甘薯茎尖的包埋玻璃化超低温保存方法

摘要

本发明涉及一种甘薯茎尖的包埋玻璃化超低温保存方法，以中国甘薯品种的甘薯苗为材料，无需预培养将其茎尖进行包埋。在不同浓度的蔗糖MS溶液中进行包埋后预培养，在玻璃化溶液脱水处理90-120分钟，超低温冷冻保存；冷冻后的恢复培养，不经过愈伤组织直接出芽形成完整的小植株，可以进行大量的无性繁殖。本方法所用材料来源于国内甘薯品种，操作简单，长期冻存后材料恢复生长快。

说明书

技术领域

本发明涉及甘薯种质保存及植株再生的技术，特别涉及甘薯茎尖的包埋玻璃化超低温保存方法，属于甘薯组织培养技术领域。

背景技术

长期以来，甘薯的很多品种在推广生产后迅速退化，丧失新品种的优良种性，对甘薯的产量与品质造成极大影响。因此，如何较好地收集和保存甘薯种质资源逐渐受到重视。目前，常用的保护植物种质资源的方法都有着各自的局限性。众多的试验表明，包埋玻璃化法超低温冷冻保存植物种质技术是较为理想的一种方法。它的功能及优点如下：1、长期保持种质活力，2、冻存材料后的遗传稳定性好，3、同时处理大量材料、处理后材料恢复生长快、对材料毒害小及出芽率高，4、操作简单等优点。现有的包埋玻璃化超低温保存技术A，参见D.Hira，A.Sakai，Simplified cryopreservation of sweet potato [Ipomoeabatatas(L.)Lam.]by optimizing conditions for osmoprotection，Plant Cell Reports，(2003)21：961-966。

目前已有包埋玻璃化法应用于苹果、葡萄、马铃薯以及木薯等多种植物上的报道。但至今未发现有中国甘薯品种用包埋玻璃化超低温方法保存的应用。

本发明中的甘薯茎尖的包埋玻璃化超低温保存技术，根据对国内品种进行研究，提出一种适合中国甘薯品种的超低温保存技术。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种适合中国甘薯品种的甘薯茎尖包埋玻璃化超低温保存方法及冷冻后植株再生的技术。

术语说明：

MS(murashige skoog)：是组织培养常用基本培养基，属于本领域公知术语。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，可满足植物细胞在营养上和生理上的需要。

PVS(plant vitrification solution)玻璃化溶液：即植物玻璃化溶液，是处理植物样品的复合高渗溶液。

本发明的技术方案如下：

一种甘薯茎尖包埋玻璃化超低温保存方法，步骤如下：

1.从甘薯的试管苗上取1～1.5mm甘薯茎尖；将甘薯茎尖移入到浓度为3克/100ml的海藻酸钠和0.2M甘油的无钙离子的MS溶液中，室温浸泡5～20秒；

2.将含有11.1g/l CaCl₂、2M甘油、0.2M蔗糖的MS溶液在冰块中预冷15～25分钟，将步骤1的甘薯茎尖连同浸泡溶液一起加入其中，形成直径为0.5-0.8cm甘薯茎尖小球；将甘薯茎尖小球依次移入以下预培养基中进行预培养：

将小球移入盛有50ml预培养基I溶液的三角瓶中，预培养基I溶液配方为：MS+30g/l蔗糖+1g/l酪蛋白氨基酸，摇床培养24小时，25～28℃，60～90rpm；

将小球移入盛有50ml预培养基II溶液的三角瓶中，预培养基II溶液配方为：MS+0.3M蔗糖，摇床培养16小时，25～28℃，60～90rpm；

将小球移入盛有50ml预培养基III溶液的三角瓶中，预培养基III溶液配方为：MS+1.6M蔗糖+2M甘油，摇床培养3小时，25～28℃，60-90rpm。

制得预培养好的甘薯茎尖小球。

3.将上述预培养好的甘薯茎尖小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中，25℃培养90～120min。

