粗叶悬钩子总生物碱的新用途

摘要

本发明提供了粗叶悬钩子总生物碱在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途。本发明还提供了一种治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物。本发明粗叶悬钩子总生物碱是从中药材粗叶悬钩子根部提取的有效成分，对高脂饮食动物模型中肝细胞脂肪变性及肝内脂类聚集有明显的改善或逆转效果，并能降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量，升高高密度脂蛋白胆固醇含量，表明粗叶悬钩子总生物碱对非酒精性脂肪肝有较好的治疗作用，尤其针对单纯性脂肪肝的药效较佳，为临床提供了一种新的用药选择。

说明书

技术领域

本发明涉及粗叶悬钩子总生物碱的新用途，具体地，是在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途，属于药物领域。

背景技术

粗叶悬钩子(Rubus alceaefolius Poir.，RAP)，为蔷薇科植物粗叶悬钩子的根、叶，又名大叶蛇泡竻、大破布刺、老虎泡、虎掌竻、九月泡等，药用资源丰富，主要分布于我国江苏、江西、福建、台湾、湖南、广东、广西、贵州、云南等地，生于海拔500～2000m的向阳山坡、山谷杂木林内或沼泽灌丛中以及路旁岩石间，其根、叶入药，味甘淡性平，具有活血祛瘀，清热止血等功效，主治慢性肝炎，痢疾，肠炎，乳腺炎，口腔炎，行军性血红蛋白尿，外伤出血，肝脾肿大，跌打损伤，风湿骨痛等。

文献报道粗叶悬钩子中主要含有三萜、黄酮、鞣质、甾醇、生物碱、氨基酸等成分。陈旺，等，粗叶悬钩子化学成分及要离作用研究进展，《亚太传统医药》，2009年4卷7期，报道从粗叶悬钩子的叶中分离得到的三萜类成分，分别为2α，3β-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸、2α，3β，19α-三羟基-乌苏-2-烯-28-酸、2α，3β，19α，23-四羟基-乌苏-12-烯-28-酸-28-O-β-D-葡萄糖苷、2α，3β，19α，23，24-五羟基-齐墩果-12-烯-18-酸-28-O-β-D-葡萄糖苷和2α，3β，19α-三羟基-乌苏-12-烯-23，28-二酸-28-O-β-D-葡萄糖苷；从叶中分离的2个黄酮类成分，分别为3，5，7，3^/，4^/-五羟基黄酮-3-O-[(2-O-α-L-鼠李糖基)]-(6-O-α-L-鼠李糖基)-β-D-半乳糖苷以及金丝桃苷。从粗叶悬钩子中分离的3个鞣质类成分，分别为sanguiin H-2ethyl ester、1，2，3，6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopy-ranose、1，2，3，4，6-penta-O-gal loyl-β-D-glucopy-ranose。对粗叶悬钩子活性成分的报道，如：叶蕻芝，等，粗叶悬钩子对实验性肝损伤的治疗作用研究，《中医药学刊》，2005年23卷5期，以CCl₄建立大鼠急性肝损伤模型，考察粗叶悬钩子水煎液对实验性肝损伤的治疗作用，结果表明，粗叶悬钩子水煎液能降低CCl₄所致小鼠血清中异常增高的ALT、AST及肝组织中异常增高的MDA、NO的含量，同时升高SOD含量，且能改善肝脏病理损伤。黄玲，等，粗叶悬钩子根部提取物对急性肝损伤大鼠血清NO和肝组织SOD、MDA的影响，《中国中医药科技》，2008年15卷1期，通过以CCl₄建立大鼠急性肝损伤模型，考察粗叶悬钩子根部总生物碱、总多糖、总黄酮对急性肝损伤的治疗作用。结果表明，粗叶悬钩子根部总生物碱能明显降低大鼠血清中异常增高的NO及肝组织中MDA含量(P＜0.01)，提高肝组织中SOD活性，减轻大鼠肝细胞坏死程度。总多糖、总黄酮对大鼠血清NO及肝组织中SOD、MDA有一定影响，但没有统计学意义。洪振丰，等，粗叶悬钩子根部提取物对急性肝损伤大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的影响，《中华中医药学刊》，2007年27卷6期，通过以CCl₄建立大鼠急性肝损伤模型，考察粗叶悬钩子根部总生物碱、总多糖、总黄酮对急性肝损伤的治疗作用；结果表明，粗叶悬钩子根部总多糖能明显降低大鼠血清中异常增高的含量TNF-α、IL-1β、IL-6(P＜0.01)减轻大鼠肝细胞坏死程度，总生物碱、总黄酮对大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量有一定影响但没有统计学意义。

目前报道的文献均是粗叶悬钩子根部总生物碱治疗肝损伤，急性肝损伤是受化学物质急性损伤产生的肝小叶结构破坏，肝细胞普遍浊肿，出现以中央静脉为中心的局灶性肝细胞变性、坏死和炎细胞浸润为特征的炎症表现。

