多孔硅胶硅表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物及其制备和应用

摘要

本发明涉及一种多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物，其是在惰性溶剂中，在交联剂作用下，以熊去氧胆酸为模板分子，以丙烯酰胺为功能单体，在表面修饰有偶联剂的功能化多孔硅胶颗粒和引发剂存在下或者在表面通过偶联剂接枝有引发剂的功能化多孔硅胶颗粒存在下发生聚合反应得到聚合物后去除聚合物中的熊去氧胆酸而得，还涉及制备方法，包括溶液中引发聚合方法和硅胶表面引发聚合方法，还涉及相关应用，本发明的多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物对熊去氧胆酸具备高吸附容量、高选择吸附性能以及优良的稳定性，能从胆汁酸类相似物中有效分离熊去氧胆酸，对熊去氧胆酸规模性生产产生指导性作用，且制备方法简单方便，适于大规模推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及分子印迹聚合物技术领域，特别涉及熊去氧胆酸分子印迹聚合物技术领域，具体是一种多孔硅胶硅表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物及其制备和应用，适用于分离纯化熊去氧胆酸。

背景技术

熊去氧胆酸(3α，7β-Dihydroxy-5β-cholan-24-oicacid，Ursodeoxycholic Acid，UDCA)，其结构式如式(1)所示，是一种亲水胆酸，存在于正常人胆汁中，约占人体总胆酸的3％。具有松弛胆总管括约肌，促进肝脏糖原蓄积，保肝解毒的功能，应用于原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎的治疗，是FDA批准治疗原发性胆汁性肝硬化的唯一药物。

目前为止，UDCA获取与制备方法主要有以下三个方式：熊胆汁中提取或活体引流方法，化学合成方法以及微生物转化方法。活体提取受季节、性别、饲养、胆囊大小、取胆方式等影响，来源有限，而且有违于动物保护。化学合成方法面临着原料来源有限，步骤多，分离困难，收率低的问题，而微生物转化的主要问题是筛选出来的菌株转化能力不稳定，转化菌的培养条件难以适应大生产的要求，同时也存在与化学合成法同样的问题，即转化产物成分复杂，分离困难，转化率低。如何从产物中有效分离UDCA也成为UDCA实现工业化生产的制约性工作。对于结构类似的各类胆汁酸类化合物，通过传统分离手段并不能满意奏效，寻求经济有效且效果明显的UDCA分离纯化方法具有重要的现实意义。

分子印迹技术(MIT)是一种制备空间结构和结合位点与模板分子完全匹配的聚合物的实验技术，而分子印迹聚合物(MIP)是一种具有分子识别能力的聚合物材料，它具有许多固定形状和大小的孔穴，孔穴内通常带有确定排列的结合位点，对印迹分子的立体结构具有记忆和识别功能，是一种具有较强分子识别能力的新型高分子仿生材料，具有类抗体的特异性以及高选择性。与其它分子识别材料相比，分子印迹聚合物具有设计性强、制作简单、成本低廉、适应范围广、坚固耐用且可以循环使用等优点，基于分子印迹的分子识别新型材料在手性分离、环境分析和催化科学等领域中的潜在应用价值引起了许多学者的关注，成为国内外研究的热点。

分子印迹技术发展至今，已有沉淀聚合、悬浮聚合、种子聚合、表面聚合、全氟化物悬浮聚合等多种制备方法。其中，表面分子印迹技术是指在无机、有机或毛细管载体表面接枝并引进分子印迹的技术。相比传统的本体分子印迹聚合物，表面分子印迹技术可控制MIP的形状和大小，提高MIP的机械强度和耐用性，并且更好地应用于色谱分析和分离。此外，由于印迹只发生在载体表面，减少了模板分子的“包埋”现象，利于模板分子的洗脱和识别，提高了模板分子的利用率。近年来，随着对表面材料的拓展与修饰，以及印迹技术的不断创新，表面分子印迹技术一直是分子印迹领域较为活跃的分支，应用广泛分布于手性分离、固相萃取、富集、检测、酶模拟以及化学仿生传感器等领域。

由于活化硅胶表面含有丰富的羟基基团，可对其进行功能化修饰，进而合成分子印迹聚合物。国内外许多研究小组都在硅胶表面分子印迹聚合领域做出很大贡献，研究了不少聚合物制备方式，如功能单体接枝于硅胶表面、引发剂接枝于表面以及将聚合物接枝于硅胶表面等等。

