图4为实施例2中使用本发明提供的水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔25天后的凝胶苏木素-伊红染色照片。

图5为实施例2中使用本发明提供的水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔25天后的晶状体照相。

图6为实施例2中使用本发明提供的水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔25天后的视网膜苏木素-伊红染色(A)和正常视网膜相比(B)。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。但是本发明的保护范围并不局限于实施例所表述的范围。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的四臂端巯基聚乙二醇(4ARM-PEG-SH)，数均分子量约为10000，购于JenChem，货号4ARM-SH-10K。

下述实施例中所用的PEG-S-EMA(n为大于30小于60的整数)是按照下述方法制备得到的：

将羟端基PEG(数均分子量约为2000，Alfa-Aesar提供，货号B22181)20.0g溶于500mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺8.3mL、对甲苯磺酰氯11.4g，室温下反应24小时，将所得产物与硫代乙酸钾4.5g在85℃下回流4小时，然后将所得产物与2M氨的甲醇溶液，在氮气保护下搅拌4小时，即得到端巯基PEG。将9.0g羟甲基丙烯酸乙酯(TCI提供，货号H0916)溶于75mL无水乙醚中，冰浴下滴入2.3mL三溴化磷，冰浴下反应3小时后于室温继续反应24小时，得到溴甲基丙烯酸乙酯。将20.0g端巯基PEG溶于300mL二氯甲烷中，加入3mL三乙胺，并在冰浴下滴入8mL溴甲基丙烯酸乙酯，室温下反应24小时，即得到最终产品(PEG-S-EMA)。

所得化合物的结构可以从图1的核磁氢谱得到确认。

实施例1、本发明的原位交联凝胶的细胞安全性试验

细胞实验步骤如下：

1、将4ARM-PEG-SH和PEG-S-EMA分别溶于pH＝7.4浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度均为150mg/mL的溶液，将两者的溶液以体积比为2∶1在体外混合，3h得到凝胶块，用于细胞实验。

2、细胞系(大鼠视网膜色素上皮细胞D407细胞系；猴眼视网膜血管内皮细胞RF/6A)(CRL-1780细胞系)常规培养，培养液为DMEM/F12＝1∶1(购于美国Hyclone公司)，加入胎牛血清(终浓度为10％)，取传至3-6代的细胞用于实验。

3、0.25％的胰酶消化细胞，混匀，制成细胞悬液，计数至50000/ml，取无菌96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，放入37度5％CO₂的恒温培养箱内培养，至细胞融合到70％孔底面积，给予无血清的培养液培养24h。

4.弃掉培养液，每孔重新加入新鲜的无血清培养液100μl，不同的组别分别加入不同浓度的新材料凝胶块(每组设5个重复)，对照组不加，培养箱内继续培养24h。

5、弃掉培养液和其内的凝胶块，每孔加入含10％CCK-8的无血清培养液继续培养3h，以450nm波长测定各孔的吸光度值，结果见表1和表2。

表1大鼠视网膜色素上皮细胞与原位交联凝胶共培养后CCK8吸光度值

表2猴眼视网膜血管内皮细胞RF/6A与新材料共培养后CCK8吸光度值

细胞实验的数据表明：大鼠视网膜色素上皮细胞与10％浓度或15％浓度的新材料凝胶块共培养24h后，与未加凝胶的空白组相比，CCK8吸光度值差异均不显著(独立样本t检验，P＝0.57；P＝0.19)。猴眼视网膜血管内皮细胞RF/6A与10％浓度或15％浓度新材料凝胶块共培养24h后，与未加凝胶的空白组相比，CCK8吸光度值差异亦均不显著(P＝0.52；P＝0.61)。上述结果表明，本发明提供的新材料原位交联凝胶没有明显的细胞毒性反应。

实施例2、本发明的原位交联凝胶动物眼内填充安全性实验

试验选取5只青紫兰兔。

动物实验步骤如下：

1、麻醉青紫兰兔。

2、沿角膜缘剪开半侧球结膜，19G巩膜穿刺刀造灌注孔和玻切孔。

3、插入灌注头，打开灌注，灌注液的配方如下：500ml乳酸林格氏液中加入50％葡萄糖4ml，地塞米松(5mg/1ml)1.6ml，盐酸肾上腺素(1mg/1ml)0.5ml，妥布霉素(8万U/1ml)0.2ml。

4、玻璃体切割头伸入玻璃体腔，切除全部玻璃体。

5、将4ARM-PEG-SH和PEG-S-EMA分别溶于pH＝7.4浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度均为150mg/mL的溶液，将两者的溶液以体积比为2∶1混合均匀，注入玻璃体腔。

6、缝合巩膜口和球结膜。

7.结膜囊涂抹泰利必妥眼膏。

本发明提供的原位交联的聚乙二醇衍生物材料在玻璃体切除后的兔眼内有效形成凝胶，形状符合玻璃体腔形状的特点，并且保持透明，表面无渗出膜、出血覆盖(见图2)。对水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔25天后的眼底照相(见图3)，可见视网膜及脉络膜表现正常，无出血、渗出等病理性改变。对兔眼玻璃体腔中的凝胶用苏木素-伊红染色(见图4)，可见凝胶内部无炎性细胞浸润。对水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔25天后的晶状体照相(见图5)，可见晶状体透明无混浊。由此反映本材料对晶状体没有造成明显毒性。对水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔25天后的视网膜苏木素-伊红染色(见图6)，与正常视网膜相比(B)，两者无明显差异，由此反映本材料对视网膜没有造成明显毒性。

综上，原位交联的聚乙二醇衍生物材料在玻璃体切除后的兔眼内有效形成凝胶，并且保持透明，无炎性细胞浸润。兔眼的晶状体保持透明，未出现混浊。视网膜和脉络膜的各层组织结构存在，未见出血、水肿等病理改变。动物体内实验也证实本材料在眼内填充是安全的。