3.4kb线粒体DNA缺失用于检测癌症

摘要

本发明描述了通过定量测试样品中线粒体DNA(mtDNA)中的3.4kb缺失来检测前列腺癌或乳腺癌的方法。所述缺失位于线粒体基因组的10744～14124位核苷酸之间。与非癌性前列腺和乳腺组织中所述缺失的量相比，该缺失之量的增加分别指示前列腺癌和乳腺癌。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请是2006年4月18日提交的PCT申请No.PCT/CA2006/000652的部分继续申请，要求美国临时申请No.60/672,016(2005年4月18日提交)、60/721,522(2005年9月29日提交)和60/789,872(2006年4月7日提交)的优先权。这些申请的全部公开内容均通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及线粒体基因组领域。特别地，其涉及线粒体基因组中3.4kb缺失及其作为癌症指示物的应用。

背景技术

作为诊断工具的线粒体DNA(mtDNA)

mtDNA序列动力学是重要的诊断工具。mtDNA中的突变常常是发生疾病的初步指示物，常与细胞核突变相关，并用作生物标志物，其特别地涉及：疾病，例如但不限于吸烟以及暴露于二手烟导致的组织损伤和癌症(Lee等，1998；Wei，1998)；寿命，基于20岁左右开始的并在其后增加的线粒体基因组突变的累积(von Wurmb，1998)；由突变或暴露于致癌物、诱变剂、紫外线辐射导致的转移性疾病(Birch-Machin，2000)；骨关节炎；心血管病、阿尔茨海默病、帕金森病(Shoffner等，1993；Sherratt等，1997；Zhang等，1998)；年龄相关性听力丧失(Seidman等，1997)；视神经退化和心律失常(Brown等，1997；Wallace等，1988)；慢性进行性突眼性眼肌麻痹(external exophthalmoplegia)(Taniike等，1992)；动脉粥样硬化(Bogliolo等，1999)；乳头状甲状腺癌和甲状腺肿瘤(Yeh等，2000)；等等(例如Naviaux，1997；Chinnery和Turnbull，1999)。

线粒体基因组特定位点的突变可与某些疾病相关。例如，第4216、4217和4917位的突变与莱伯遗传性视神经病(Leber’s Hereditary Optic Neuropathy，LHON)相关(Mitochondrial Research Society；Huoponen(2001)；MitoMap)。在5/5患者中发现第15452位突变与泛醌细胞色素C还原酶(复合物III)缺陷相关(Valnot等，1999)。

具体地，这些突变或改变包括点突变(转换、颠换)、缺失(一个碱基至数千个碱基)、倒位、复制(一个碱基至数千个碱基)、重组和插入(一个碱基至数千个碱基)。另外，已发现特定的碱基对改变、缺失或其组合与前列腺癌、皮肤癌和肺癌的早期发作以及衰老(例如Polyak等，1998)、早衰、暴露于致癌物(Lee等，1998)等有关。

前列腺癌

前列腺癌是经常被诊断出的实体瘤，其最有可能来源于前列腺上皮(Huang等，1999)。在1997年，对近一千万美国男性筛选了前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)，其存在提示患有前列腺癌(Woodwell，1999)。事实上，这表明通过初步的直肠指检(digital rectalexam，DRE)会筛选出更大数目的男性。同一年，三千一百万男性进行了DRE(Woodwell，1999)。此外，美国每年新诊断出的前列腺癌病例数目估计为179,000(Landis等，1999)。它是加拿大男性中第二最常诊断出的癌症以及导致癌症死亡的第二主因。在1997年，前列腺癌在加拿大男性新诊断出的癌症中占19,800例(28％)(加拿大国家癌症研究所)。据估计，所有49岁以上的男性中30％至40％具有一些癌性前列腺细胞，然而这些男性中只有20％至25％有临床显著形式的前列腺癌(SpringNet-CE Connection，internet，www.springnet.com/ce/j803a.htm)。前列腺癌表现为多种组织学行为，包括内在因素和外在因素，即社会经济状况、饮食、地理环境、激素失衡、家族史以及基因构成(Konishi等，1997；Hayward等，1998)。尽管先前已发现某些mtDNA改变与前列腺癌相关，但是仍需要用于检测前列腺癌的其它标志物。

3.4 kb mtDNA缺失以及前列腺癌检测。

在本申请人尚处于审查阶段的PCT申请(公开号WO/06/111029，其全部内容通过引用并入本文)中，通过对前列腺组织进行全线粒体基因组扩增而鉴定出mtDNA的3379bp片段的缺失。经测定，该3379bp缺失(称为“3.4kb缺失”)位于线粒体基因组的10744～14124位核苷酸之间。证实了可在测试组织样品时利用对该缺失的检测来诊断前列腺癌。

所述3.4kb缺失从mtDNA基因组中除去了下列基因中的全部或部分：(i)NADH脱氢酶亚基4L，(ii)NADH脱氢酶亚基4，(iii)NADH脱氢酶亚基5，(iv)tRNA组氨酸，(v)tRNA丝氨酸2，以及(vi)tRNA亮氨酸2。