4.将步骤3处理过的甘薯茎尖小球移入2ml规格的超低温管中，每个管中装8-10个小球，置入液氮中冷冻保存。

当需要将冷冻保存的甘薯茎尖恢复培养时，继续进行以下步骤：

5.将步骤4得到的盛有小球的超低温管从液氮中取出，迅速移到38℃的水浴锅中，解冻2-4分钟，将小球放入卸载溶液中，室温，放置20-25min。

卸载溶液组成为：1.2M蔗糖+MS，pH5.8。

6.将步骤5得到的小球移入盛有25ml成活培养基的培养皿中，成活培养基配方为：MS+0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤+1mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂，pH5.8，25℃黑暗培养3天；然后在24-28℃培养7天，并保持每天16小时的3000lux光照培养和每天8小时的黑暗培养。得成活小球。

7.将上述成活小球移入盛有25ml再生培养基的培养皿中，在24-28℃培养并保持每天16小时的3000lux光照，培养成苗，每隔三周，将成苗小球转移到盛有新配的再生培养基的培养皿中。所述再生培养基配方为：MS+2.5mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂，pH 5.8。待成苗小球的苗长达0.4-0.6cm时，转入MS固体培养基中生根。

上述步骤3中PVS玻璃化溶液组成为：MS+30克/100ml甘油+15克/100ml乙二醇+15克/100ml二甲基亚砜(DMSO)+0.4M蔗糖，pH 5.8。

本发明方法中所述甘薯为中国甘薯品种，进一步优选的是济薯18或济徐23。

本发明方法中步骤4冷冻保存60min以上，可以长久保存。

本发明的优良效果如下：

1、本发明确定了中国甘薯品种的保存方法，经试验证明以前公开报道的技术都不适合我国的甘薯品种的种质保存，特别是济薯18和济徐23甘薯品种。本发明方法超低温冷冻后的成活率80-90％，现有技术仅为30-35％。

2、本发明以中国甘薯品种的甘薯苗为材料，无需预培养将其茎尖进行包埋。在不同浓度的蔗糖MS溶液中进行包埋后预培养，在玻璃化溶液脱水处理90分钟，超低温冷冻保存。

3、本发明方法在超低温冷冻后的恢复培养后，不经过愈伤组织直接出芽形成完整的小植株，可以进行大量的无性繁殖。

4、本发明的方法所用材料来源于国内甘薯品种，操作简单、有效，长期冻存后材料恢复生长快。

附图说明

图1中发亮白色的小球为成活小球，实施例1步骤6。

图2为恢复培养后生成的小植株，苗长达0.5cm，实施例1步骤7。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例中使用的MS培养基为上海源叶生物科技有限公司产品。配方如表1

表1.MS配方

实施例1：中国甘薯品种为济薯18

一种甘薯茎尖包埋玻璃化超低温保存方法，步骤如下：

1.从甘薯(济薯18)的试管苗上取1.5mm甘薯茎尖；将甘薯茎尖移入到3％(克/ml)海藻酸钠和0.2M甘油的无钙离子的MS溶液中，室温浸泡15秒；

2.将含有11.1g/l CaCl₂、2M甘油、0.2M蔗糖的MS溶液在冰块中预冷20分钟，将步骤1的甘薯茎尖连同浸泡溶液一起加入其中，形成直径为0.5-0.6cm甘薯茎尖小球；将甘薯茎尖小球依次移入以下预培养基中进行预培养：

将小球移入盛有50ml预培养基I溶液的三角瓶中，预培养基I溶液配方为：MS+30g/l蔗糖+1g/l酪蛋白氨基酸，摇床培养24小时，25℃，90rpm；

将小球移入盛有50ml预培养基II溶液的三角瓶中，预培养基II溶液配方为：MS+0.3M蔗糖，摇床培养15-16小时，25℃，90rpm；

将小球移入盛有50ml预培养基III溶液的三角瓶中，预培养基III溶液配方为：MS+1.6M蔗糖+2M甘油，摇床培养3小时，25℃，90rpm。

制得预培养好的小球。

3.将上述预培养好的小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中，25℃培养90min，PVS玻璃化溶液组成为：MS+30％(克/ml)甘油+15％(克/ml)乙二醇+15％(克/ml)二甲基亚砜(DMSO)+0.4M蔗糖，pH 5.8。