因此，期望制备多孔硅胶硅表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物，对熊去氧胆酸具备高吸附容量、高选择吸附性能以及优良的稳定性，从而可以分离纯化熊去氧胆酸。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种多孔硅胶硅表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物及其制备和应用，该多孔硅胶硅表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物对熊去氧胆酸具备高吸附容量、高选择吸附性能以及优良的稳定性，能从胆汁酸类相似物中有效分离熊去氧胆酸，对熊去氧胆酸规模性生产产生指导性作用，且制备方法简单方便，适于大规模推广应用。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物，其特点是，所述多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物是在惰性溶剂中，在交联剂作用下，以熊去氧胆酸为模板分子，以丙烯酰胺为功能单体，在表面修饰有偶联剂的功能化多孔硅胶颗粒和引发剂存在下或者在表面通过偶联剂接枝有引发剂的功能化多孔硅胶颗粒存在下发生聚合反应得到聚合物后去除所述聚合物中的所述熊去氧胆酸而得。

本发明所说的载体多孔硅胶是一种良好的干燥剂、吸附剂和催化剂载体，具有化学性质稳定、比表面积大、吸附性能高、热稳定性好、机械强度高等优点，成为优良的表面分子印迹载体。

较佳地，所述多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物具体通过以下过程制备而成：所述模板分子和所述功能单体首先在所述惰性溶剂中形成稳定的单体-模板复合物，然后加入所述交联剂，并加入所述的表面修饰有偶联剂的功能化多孔硅胶颗粒和所述引发剂，或者加入所述的表面通过偶联剂接枝有引发剂的功能化多孔硅胶颗粒，在惰性气体保护下密封环境中进行聚合反应后获得所述聚合物，之后洗脱去除所述聚合物中的所述模板分子。

更佳地，所述惰性溶剂是丙酮，所述交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，所述的表面修饰有偶联剂的功能化多孔硅胶颗粒修饰的偶联剂是3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(PMA)，所述引发剂是4，4’-偶氮-(4-氰基戊酸)(ACVA)，所述的表面通过偶联剂接枝有引发剂的功能化多孔硅胶颗粒修饰的偶联剂是γ-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPS)。

更佳地，所述多孔硅胶颗粒为80～100目，孔径为8～12nm，所述模板分子、所述功能单体和所述交联剂的摩尔比为1∶4∶15，所述惰性气体是氮气，所述聚合反应在50-80℃振荡条件下进行。

其中，熊去氧胆酸(UDCA)如下式(1)所示，其结构类似物鹅去氧胆酸(UDCA)如下式(2)所示，可以作为竞争性吸附物，丙烯酰胺如下式(3)所示，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)如下式(4)所示，引发剂4，4’-偶氮-(4-氰基戊酸)(ACVA)如下式(5)所示。

(3)                 (4)                      (5)

在本发明的第二方面，提供了一种上述的多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物的制备方法，其特点是，包括如下步骤：

(1)将偶联剂接枝到活化的多孔硅胶颗粒的表面获得所述的表面修饰有偶联剂的功能化多孔硅胶颗粒；

(2)在所述惰性溶剂中加入所述模板分子和所述功能单体，超声振荡后室温静置，形成稳定的单体-模板复合物，再加入所述交联剂、所述的表面修饰有偶联剂的功能化多孔硅胶颗粒和所述引发剂，通入惰性气体以除去氧气，密封环境中进行聚合反应获得所述聚合物；

(3)去除所述聚合物中的所述模板分子。

较佳地，所述惰性溶剂是丙酮，所述交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯，所述的表面修饰有偶联剂的功能化多孔硅胶颗粒修饰的偶联剂是3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，所述引发剂是4，4’-偶氮-(4-氰基戊酸)。偶联剂3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷上的乙烯基团用于聚合时打开并交联加长。在本发明的一具体实施例中，偶联剂3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷在硅胶表面的接枝率为26.42％(w/w)。

较佳地，所述的表面修饰有偶联剂的功能化多孔硅胶颗粒的具体制备过程如下：以甲苯为溶剂，以三乙胺为催化剂，加入所述偶联剂与所述的活化的多孔硅胶颗粒，在惰性气体存在下进行反应得到所述的表面修饰有偶联剂的功能化多孔硅胶颗粒。