乳腺癌

乳腺癌是乳腺组织的癌症，其居于癌症死亡常见原因的第五位。在2005年，乳腺癌在全世界范围内导致502,000人死亡(占癌症死亡的7％，几乎所有死亡的1％)(世界卫生组织癌症情况说明书No.297)。在全世界的女性中，乳腺癌是最常见的癌症以及最常见的癌症死亡原因(世界卫生组织癌症情况说明书No.297)。尽管先前已发现某些mtDNA改变与乳腺癌相关，例如Parrella等(Cancer Research：61，2001)，但是仍需要用于检测乳腺癌的其它标志物。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供了检测个体中癌症的方法，其包括：

a)从所述个体获得生物样品；

b)从该样品提取线粒体DNA(mtDNA)；

c)定量样品中这种mtDNA的量，其在mtDNA基因组10743～14125位残基之间的核酸序列中具有缺失；

d)将样品中具有所述缺失的mtDNA的量与至少一种已知参照值进行比较。

在一个实施方案中，本发明提供了检测个体中癌症的方法，其包括：

a)从所述个体获得生物样品；

b)从该样品提取线粒体DNA(mtDNA)；

c)定量样品中这种mtDNA的量，其在mtDNA基因组10743～14125位残基之间的核酸序列中具有缺失；

d)将样品中具有所述缺失的mtDNA的量与来自已知非癌性组织或体液的mtDNA参照样品中所述缺失的量进行比较；

其中，与参照样品相比，生物样品中所述缺失之量的提高指示癌症。

在一个实施方案中，本发明提供了检测个体中癌症的方法，其包括：

a)从所述个体获得生物样品；

b)从该样品提取线粒体DNA(mtDNA)；

c)定量样品中这种mtDNA的量，其在mtDNA基因组10743～14125位残基之间的核酸序列中具有缺失；

d)将样品中具有所述缺失的mtDNA的量与来自已知癌性组织或体液的mtDNA参照样品中所述缺失的量进行比较；

其中，生物样品中所述缺失的水平与参照样品中类似则指示癌症。

在一个实施方案中，本发明提供了监测个体癌症发生的方法，其包括：

a)获得生物样品；

b)从该样品提取mtDNA；

c)定量样品中这种mtDNA的量，其在mtDNA基因组10743～14125位残基之间的核酸序列中具有缺失；

d)在一段时间内重复步骤a)至c)；

e)其中在所述时间段内所述缺失水平的提高指示癌症。

在一个实施方案中，本发明提供了检测个体中癌症的方法，其包括：

a)从所述个体获得生物样品；

b)从该样品提取线粒体DNA(mtDNA)；

c)定量样品中这种mtDNA的量，其具有对应于序列SEQ ID NO：1的序列；

d)将样品中对应于SEQ ID NO：1的mtDNA的量与至少一种已知参照值进行比较。

附图说明

本发明的实施方案仅通过举例并参考附图的方式进行描述，其中：

图1示意可用于检测所述3.4kb缺失之引物的设计和序列。

图2显示在3.4kb研究中恶性参与对象与症状良性参与对象之间循环阈值的比较。

图3显示实施例1中所涉及的循环阈值。

图4显示ROC曲线，其示意本发明一个实施方案的特异性和灵敏度。

图5显示ROC曲线，其示意本发明另一实施方案的特异性和灵敏度。

图6显示涉及与乳腺癌相关的3.4kb mtDNA缺失水平的实时PCR数据。

图7显示ROC曲线，其示意本发明另一实施方案的特异性和灵敏度。

发明详述

本文使用的“循环阈值”(C_T)是使用实时PCR的靶标扩增升至背景以上时的点，如通过信号(例如荧光信号)所指示地。C_T与所研究之序列的量呈负相关。

本文定义的“灵敏度”是指使用本发明方法得到的真阳性结果的分数(真阳性率)。

本文定义的“特异性”是指使用本发明方法得到的假阳性结果的分数(假阳性率)。

在本发明的一个实施方案中，提供了通过检测和定量上述3.4kbmtDNA缺失来监测和诊断癌症的方法。例如，本发明可用于检测前列腺癌和乳腺癌的前瘤形成(pre-neoplasia)、瘤形成以及向可能的恶性前列腺癌和乳腺癌发展。一方面，本发明包括检测和定量所述3.4kb mtDNA缺失(SEQ ID NO：1)用于检测、诊断和/或监测癌症。在该方法中，mtDNA提取自生物样品(例如机体组织或体液(如尿、前列腺按摩液(massagefluid)))。然后，测试所提取的mtDNA以测定样品中3.4kb缺失的水平(即，量)。在本发明人进行的测试中，发现与从未患癌症之对象获得的样品相比，从患有癌症的对象中获得的样品中所述缺失水平提高。基于以下提供的信息和数据，本发明人得出这样的结论：mtDNA中3.4kb缺失水平的提高指示癌症。

如PCT WO/06/111029中所公开地，所述3.4kb缺失大约覆盖mtDNA基因组的10744～14124位核苷酸。所述mtDNA基因组示为SEQ ID NO：8(Genbank登录号AC_000021)。如下文实施例所提供地，本发明人已确定该缺失还与癌症(特别是前列腺癌和乳腺癌)相关。因此，该缺失提供了精确的生物标志物，以及由此的用于检测、诊断或监测至少这些组织中之癌症的有价值的工具。

所述缺失导致产生两种缺失单体，其中一种的大小为3.4kb(小sublimon)，另一种的大小约为12.6kb(大sublimon)。可通过鉴定小sublimon的存在或者通过确定所述3.4kb序列已从大sublimon中缺失来检测缺失的发生。

如以上所讨论地，所述缺失约为3379bp，其包含编码NADH脱氢酶亚基4L、NADH脱氢酶亚基4、NADH脱氢酶亚基5、tRNA组氨酸、tRNA丝氨酸2和tRNA亮氨酸2的基因。

在一个实施方案中，在一段时间内(例如数年)从个体获得例如前列腺组织、前列腺按摩液、尿、乳腺组织的样品并对其进行测试，以监测癌症的发生或发展。所述3.4kb缺失水平随时间的提高可指示癌症的开始或发展。

所述3.4kb mtDNA缺失的年龄相关累积可使个体易患例如前列腺癌或乳腺癌，这两种癌分别在中老年男性与中老年女性中普遍存在。根据本发明的一个方面，提供了一种方法，其中可通过监测机体组织(例如乳腺组织)或体液(如前列腺按摩液或尿)中所述3.4kb缺失随时间的量来例行筛查癌症。