4.将步骤3处理过的小球移入2ml规格的超低温管中，每个管中装8-10个小球，置入液氮中，保持1小时；

当需要将冷冻保存的甘薯茎尖恢复培养时，直接进行以下步骤：

5.将盛有小球的超低温管从液氮中取出，迅速移到38℃的水浴锅中，解冻3分钟，将小球放入卸载溶液中，室温，放置20min。

卸载溶液组成为：1.2M蔗糖+MS，pH5.8

6.将小球移入盛有25ml成活培养基的培养皿中，成活培养基配方为：MS+0.5mg/l6-苄氨基嘌呤+1mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂，pH5.8，25℃黑暗培养3天；然后在25℃培养7天，并保持每天16小时的3000lux光照培养和每天8小时的黑暗培养。得成活小球。

7.将成活小球移入盛有25ml再生培养基的培养皿中，在25℃培养并保持每天16小时的3000lux光照，培养成苗。每隔三周，将小球转移到新鲜的盛有再生培养基的培养皿中。所述再生培养基配方为：MS+2.5mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂，pH 5.8。

待苗长达0.5cm时，转入MS固体培养基中生根。

实施例2：中国甘薯品种为济徐23

步骤如实施例1所述，所不同的是：

1.从甘薯(济徐23)的试管苗上取1.0mm甘薯茎尖；将甘薯茎尖移入到3％(克/ml)海藻酸钠和0.2M甘油的无钙离子的MS溶液中，室温浸泡10秒；

2.将含有11.1g/l CaCl₂、2M甘油、0.2M蔗糖的MS溶液在冰块中预冷20分钟，将步骤1的甘薯茎尖连同浸泡溶液一起加入其中，形成直径为0.6-0.8cm甘薯茎尖小球；将甘薯茎尖小球依次移入以下预培养基中进行预培养：

将小球移入盛有50ml预培养基I溶液的三角瓶中，预培养基I溶液配方为：MS+30g/l蔗糖+1g/l酪蛋白氨基酸，摇床培养24小时，28℃，60rpm；

将小球移入盛有50ml预培养基II溶液的三角瓶中，预培养基II溶液配方为：MS+0.3M蔗糖，摇床培养15-16小时，28℃，60rpm；

将小球移入盛有50ml预培养基III溶液的三角瓶中，预培养基III溶液配方为：MS+1.6M蔗糖+2M甘油，摇床培养3小时，28℃，60rpm。

制得预培养好的小球。

3.将上述预培养好的小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中，25℃培养120min，PVS玻璃化溶液组成为：MS+30％(克/ml)甘油+15％(克/ml)乙二醇+15％(克/ml)二甲基亚砜(DMSO)+0.4M蔗糖，pH 5.8。

4.同实施例1中步骤4。

5.同实施例1中步骤5。

6.将小球移入盛有25ml成活培养基的培养皿中，成活培养基配方为：MS+0.5mg/l6-苄氨基嘌呤+1mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂，pH5.8，28℃黑暗培养3天；然后在28℃培养7天，并保持每天16小时的3000lux光照培养和每天8小时的黑暗培养。得成活小球。

7.将成活小球移入盛有25ml再生培养基的培养皿中，在28℃培养并保持每天16小时的3000lux光照，培养成苗。每隔三周，将小球转移到新鲜的盛有再生培养基的培养皿中。所述再生培养基配方为：MS+2.5mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂，pH 5.8。

待苗长达0.5cm时，转入MS固体培养基中生根。

实施例1-2的实验结果如下：

注：现有技术A为D.Hira，A.Sakai，Simplified cryopreservation of sweet potato[Ipomoea batatas (L.)Lam.]by optimizing conditions for osmoprotection，Plant Cell Reports，(2003)21：961-966。