因此，上述制备方法是在溶液中引发聚合：首先多孔硅胶颗粒进行活化；其次在活化的多孔硅胶颗粒表面接枝3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(PMA)，该物质上的乙烯基团用于聚合时打开并交联加长；按比例称取模板分子和功能单体于具塞三角瓶中，加入惰性溶剂丙酮，超声振荡30min，室温静置6h，形成稳定的单体-模板复合物。继续加入交联剂EGDMA和上述的表面修饰硅胶，并在溶剂中加入10mg引发剂ACVA，通N₂ 10min以除去O₂，密封，一定温度和摇床条件下反应24h；最后用丙酮洗涤制备的印迹聚合物数次除去漂浮的自聚物，然后以体积比9∶1的甲醇/乙酸混合溶剂索氏洗提48h，最后用甲醇洗涤印迹硅胶数次除去残留的乙酸，干燥。

在本发明的第三方面，提供了一种上述的多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物的制备方法，其特点是，包括如下步骤：

(1)将偶联剂接枝到活化的多孔硅胶颗粒的表面，再将引发剂与偶联剂连接，获得所述的表面通过偶联剂接枝有引发剂的功能化多孔硅胶颗粒；

(2)在惰性溶剂中加入所述模板分子和所述功能单体，超声振荡后室温静置，形成稳定的单体-模板复合物，再加入所述交联剂和所述的表面通过偶联剂接枝有引发剂的功能化多孔硅胶颗粒，通入惰性气体以除去氧气，密封环境中进行聚合反应获得所述聚合物；

(3)去除所述聚合物中的所述熊去氧胆酸。

较佳地，所述惰性溶剂是丙酮，所述交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯，所述的表面通过偶联剂接枝有引发剂的功能化多孔硅胶颗粒修饰的偶联剂是γ-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷，所述引发剂是4，4’-偶氮-(4-氰基戊酸)。通过偶联剂γ-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷上的环氧基团与引发剂ACVA的羧基发生反应而使引发剂接枝于硅胶表面。在本发明的一具体实施例中，偶联剂γ-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷在硅胶表面的接枝率为19.93％(w/w)。

较佳地，所述的表面通过偶联剂接枝有引发剂的功能化多孔硅胶颗粒的具体制备过程如下：以甲苯为溶剂，以三乙胺为催化剂，加入所述偶联剂与所述的活化的多孔硅胶颗粒，在惰性气体存在下进行反应得到修饰硅胶，所述修饰硅胶和所述引发剂在吡啶存在下在惰性气体保护下密封环境中反应得到所述的表面通过偶联剂接枝有引发剂的功能化多孔硅胶颗粒。

因此，上述制备方法是在多孔硅胶颗粒表面引发聚合：首先多孔硅胶颗粒进行活化；其次在活化的多孔硅胶颗粒表面接枝γ-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPS)；接着，通过GPS上的环氧基团与引发剂ACVA的羧基发生反应而使引发剂接枝于多孔硅胶颗粒的表面；按比例称取模板分子和功能单体于100ml具塞三角瓶中，加入溶剂丙酮，超声振荡30min，室温静置6h，形成稳定的单体-模板复合物。继续加入交联剂EGDMA和上述的表面修饰硅胶，通N₂10min以除去O₂，密封，一定温度和摇床条件下反应24h；最后用丙酮洗涤制备的印迹聚合物数次除去漂浮的自聚物，然后以体积比9∶1的甲醇/乙酸混合溶剂索氏洗提48h，最后用甲醇洗涤印迹硅胶数次除去残留的乙酸，干燥。

在本发明的第四方面，提供了上述的多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物或上述的制备方法制备的多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物在分离熊去氧胆酸中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明以多孔硅胶颗粒为载体，对其进行功能化修饰后，选择能与模板分子发生特异性结合的功能单体在惰性溶剂中形成模板-单体复合物，通过溶液或硅胶表面两种方式引发自由基聚合，将模板分子印迹于多孔硅胶颗粒表面，洗去模板分子后，制备得到两种特异性吸附熊去氧胆酸的表面分子印迹聚合物，对熊去氧胆酸的最大吸附量分别为24.35mg/g和5.57mg/g，平均分离因子α分别为2.28和1.22，溶液中引发聚合法比硅胶表面引发聚合法具有优势。以结构类似物鹅去氧胆酸为竞争性吸附物，测得溶液引发聚合法制备的分子印迹聚合物对熊去氧胆酸的选择性因子β为1.65，印迹聚合物对模板分子表现出很好的特异性识别能力，高吸附容量以及优良的稳定性，能从胆汁酸类相似物中有效分离熊去氧胆酸，对熊去氧胆酸规模性生产产生指导性作用，且制备方法简单方便，适于大规模推广应用。