本发明的系统和方法可用于检测早期癌症以及任何组织学异常出现前的癌症。例如，本发明的系统和方法可用于检测乳腺组织中的前瘤形成。

优选使用以下引物序列检测所述3.4kb缺失：

3.4正向(结合mtDNA基因组的10729～10743/14125～14139位碱基)5’-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3’(SEQ ID NO：2)；

3.4反向(结合mtDNA基因组的14361～14379位碱基)5’-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3’(SEQ ID NO：3)。

在本发明的一个实施方案中，使用一对扩增引物来扩增指示所述3.4kb缺失存在的靶区域。在该实施方案中，扩增引物对之一与发生所述3.4kb序列缺失之后的mtDNA剪接区域重叠(即，mtDNA基因组第10743～14125位的剪接体)。因此，只有在所述3.4kb部分缺失时才可能发生所述重叠引物的延伸。

在本发明的另一实施方案中，使用一对扩增引物来扩增与所述3.4kb缺失序列相关的靶区域。所述3.4kb缺失序列一经缺失，便可重新形成环状mtDNA分子。在该实施方案中，扩增引物对之一与所述3.4kb序列末端的重新连接位点相重叠。因此，在样品中检测出增加的3.4kb分子的量指示癌症。优选使用以下引物对来检测所述缺失的3.4kb核酸：

正向14115/10755 5′-CCCACTCATCACCTAAACCTAC-3′(SEQ ID NO：9)

反向10980R 5′-GGTAGGAGTCAGGTAGTTAG-3′(SEQ ID NO：10)。

在本发明的一个方面，提供了用于诊断癌症例如前列腺癌或乳腺癌的试剂盒，其包含用于提取mtDNA的工具/装置、具有SEQ ID NO：2和3或者SEQ ID NO：9和10中所示核酸序列的引物、试剂和说明。

本发明的另一方面提供了验证或否定活检样品(例如前列腺癌或乳腺癌)中癌症存在之活检测试的方法，其包括：从活检样品获得非癌性组织；检测并定量非患病组织中所述3.4kb mtDNA缺失。

在一个实施方案中，本发明提供了从体液样品筛查个体是否患前列腺癌或乳腺癌的方法，其包括：获得体液样品，检测并定量体液中所述3.4kbmtDNA缺失的水平。

尽管如下文实施例所述，实时定量PCR方法代表了检测所述3.4kb缺失存在与否并对其定量的优选手段，然而还可使用本领域技术人员公知的其它方法。例如，可使用Bio-Rad的Bioplex^TM系统和悬浮阵列技术对所述缺失进行定量。一般而言，所述方法需要使用任何已知方法对序列进行扩增和定量。

下文提供的实施例举例说明了该缺失不仅可用于检测前列腺组织中的前列腺癌，还可用于检测其它生物样品(例如前列腺按摩液、尿和乳腺组织)中癌症的存在。基于这些实施例中的发现，所述3.4kb mtDNA缺失可用作癌症的生物标志物。

所提供的多个实施例举例说明了从患有癌症和未患癌症的对象中获得的样品之间具有所述3.4kb缺失的mtDNA的量存在差异。发现在从患有癌症的对象获得的样品中，所述3.4kb缺失的量较高。通过将测试样品中所述3.4kb缺失的量与来自已知癌细胞和/或已知非癌细胞的量进行比较得出上述结论。

实施例1：前列腺组织mtDNA中的3.4kb缺失

通过对新鲜冷冻前列腺组织的线粒体全基因组扩增鉴定出约3.4千碱基(kb)的缺失。使用线性回归估计该缺失的大小在3000碱基对(bp)至3500bp之间。使用Mitomap^TM(Brandon，M.C.，Lott，M.T.，Nguyen，K.C.，Spolim，S.，Navathe，S.B.，Baldi，P.& Wallace，D.C.，MITOMAP：ahuman mitochondrial genome database--2004 update.Nucleic Acids Research 33(Database Issue)：D611-613，2005；www.mitomap.org)鉴定出两种可能的候选缺失，即9574～12972位的3397bp缺失以及10744～14124位的3379bp缺失。为了确定两种缺失中哪种与前列腺癌有关(如果有的话)，针对两种候选缺失中的每一种设计跨越该缺失接合处的正向引物，确保该引物延伸通过所述缺失侧翼的重复区域。图1是显示所述引物设计和序列(即SEQ ID NO：2)的示意图。获得了对应于10744～14124位3379bp缺失(称为“3.4kb缺失”)的扩增子的阳性扩增结果。

如上所述，所述3.4kb缺失除去了下列基因中的全部或部分：(i)NADH脱氢酶亚基4L，(ii)NADH脱氢酶亚基4，(iii)NADH脱氢酶亚基5，(iv)tRNA组氨酸，(v)tRNA丝氨酸2以及(vi)tRNA亮氨酸2。

在33个新鲜冷冻前列腺样品的91％中检测到所述3.4kb缺失的存在。使用特异性缺失引物测试福尔马林固定的组织，以提高n值。

本发明的研究人员对来自通过激光捕获显微切割进行显微切除的32个组织样品以及来自组织学正常前列腺的12个针刺活检的完整线粒体基因组进行了测序。将来自每一个这些样品的已存档组织切片用于以下研究。从每个样品取出1～2个连续切片。从每个样品的整体而非显微切片中提取DNA。因此，每个样品由腺体前列腺组织以及基质前列腺组织的混合物组成。使用Qiagen’s QIAamp^TM DNA迷你试剂盒(货号51304)进行该提取。提取后，使用Nano-Drop^TM分光光度计对样品进行定量，并且随后将浓度归一化成2ng/μl。使用20ng输入DNA以及iQ^TM SYBR Green Supermix^TM试剂盒(Bio-Rad Laboratories Inc.)扩增每个样品。利用2双色实时PCR系统(MJ Research)进行反应。