非酒精性脂肪肝的发病原因是在长期高脂高糖饮食条件下造成过多的脂肪酸在肝细胞内沉积，从而造成肝细胞脂肪变性，当肝内脂质超过肝脏湿重的5％即定义为脂肪肝。其病理学改变与酒精性肝病相似，但患者无过量饮酒史，致病因素主要是由高脂肪高热量膳食结构、多坐少动的生活方式、IR、代谢综合征及其组分(肥胖、高血压、血脂紊乱和2型糖尿病)；其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌。病理切片上出现程度不同的弥漫性肝细胞脂肪变性，脂变肝细胞极度肿胀，成圆形，体积较正常组明显增加，胞浆内充满大量脂肪空泡，细胞界限不清，脂肪变及气球样变性，脂肪肝大鼠所有标本小叶内均可见炎症细胞浸润或散在的点状或融合坏死。其中，单纯性脂肪肝的肝小叶中存在肝细胞脂肪变性和脂肪贮积，轻度单纯性脂肪肝时占小叶的1/3-1/2，中度时占小叶的1/2-2/3，重度时占小叶的2/3以上或者肝细胞弥漫性脂肪变性呈鱼网状，但无其他明显组织学改变，即无炎症、坏死和纤维化。

因此肝损伤和非酒精性脂肪肝有本质的区别，具有治疗肝损伤的药物并不是一定具有治疗非酒精性脂肪肝的作用。目前，没有文献报道将粗叶悬钩子总生物碱用于治疗非酒精性脂肪肝。

发明内容

本发明的目的是提供粗叶悬钩子总生物碱的新用途，即在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途。本发明的另一目的是提供了一种治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物。

本发明提供了粗叶悬钩子总生物碱在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途。

进一步优选地，所述的药物是治疗单纯性脂肪肝的药物。

其中，所述的粗叶悬钩子总生物碱中含有总生物碱以盐酸小檗碱计，大于95％w/w。

其中，所述的粗叶悬钩子总生物碱来源于蔷薇科植物粗叶悬钩子Rubusalceaefolius Poir.根部提取物。

其中，所述的提取物是70-95％乙醇提取物。

其中，所述的提取物是85％乙醇提取物。

本发明还提供了一种治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物，它是由有效量的粗叶悬钩子总生物碱为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

其中，所述的制剂是口服制剂。

本发明粗叶悬钩子总生物碱是从中药材粗叶悬钩子根部提取的有效成分，对高脂饮食动物模型中肝细胞脂肪变性及肝内脂类聚集有明显的改善或逆转效果，并能降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量，升高高密度脂蛋白胆固醇含量，表明粗叶悬钩子总生物碱对非酒精性脂肪肝有较好的治疗作用，尤其针对单纯性脂肪肝的药效较佳，为临床提供了一种新的用药选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：正常组HE染色肝组织(左叶)病理切片光镜视图，放大倍数为40×。

图2-3：脂肪肝模型组HE染色肝组织(左叶)病理切片光镜视图，放大倍数依次为40×、100×。

图4-5：PPC对照组HE染色肝组织(左叶)病理切片光镜视图，放大倍数依次为40×、100×。

图6-7：TARAP低剂量组HE染色肝组织(左叶)病理切片光镜视图，放大倍数依次为40×、100×。

图8-9：TARAP中剂量组HE染色肝组织(左叶)病理切片光镜视图，放大倍数依次为40×、100×。

图10-11：TARAP高剂量组HE染色肝组织(左叶)病理切片光镜视图，放大倍数依次为40×、100×。

图12-17：各组脂肪染色冰冻肝组织(左叶)病理切片，放大倍数40×，依次为正常组、模型组、PPC对照组、TARAP低剂量、TARAP中剂量组、TARAP高剂量组。

具体实施方式

实施例1本发明粗叶悬钩子总生物碱的制备

称取200g粗叶悬钩子置于2000ml圆底烧瓶中，加入1200ml85％乙醇溶液(固液比1∶6)置于电子恒温电热套中80℃回流3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇，得浓缩液，干燥，即得粗叶悬钩子总生物碱。

粗叶悬钩子总生物碱的质量标准为以盐酸小檗碱为对照，采用酸性染料比色法，在415nm波长下测定，粗叶悬钩子总生物碱中含有总生物碱以盐酸小檗碱计，大于95％w/w。

除了采用上述方法提取外，还可采用目前文献报道的方法提取，如：洪振丰，等，粗叶悬钩子根部总生物碱的含量测定，《福建中医学院学报》，2008年18卷5期。

实施例2本发明药物片剂的制备

取实施例1制备的粗叶悬钩子总生物碱，加入片剂用辅料，制粒、压片，即得片剂。

以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

实验例1本发明药物粗叶悬钩子总生物碱治疗非酒精性脂肪肝实验

1)动物分组、造模与给药

随机将60只SD大鼠分为6组，每组10只，每组均雌雄各半，即分为正常组、脂肪肝模型组、易善复即多烯磷脂酰胆碱(polyene phosphatidylcholine，PPC)对照组和粗叶悬钩子总生物碱(TARAP)高、中、低剂量3个治疗组。另2只大鼠并入模型组，做为抽样检查造模效果用。