附图说明

图1a是溶液中引发聚合方法的多孔硅胶表面修饰方法。

图1b是硅胶表面引发聚合方法的多孔硅胶表面修饰方法。

图2是印迹聚合过程示意图。

图3是印迹聚合物的扫描电镜图，其中左上图、左下图、右上图和右下图分别表示活化硅胶、硅烷化硅胶、溶液中引发聚合制备的聚合物以及硅胶表面引发聚合制备的聚合物。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1溶液中引发聚合反应制备多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物

(1)硅胶的活化

称取50g左右的粗孔微球硅胶(80-100目)加入至500ml圆底烧瓶中，加入体积比为1∶1的硝酸水溶液200ml浸泡24h，或于加热套上冷凝回流8h，以增加硅胶表面羟基数量。静置过夜，用砂芯漏斗抽滤除去酸液，再用去离子水洗至pH中性，然后再用甲醇洗涤硅胶，去除硅胶中的有机杂质，再将硅胶收集于60℃真空干燥箱内烘干，最后将烘干的硅胶置于红外电热烘箱中，于110℃活化12h，去除硅胶表面的物理水。活化硅胶的扫描电镜图如图3中左上图所示。

(2)硅胶表面功能化修饰

称取12g活化后的硅胶，加至250mL具塞三角烧瓶中，加入100ml甲苯，20mmol(4.75ml)3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(PMA)和1ml三乙胺，于超声波清洗仪中超声振荡5min，使溶液体系充分混合，并且使硅胶充分分散于溶液中。将体系通氮气10min后密封，置于80℃水浴摇床中，280rpm转速下反应24h。反应过程如图1a所示。反应结束后用砂芯漏斗抽滤除去反应溶液，依次用甲苯、乙醚、丙酮、甲醇洗涤数次除去残留试剂，然后将硅胶置于60℃真空干燥箱中干燥24h。硅烷化硅胶的扫描电镜图如图3中左下图所示。

(3)印迹聚合反应

按摩尔比例1∶4(0.5mmol∶2mmol)称取烘干后的模板分子UDCA和功能单体丙烯酰胺于100ml具塞三角瓶中，加入40ml溶剂丙酮，超声振荡30min，室温静置6h，形成稳定的单体-模板复合物。继续加入1.41ml(7.5mmol)EGDMA和2g表面修饰硅胶，并在溶剂中加入10mg引发剂ACVA。通N₂ 10min以除去O₂，密封，置于50℃摇床，反应6h，转速160rpm；再于60℃摇床反应12h，转速180rpm；最后80℃摇床反应6h，转速200rpm。印迹聚合过程如图2所示。作为对照的非印迹硅胶制备方法同上，不加UDCA标准品。

(4)模板分子的去除和后处理

聚合得到的印迹聚合物用丙酮洗涤数次除去漂浮的自聚物，然后以体积比9∶1的甲醇/乙酸混合溶剂索氏洗提，每12h更换一次溶剂，以除去印迹聚合物中的模板分子，最终检测洗脱液中是否残存有模板分子，如检测不出浓度，则认为印迹聚合物中模板分子已基本洗去，最后用甲醇洗涤印迹硅胶数次除去残留的乙酸，干燥，筛分。得到的印迹聚合物的扫描电镜图如图3中右上图所示。

实施例2硅胶表面引发聚合反应制备多孔硅胶表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物

(1)硅胶的活化：同实施例1(1)。

(2)硅胶表面功能化修饰

称取12g活化后的硅胶，加至250mL具塞三角烧瓶中，加入100ml甲苯、20mmol γ-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPS)和1ml三乙胺，于超声波清洗仪中超声振荡5min，使溶液体系充分混合，并且使硅胶充分分散于溶液中。将体系通氮气10min后密封，置于80℃水浴摇床中，280rpm转速下反应24h。反应结束后用砂芯漏斗抽滤除去反应溶液，依次用用甲苯、乙醚、丙酮洗涤数次除去残留试剂，然后将硅胶置于60℃真空干燥箱中干燥24h，置于干燥器中备用。硅烷化硅胶的扫描电镜图如图3中左下图所示。