如图2所示，在恶性前列腺样品和症状良性前列腺样品之间的循环阈值以及通过延伸测定的缺失量之间观察到明显的差异。恶性样品一致表现出早于良性样品的循环阈值。

实施例2：对3.4kb缺失的盲研究——循环阈值的比较

选择另外21个前列腺组织样品，其中10个为良性，11个为恶性。由具有资质的病理学家进行针刺活检来确定病理状态。所述样品是盲的，从而本发明的研究者在进行该测试时不知道它们的病理状态。通过检查循环阈值，本发明的研究者能够正确地预测出81％病例中的病理状态。对于4个错误预测，其中2个是将恶性样品确定为良性，2个是将良性样品确定为恶性。医生要求获得后一种情况中的2名个体的随访临床信息，从而确定它们是否在本研究使用的针刺活检结果之后被诊断出前列腺癌。其中最初得到良性样品但被该研究预测为恶性的一名个体随后得到了恶性样品。结果，一个假阳性成为了真阳性。因此，在本研究中所检测病例中86％的病理状态预测是正确的。本研究最终的阳性预测值(PPV，其中PPV＝真阳性/(真阳性+假阳性))为91％，而阴性预测值(NPV，其中NPV＝真阴性/(真阴性+假阴性))为80％。

实施例3：3.4kb缺失研究——方法(n＝76)

在本研究中对76个前列腺组织样品检测3.4kb缺失。所有组织样品均用福尔马林固定，其中25个为恶性，12个为正常，39个组织学显示具有良性前列腺疾病。在后一组中，一半以上具有增生。所有的标本均为取自研究者组织存档的针刺活检。

前列腺样本

使用来自Arcturus Bioscience Inc.的Prep-Strips(货号LCM0207)在每个载玻片上进行tapelift。这使得可以在DNA提取前将任何微粒物质或未粘附的组织从载玻片上除去。使组织仍然附在载玻片上，用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤载玻片以尽可能地除去固定剂。使用单个包装的无菌手术刀片将载玻片上的1～2个针刺活检切片刮进无菌微量离心管中。然后，根据制造商的说明书使用DNA迷你试剂盒(Qiagen，货号51304)将DNA分离并纯化。与载玻片提取物平行处理阴性提取物对照，作为质量控制检验点。通过分光光度计(Nano-Drop^TM ND-1000)测定每个样品的总DNA浓度和纯度比，并制备2ng/μl的稀释物用于定量聚合酶链式反应(qPCR)。

引物(寡核苷酸)

由Invitrogen(California，USA)化学合成纯化的寡核苷酸引物。引物序列以及扩增的PCR产物的预期大小列于表1中。另外，对mtDNA缺失的PCR分析包括阳性对照(已知带有突变mtDNA之来源的DNA)。除了TNF(肿瘤坏死因子)以外的每个引物组合都用无线粒体的rho 0细胞系来检验，以证实不存在假基因的共扩增。

表1扩增引物。

实时聚合酶链式反应

对每个样品进行三次独立的PCR。每个反应的总体积为25μl，包括模板DNA、一对引物(12s或3.4缺失或TNF)、iQ^TM SYBR Green Supermix^TM试剂盒(货号170-8882，Bio-Rad Laboratories Inc.)和蒸馏去离子水(ddH₂O)。TNF(肿瘤坏死因子)包含单拷贝核基因引物，12s包含总线粒体基因组引物。模板DNA、引物和反应缓冲液的体积和浓度列于下表。

表2 qPCR组分。

每个扩增子的循环参数列于表3。

表3循环参数。

使用配备有Intuitive Opticon Monitor^TM软件的DNA Engine2连续荧光检测系统(MJ Research Inc.)进行热循环、实时检测以及反应分析。使用标准曲线法进行DNA定量。对PCR产生的三种经纯化模板进行连续稀释(10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹)，一种产物对应于3.4缺失，一种对应于12s引物，一种对应于TNF。由此产生了三条不同的标准曲线，其显示总mtDNA(12s扩增子-线粒体全基因组引物)的拷贝数、具有3.4kb缺失之mtDNA的量、或者总的细胞核DNA(TNF-单拷贝核基因引物)的量。通过比较样品的C_T值与标准品的C_T值，所述样品的C_T值然后可以转换成DNA拷贝数。如果在37个循环内没有检测到3.4缺失，则认为该缺失不存在或者以低水平存在。

基于所述归一化样品中存在的3.4kb缺失的量来确定恶性，如所述循环域值的位置所指示。该位置可以是绝对位置(如大于25个循环但少于35个循环)，或者更可能为12s扩增子所指示的总线粒体DNA存在与3.4kb缺失之间的比例。这可以表示为总线粒体DNA的百分数。可以并入TNF扩增子所代表的细胞数，以细化良性组织与恶性组织之间的区分。

为了自动化分析这些样品，使用了生物信息学工具。这些分析涉及的三个变量分别是肿瘤坏死因子(TNF)的循环阈值C_T、含有特定引物位点的线粒体总种类以及具有目的缺失的线粒体。

聚类分析

由于数据的相似性和小范围，不对聚类进行归一化，并且不使用对数函数。

图3显示数据的真实移动以及趋势。x轴是患者数，y轴是实时PCR得到的循环阈值。

应当着重指出的是，循环阈值越高，表示缺失存在的量越低。

显示于图3中的大体趋势是基于缺失、总计以及TNF变量的差异/比值。该缺失在良性/正常样品(右侧)中是低的至不存在，而在异常良性和恶性样品中则升高(向左侧)。异常良性和恶性样品基于缺失与TNF之间的循环阈值比而彼此区分。