除正常组外，其余各组大鼠均以高脂饲料代替基础饲料喂养12周。高脂饲料配比：基础饲料87.3％，猪油10％，胆固醇2％，猪胆盐0.7％。于造模第10周随机取模型组雌、雄大鼠各1只，观察造模效果。

造模成功后第10周开始给药。在继续造模的同时(防止动物自愈)，正常组、脂肪肝模型组予以0.9％氯化钠注射液，PPC对照组以给药76mg/kg·d，生物碱高、中、低给药分别为：2.6g/kg·d、1.3g/kg·d和0.65g/kg·d(由实施例1方法制备)。均以溶剂灌胃方式给药，给药量为2ml/250g。以上均于上午9-11点执行，每日1次，连续14日。

2)观察指标及检测项目

肝组织HE染色病理切片检查

(1)于肝左叶切取1cm×1cm×1cm组织块，10％甲醛溶液内保存固定24小时。

(2)取出肝组织块，进行梯度酒精脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋。

(3)组织蜡片用轮转式切片机横断面连续切片，厚度为4μm，捞片、烤箱烘干。

(4)组织切片以100％二甲苯脱蜡10min×2次，无水乙醇，95％、80％梯度酒精依次浸泡5min×1次。

(5)组织切片依次分别经1％苏木素浸泡15min、水浸洗返蓝15min、5％盐酸分色5sec及1％伊红染色30sec，经水冲洗后烘干，树脂封片。

(6)脂肪肝病理分级参考范建高等的病理诊断标准。光镜下，以“-”、“+”、“++”和“+++”作为脂肪肝变性的四个等级，以分别对应临床上的“正常”、“轻度脂肪肝”、“中度脂肪肝”和“重度脂肪肝”。肝细胞结构正常或偶见脂肪空泡为“-”级；肝小叶内1/3肝细胞脂肪变性，累及肝小叶数量＜50％为“+”级；肝小叶内2/3肝细胞脂肪变性，累及肝小叶数量＜50％，或肝小叶内1/3肝细胞脂肪变性，累及肝小叶数量＞50％为“++”级；肝小叶内＞2/3肝细胞脂肪变性，累及肝小叶数量＞50％为“+++”级。

肝组织冰冻切片脂肪染色及图像定量分析

(1)肝组织切取大小约1cm×1cm×1cm，以10％甲醛固定，保存于-20℃冰箱以制作冰冻切片。

(2)-20℃下行冰冻切片，切片厚度为8μm，以沾有火棉胶的玻片粘片。

(3)将切片放入70％乙醇洗1min，后滴苏丹IV进行染色1～2min，再用70％乙醇稍洗，流水再洗，后以苏木素复染，流水冲洗至返蓝，中性甘油封片。

(4)形态定量的测试样本，从60例标本每组随机选出5例，在镜下任选2个肝小叶间视野拍5张，不重复，每组照片有肝小叶视野5×5×2＝50个。每张均放大40倍。

(5)以麦克奥迪Motic Med.6.0计算机软件测量阳性面积、灰度、平均光密度和积分光密度。

(6)采用SPSS16.0进行数据的统计计算。

血清TG、TC、HDL-C及LDL-C的测定

大鼠麻醉成功后，经下腹正中切口进腹，腹主动脉采血，取全血约6ml，经低速1500rpm离心10min后取上清液于-20℃保存，分别测定血清TG、TC、HDL-C及LDL-C。采用SPSS 16.0进行数据的统计计算。

3)结果

HE染色肝组织(左叶)病理切片结果

表1病理切片分析比较

图像定量分析结果表2结果表明，在阳性面积、灰度、平均光密度及积分光密度4个指标中，TARAP高剂量组相较模型组均有显著改善，改善水平均好于PPC对照组，且随着TARAP剂量的升高，肝组织细胞受累的范围和程度均有所改善。各组脂肪染色冰冻肝组织(左叶)病理切片光镜图像见图12-17。

表2阳性面积、灰度、平均光密度、积分光密度在各组间脂肪染色图像定量分析比较

*为与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)

血清TG、TC、HDL-C及LDL-C测定结果表3、表4结果表明，PPC能显著提高脂肪肝大鼠血HDL-C浓度(P＜0.05)，但对TC、TG以及LDL-C的影响无统计学意义(P＞0.05)。与TARAP各剂量组相比较，虽无统计学意义上的显著差异，PPC对血清HDL-C水平的升高作用接近中、高剂量组水平，好于低剂量组；而降血清LDL-C的作用则逊于TARAP中、高剂量组。

表3血清TC、TG分析比较

表4血清HDL-C、LDL-C分析比较

*为与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)

上述实验结果表明，本发明粗叶悬钩子总生物碱是从中药材粗叶悬钩子根部提取的有效成分，对高脂饮食动物模型中肝细胞脂肪变性及肝内脂类聚集有明显的改善或逆转效果，并能降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量，升高高密度脂蛋白胆固醇含量，表明粗叶悬钩子总生物碱对非酒精性脂肪肝有较好的治疗作用，尤其针对单纯性脂肪肝的药效较佳。