(3)引发剂接枝于硅胶表面

取12g表面修饰后的硅胶，加至250ml具塞三角瓶中，加入100ml DMSO，1g ACVA，1ml吡啶，通N₂ 10min后密封，60℃水浴摇床中反应6h；甲醇洗涤数次，常温真空干燥，得到接枝引发剂硅胶，阴冷避光保存。上述步骤(2)和(3)的反应过程如图1b所示。

(4)印迹聚合反应：无需在溶剂中加引发剂，其他同实施例1(3)。

(5)印迹分子的去除和后处理：同实施例1(4)。得到的印迹聚合物的扫描电镜图如图3中右下图所示。

实施例3吸附动力学试验

配制浓度为1mg/ml的UDCA丙酮溶液。分别称取0.5g实施例1和实施例2制备的印迹聚合物置于100ml具塞锥形瓶中，分别加入40ml配好的UDCA丙酮溶液，室温下置于150rpm气浴摇床中振荡吸附，定时取上清液测定UDCA浓度，计算不同时刻下印迹聚合物对模板分子的吸附量。本发明制备的印迹聚合物，在吸附12h后能够达到吸附平衡。

实施例4吸附等温线实例

各取不同浓度的UDCA丙酮溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/ml)6ml于具塞试管中，分别加入50mg洗脱后的印迹和非印迹聚合物，封口，置于摇床上振荡吸附，12h后取样检测各管剩余UDCA浓度。计算不同平衡浓度下对模板分子的吸附量，以吸附量对平衡浓度作曲线，绘制对模板分子的等温吸附曲线。引入分离因子α评价印迹聚合物对模板分子的特异性吸附效果。选用溶液中引发聚合和硅胶表面引发聚合两种方法分别制备分子印迹聚合物，两种方法对熊去氧胆酸的最大吸附量分别为24.35mg/g和5.57mg/g，平均分离因子α分别为2.28和1.22，溶液中引发聚合法比硅胶表面引发聚合法具有优势。

实施例5竞争性吸附实例

取质量浓度比为1∶1的UDCA/CDCA混合丙酮溶液(两种物质浓度分别为1.0mg/ml)30ml于具塞试管中，分别加入0.5g洗脱后的印迹和非印迹聚合物，封口，置于摇床上振荡吸附，12h后取样检测各管剩余UDCA和CDCA浓度。计算不同平衡浓度下印迹和非印迹聚合物对模板分子及其结构类似物的吸附量，以吸附量对平衡浓度作曲线，绘制竞争性吸附图。引入选择因子β评价印迹聚合物对模板及其结构类似物的竞争性吸附效果。溶液中引发聚合法制备的分子印迹聚合物对熊去氧胆酸的选择性因子β为1.65，较硅胶表面引发聚合法制备的分子印迹聚合物选择性高，显示了该印迹聚合物对模板分子表现出很好的特异性识别能力，

通过上述描述，本发明以熊去氧胆酸(UDCA)为模板分子，以粗孔硅胶为载体，分别以溶液中引发聚合和硅胶表面引发聚合方式制备表面分子印迹聚合物。以丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，4，4’-偶氮-(4-氰基戊酸)(ACVA)为引发剂，模板分子、功能单体和交联剂的最佳摩尔比例为1∶4∶15，聚合溶剂为丙酮。静态吸附实验结果表明，选用溶液中引发聚合和硅胶表面引发聚合两种方法分别制备分子印迹聚合物，两种方法对熊去氧胆酸的最大吸附量分别为24.35mg/g和5.57mg/g，平均分离因子α分别为2.28和1.22，溶液中引发聚合法比硅胶表面引发聚合法具有优势。以结构类似物鹅去氧胆酸(UDCA)为竞争性吸附物，测得溶液引发聚合法制备的分子印迹聚合物对熊去氧胆酸的选择性因子β为1.65，印迹聚合物对模板分子表现出很好的特异性识别能力。本发明涉及的表面分子印迹聚合物具有制备方法简单、选择性佳、可重复利用等优点。

综上，本发明的多孔硅胶硅表面熊去氧胆酸分子印迹聚合物对熊去氧胆酸具备高吸附容量、高选择吸附性能以及优良的稳定性，能从胆汁酸类相似物中有效分离熊去氧胆酸，对熊去氧胆酸规模性生产产生指导性作用，且制备方法简单方便，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。