指导式获知(Supervised Learning)

指导式获知基于试图预测已知样品结果的系统。使用半数数据训练，而另一半用于测试算法。指导式获知将其预测与目标结果进行比较，并且从错误中“获知”。但是，如果该预测结果高于或者低于数据的真实结果，该错误会通过系统传回并相应地调整权重。

数据集：5％至35％-良性

        35％至65％-增生

        65％至95％-恶性

人工神经网络(ANN)算法(示意如下)：

数据集的一半用于训练ANN

另一半用于比较精确度。精确度＝对预测的数据集与获得的数据集进行比较→86.6％

使用人工神经网络(ANN)对缺失数据进行指导式获知

三个类别：

良性

增生

恶性

基于实时PCR循环阈值C_T对每种类别使用三个变量：

肿瘤坏死因子(TNF)-细胞核拷贝对照

总线粒体-线粒体拷贝对照

缺失-缺失状态的线粒体。

结果：

数据集的一半用于训练ANN，其余一半用于比较精确度。

三种分类的精确度＝86.6％

阳性预测值(PPV)；

良性至恶性＝88.2％

阴性预测值(NPV)

良性至恶性＝76.5％

实施例4：与乳腺癌相关的mtDNA中的3.4kb缺失

测试了来自恶性和良性乳腺组织的18个样品中上述3.4kb缺失的存在，其中9个为恶性，9个为良性。使用常规组织病理学分析将样品分为恶性或良性。

按照制造商的说明使用DNA迷你试剂盒(Qiagen，货号51304)从样品中分离并纯化DNA。

由Invitrogen(California，USA)化学合成纯化的寡核苷酸。上文表1中列出引物的序列和所扩增PCR产物的预期大小。

实时聚合酶链式反应

对每个样品进行三次独立的PCR。每个反应的总体积为25μl，包括模板DNA、一对引物(12s或3.4缺失或TNF)、iQ^TM SYBR GreenSupermix试剂盒(货号170-8882，Bio-Rad Laboratories Inc.)和蒸馏去离子水(ddH₂O)。TNF(肿瘤坏死因子)包含单拷贝核基因引物，12s包含总线粒体基因组引物。模板DNA、引物和反应缓冲液的体积和浓度列于下表。

表4 qPCR组分。

表5中列出每个扩增子的循环参数。

表5循环参数。

使用配备有Intuitive Opticon Monitor^TM软件的DNA Engine2连续荧光检测系统(MJ Research Inc.)进行热循环、实时检测以及反应分析。使用标准曲线法进行DNA定量。对PCR产生的三种经纯化模板进行连续稀释(10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹)，一种产物对应于3.4缺失，一种对应于12s引物，一种对应于TNF。由此产生了三条不同的标准曲线，其显示总mtDNA(12s扩增子-线粒体全基因组引物)、3.4缺失或总的细胞核DNA(TNF-单拷贝核基因引物)的的拷贝数。通过比较样品的C_T值与标准品的C_T值，所述样品的C_T值然后可以转换成DNA拷贝数。

基于所述归一化样品中存在的3.4kb缺失的量来确定恶性，如所述循环域值的位置所指示。该位置可以是绝对位置(如大于25个循环但少于30个循环)，或者更可能为12s扩增子所指示的总线粒体DNA存在与3.4kb缺失之间的比例。这可以表示为总线粒体DNA的百分数。

为了自动化分析这些样品，使用了生物信息学工具。这些分析涉及的三个变量分别是肿瘤坏死因子(TNF)的循环阈值C_T、含有特定引物位点的线粒体总种类以及具有目的缺失的线粒体。

表6和图7显示了来自恶性组织和良性组织的平均C_T分值的差异。正常组织的平均C_T值为30.5889，而恶性组织的平均C_T为27.8533，由此表明在恶性乳腺组织中具有所述3.4kb缺失的mtDNA的量与正常乳腺组织存在差异。

表6 C_T分值的平均值

组统计分析

图8是ROC曲线，表明所述3.4kb mtDNA缺失作为检测乳腺组织时的乳腺癌标志物的特异性和灵敏度。使用C_T截断值29.1900获得这些结果的。在该C_T下，所述标志物的灵敏度为77.8％，而特异性为77.8％。

表7显示本实施例的曲线下面积的计算。作为对该测试精确性的度量。

表7显示曲线下面积的结果

曲线下面积

测试结果变量：3.4缺失

a.非参数假设

b.零假设：真实面积＝0.5

下文表8显示C_T截断值29.1900的确定。表8中列出的结果显示C_T截断值29.1900分别提供了78％和78％的灵敏度和特异性。

表8：C_T截断值的确定。

曲线的坐标

测试结果变量：3.4缺失

a.最小的截断值是所观察测试值的最小值减1，最大的截断值是所观察测试值的最大值加1。所有其它截断值是所设立的两个连续观察测试值的平均值。

实施例5：与不具有前列腺癌组织学证据之个体的前列腺按摩液相比，患有前列腺癌之个体的前列腺按摩液中的3.4kb缺失

由泌尿科医师从患者收集40份前列腺按摩液样品，所述患者随后被诊断出患有前列腺癌或者在前列腺针刺活检步骤后未显示前列腺癌的组织学证据。将样品沉积于IsoCode Card^TM(Schleicher & Shuell)上，干燥，然后根据制造商的方案进行提取。使用NanoDrop^TM ND-1000分光光度计对所有DNA提取物进行定量，将DNA浓度归一化至2ng/μl。然后根据下列参数对每个样品进行扩增：

在25μl反应体系中，

1×iQ SYBR Green Supermix^TM(Bio-Rad P/N 170-8880)

150nmol正向引物

(5’-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3’)(SEQ ID NO：2)

150nmol反向引物

(5’-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3’)(SEQ ID NO：3)

20ng模板DNA。

根据下列方案，利用Opticon^TM 2 DNA Engine(Bio-Rad Canada)对反应体系进行循环：

1.95℃3分钟

2.95℃30秒

3.66℃30秒

4.72℃30秒

5.读板

6.重复步骤2-5，44次

7.72℃10分钟

8.解链曲线从50℃至105℃，每隔1℃读取，保持3秒

9.在10℃下保持。

表9显示前列腺按摩液测试之平均C_T值的结果

组统计分析

表9和表10显示良性样品和恶性样品组获得的平均C_T值的显著性差异(p＝0.005)。

表10显示样品C_T值差异的结果(p＝0.005)。

独立样品测试

图5是接受者操作特性(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线，其表明3.4kb mtDNA缺失作为检测前列腺按摩液时的前列腺癌标志物的特异性和灵敏度。使用C_T截断值37.3683获得这些结果。在该C_T下，所述标志物的灵敏度为87％，而特异性为64％。

该测试的精确度取决于该测试如何将待测组分成患前列腺癌和未患前列腺癌的组。通过ROC曲线下的面积来测量精确度。表11显示本实施例的曲线下面积的计算。

表11显示ROC曲线下面积的结果

曲线下面积

测试结果变量：3.4缺失

a.非参数假设

b.零假设：真实面积＝0.5

表12特异性和灵敏度的确定

曲线的坐标

测试结果变量：3.4缺失

最小的截断值是所观察测试值的最小值减1，最大的截断值是所观察测试值的最大值加1。所有其它截断值是所设立的两个连续观察测试值的平均值。

上文表12中显示了对C_T截断值37.3683的确定。表12中列出的结果表明C_T截断值37.3683提供了最高的灵敏度和特异性。

实施例6：与来自不具有前列腺癌组织学证据之个体的尿液相比，患有前列腺癌之个体的尿液中的3.4kb缺失。

尿样收集自5位诊断患有前列腺癌的患者以及5位接受了针刺活检但无法检测出前列腺恶变的个体。这些样品在直肠指检(DRE)之后收集，以利于前列腺细胞的收集。

在得到样品之后，取出5ml等份，然后以14,000×g离心2ml以形成沉淀。取出并弃去上清。将沉淀物用200μl磷酸缓冲盐溶液重悬。按照制造商的说明，使用QiaAMP^TM DNA迷你试剂盒(Qiagen P/N 51304)将重悬的沉淀物和全尿样品进行DNA提取。然后，使用NanoDrop^TMND-1000分光光度计对所得DNA提取物进行定量，并归一化为0.1ng/μl的浓度。

根据下文使用3.4kb缺失特异性引物利用定量实时PCR分析样品：

在25μl反应体系中，

1×iQ SYBR Green Supermix^TM(Bio-Rad P/N 170-8880)

100nmol正向引物

(5’-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3’)(SEQ ID NO：2)

100nmol反向引物(5’-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3’)(SEQ ID NO：3)

1ng模板DNA。

根据下列方案，利用Opticon^TM 2DNA Engine(Bio-Rad Canada)将反应体系进行循环：

1.95℃3分钟

2.95℃30秒

3.69℃30秒

4.72℃30秒

5.读板

6.重复步骤2-5，44次

7.72℃10分钟

8.解链曲线从50℃至105℃，每1℃读取，保持3秒

9.在10℃下保持

表13 C_T分值的平均值

组统计分析

表13和表14显示良性样品和恶性样品组所获得的平均C_T值之间的显著性差异(p＝0.005)。

表14显示样品C_T值差异的结果(p＝0.005)。

独立样品测试

图6是接受者操作特性(ROC)曲线，其表明3.4kb mtDNA缺失作为测试尿时的前列腺癌标志物的特异性和灵敏度。使用C_T截断值31.575获得这些结果。在该C_T下，所述标志物的灵敏度为80％，而特异性为100％。

表15显示了C_T截断值31.575的确定。表15中列出的结果显示C_T截断值31.575提供了最高的灵敏度和特异性。

表15：C_T截断值的确定。

曲线的坐标

测试结果变量：CTf

a.最小的截断值是所观察测试值的最小值减1，最大的截断值是所观察测试值的最大值加1。所有其它截断值是所设立的两个连续观察测试值的平均值。

实施例7：检测前列腺恶性和良性组织中的再环化3.4kb缺失序列

在该实施例中，测试样品中再环化3.4kb缺失mtDNA分子的量作为前列腺癌的指示物。如上所述，所述3.4kb序列在缺失后可重新形成环化的mtDNA分子。使用引物对(SEQ ID NO：9和10)从缺失3.4kb的mtDNAsublimon扩增靶区域。正向引物(SEQ ID NO：9)与所述3.4kb序列末端的重新连接位点重叠。

前列腺组织是经福尔马林固定石蜡包埋的前列腺组织针刺活检。

该实施例使用的试剂设置如下：

在25μl反应体积中，

250nmol的每种引物

12.5μl的2×反应混合物，

20ng(10μl，2ng/μl)模板。

循环参数如下：

1.95℃3分钟

2.95℃30秒

3.62℃30秒

4.72℃30秒

5.读板

6.重复步骤2-5，44次

7.72℃10分钟

8.解链曲线从50℃至100℃，每隔1℃读取，保持3秒

9.在4℃下保持。

使用引物对(SEQ ID NO：9和10)从所述缺失3.4kb的mtDNAsublimon扩增靶区域。

下文表16提供了为检测从恶性和良性前列腺组织中获得的mtDNA中实际的3.4kb缺失所进行之测试的总结。使用C_T分值30.0，有可能明显地鉴定出恶性和良性组织。由此，样品中存在的所述3.4kb分子的量的增加指示癌症。

表16：用于检测前列腺组织中癌症的C_T分值

 描述  C_T 良性样品1  33.75 恶性样品1  28.79 良性样品2  30.96 恶性样品2  28.4 良性样品3  32.19 恶性样品3  27.38

尽管本发明已通过一些具体实施方案进行了描述，在不背离本文所附权利要求所概述的本发明之精神和范围的前提下，多种修改对于本领域技术人员来说是明显的。

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序列表

<110>起源基因组学公司

 

<120>3.4KB线粒体DNA缺失用于检测癌症

 

<130>102222/00031

 

<160>10

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>3379

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>1

cctaaaccta ctccaatgct aaaactaatc gtcccaacaa ttatattact accactgaca    60

tgactttcca aaaaacacat aatttgaatc aacacaacca cccacagcct aattattagc    120

atcatccctc tactattttt taaccaaatc aacaacaacc tatttagctg ttccccaacc    180

ttttcctccg accccctaac aacccccctc ctaatactaa ctacctgact cctacccctc    240

acaatcatgg caagccaacg ccacttatcc agtgaaccac tatcacgaaa aaaactctac    300

ctctctatac taatctccct acaaatctcc ttaattataa cattcacagc cacagaacta    360

atcatatttt atatcttctt cgaaaccaca cttatcccca ccttggctat catcacccga    420

tgaggcaacc agccagaacg cctgaacgca ggcacatact tcctattcta caccctagta    480

ggctcccttc ccctactcat cgcactaatt tacactcaca acaccctagg ctcactaaac    540

attctactac tcactctcac tgcccaagaa ctatcaaact cctgagccaa caacttaata    600

tgactagctt acacaatagc ttttatagta aagatacctc tttacggact ccacttatga    660

ctccctaaag cccatgtcga agcccccatc gctgggtcaa tagtacttgc cgcagtactc    720

ttaaaactag gcggctatgg tataatacgc ctcacactca ttctcaaccc cctgacaaaa    780

cacatagcct accccttcct tgtactatcc ctatgaggca taattataac aagctccatc    840

tgcctacgac aaacagacct aaaatcgctc attgcatact cttcaatcag ccacatagcc    900

ctcgtagtaa cagccattct catccaaacc ccctgaagct tcaccggcgc agtcattctc    960

ataatcgccc acgggcttac atcctcatta ctattctgcc tagcaaactc aaactacgaa    1020

cgcactcaca gtcgcatcat aatcctctct caaggacttc aaactctact cccactaata    1080

gctttttgat gacttctagc aagcctcgct aacctcgcct taccccccac tattaaccta    1140

ctgggagaac tctctgtgct agtaaccacg ttctcctgat caaatatcac tctcctactt    1200

acaggactca acatactagt cacagcccta tactccctct acatatttac cacaacacaa    1260

tggggctcac tcacccacca cattaacaac ataaaaccct cattcacacg agaaaacacc    1320

ctcatgttca tacacctatc ccccattctc ctcctatccc tcaaccccga catcattacc    1380

gggttttcct cttgtaaata tagtttaacc aaaacatcag attgtgaatc tgacaacaga    1440

ggcttacgac cccttattta ccgagaaagc tcacaagaac tgctaactca tgcccccatg    1500

tctaacaaca tggctttctc aacttttaaa ggataacagc tatccattgg tcttaggccc    1560

caaaaatttt ggtgcaactc caaataaaag taataaccat gcacactact ataaccaccc    1620

taaccctgac ttccctaatt ccccccatcc ttaccaccct cgttaaccct aacaaaaaaa    1680

actcataccc ccattatgta aaatccattg tcgcatccac ctttattatc agtctcttcc    1740

ccacaacaat attcatgtgc ctagaccaag aagttattat ctcgaactga cactgagcca    1800

caacccaaac aacccagctc tccctaagct tcaaactaga ctacttctcc ataatattca    1860

tccctgtagc attgttcgtt acatggtcca tcatagaatt ctcactgtga tatataaact    1920

cagacccaaa cattaatcag ttcttcaaat atctactcat cttcctaatt accatactaa    1980

tcttagttac cgctaacaac ctattccaac tgttcatcgg ctgagagggc gtaggaatta    2040

tatccttctt gctcatcagt tgatgatacg cccgagcaga tgccaacaca gcagccattc    2100

aagcaatcct atacaaccgt atcggcgata tcggtttcat cctcgcctta gcatgattta    2160

tcctacactc caactcatga gacccacaac aaatagccct tctaaacgct aatccaagcc    2220

tcaccccact actaggcctc ctcctagcag cagcaggcaa atcagcccaa ttaggtctcc    2280

acccctgact cccctcagcc atagaaggcc ccaccccagt ctcagcccta ctccactcaa    2340

gcactatagt tgtagcagga atcttcttac tcatccgctt ccacccccta gcagaaaata    2400

gcccactaat ccaaactcta acactatgct taggcgctat caccactctg ttcgcagcag    2460

tctgcgccct tacacaaaat gacatcaaaa aaatcgtagc cttctccact tcaagtcaac    2520

taggactcat aatagttaca atcggcatca accaaccaca cctagcattc ctgcacatct    2580

gtacccacgc cttcttcaaa gccatactat ttatgtgctc cgggtccatc atccacaacc    2640

ttaacaatga acaagatatt cgaaaaatag gaggactact caaaaccata cctctcactt    2700

caacctccct caccattggc agcctagcat tagcaggaat acctttcctc acaggtttct    2760

actccaaaga ccacatcatc gaaaccgcaa acatatcata cacaaacgcc tgagccctat    2820

ctattactct catcgctacc tccctgacaa gcgcctatag cactcgaata attcttctca    2880

ccctaacagg tcaacctcgc ttccccaccc ttactaacat taacgaaaat aaccccaccc    2940

tactaaaccc cattaaacgc ctggcagccg gaagcctatt cgcaggattt ctcattacta    3000

acaacatttc ccccgcatcc cccttccaaa caacaatccc cctctaccta aaactcacag    3060

ccctcgctgt cactttccta ggacttctaa cagccctaga cctcaactac ctaaccaaca    3120

aacttaaaat aaaatcccca ctatgcacat tttatttctc caacatactc ggattctacc    3180

ctagcatcac acaccgcaca atcccctatc taggccttct tacgagccaa aacctgcccc    3240

tactcctcct agacctaacc tgactagaaa agctattacc taaaacaatt tcacagcacc    3300

aaatctccac ctccatcatc acctcaaccc aaaaaggcat aattaaactt tacttcctct    3360

ctttcttctt cccactcat                 3379

 

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>3.4kb缺失正向检测引物

 

<400>2

tagactacgt acatactaac cctactccta     30

 

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>3.4mtDNA缺失反向检测引物

 

<400>3

gaggtaggat tggtgctgt                 19

 

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>mtDNA基因组正向引物

 

<400>4

cgttccagtg agttcaccct c              21

 

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>mtDNA因组反向引物

 

<400>5

cactctttac gccggcttctatt             23

 

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TNF核基因正向引物

 

<400>6

cctgccccaa tccctttatt                20

 

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TNF核基因反向引物

 

<400>7

ggtttcgaag tggtggtctt g              21

 

<210>8

<211>16569

<212>DNA

<213>人

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(3107)..(3107)

<223>n是a，c，g，或t

 

<300>

<308>AC_000021

<309>2007-03-07

<313>(1)..(16569)

 

<400>8

gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt    60

cgtctggggg gtatgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc    120

gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatc ctattattta tcgcacctac gttcaatatt    180

acaggcgaac atacttacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata    240

acaattgaat gtctgcacag ccactttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca    300

aaccccccct cccccgcttc tggccacagc acttaaacac atctctgcca aaccccaaaa    360

acaaagaacc ctaacaccag cctaaccaga tttcaaattt tatcttttgg cggtatgcac    420

ttttaacagt caccccccaa ctaacacatt attttcccct cccactccca tactactaat    480

ctcatcaata caacccccgc ccatcctacc cagcacacac acaccgctgc taaccccata    540

ccccgaacca accaaacccc aaagacaccc cccacagttt atgtagctta cctcctcaaa    600

gcaatacact gaaaatgttt agacgggctc acatcacccc ataaacaaat aggtttggtc    660

ctagcctttc tattagctct tagtaagatt acacatgcaa gcatccccgt tccagtgagt    720

tcaccctcta aatcaccacg atcaaaagga acaagcatca agcacgcagc aatgcagctc    780

aaaacgctta gcctagccac acccccacgg gaaacagcag tgattaacct ttagcaataa    840

acgaaagttt aactaagcta tactaacccc agggttggtc aatttcgtgc cagccaccgc    900

ggtcacacga ttaacccaag tcaatagaag ccggcgtaaa gagtgtttta gatcaccccc    960

tccccaataa agctaaaact cacctgagtt gtaaaaaact ccagttgaca caaaatagac    1020

tacgaaagtg gctttaacat atctgaacac acaatagcta agacccaaac tgggattaga    1080

taccccacta tgcttagccc taaacctcaa cagttaaatc aacaaaactg ctcgccagaa    1140

cactacgagc cacagcttaa aactcaaagg acctggcggt gcttcatatc cctctagagg    1200

agcctgttct gtaatcgata aaccccgatc aacctcacca cctcttgctc agcctatata    1260

ccgccatctt cagcaaaccc tgatgaaggc tacaaagtaa gcgcaagtac ccacgtaaag    1320

acgttaggtc aaggtgtagc ccatgaggtg gcaagaaatg ggctacattt tctaccccag    1380

aaaactacga tagcccttat gaaacttaag ggtcgaaggt ggatttagca gtaaactaag    1440

agtagagtgc ttagttgaac agggccctga agcgcgtaca caccgcccgt caccctcctc    1500

aagtatactt caaaggacat ttaactaaaa cccctacgca tttatataga ggagacaagt    1560

cgtaacatgg taagtgtact ggaaagtgca cttggacgaa ccagagtgta gcttaacaca    1620

aagcacccaa cttacactta ggagatttca acttaacttg accgctctga gctaaaccta    1680

gccccaaacc cactccacct tactaccaga caaccttagc caaaccattt acccaaataa    1740

agtataggcg atagaaattg aaacctggcg caatagatat agtaccgcaa gggaaagatg    1800

aaaaattata accaagcata atatagcaag gactaacccc tataccttct gcataatgaa    1860

ttaactagaa ataactttgc aaggagagcc aaagctaaga cccccgaaac cagacgagct    1920

acctaagaac agctaaaaga gcacacccgt ctatgtagca aaatagtggg aagatttata    1980

ggtagaggcg acaaacctac cgagcctggt gatagctggt tgtccaagat agaatcttag    2040

ttcaacttta aatttgccca cagaaccctc taaatcccct tgtaaattta actgttagtc    2100

caaagaggaa cagctctttg gacactagga aaaaaccttg tagagagagt aaaaaattta    2160

acacccatag taggcctaaa agcagccacc aattaagaaa gcgttcaagc tcaacaccca    2220

ctacctaaaa aatcccaaac atataactga actcctcaca cccaattgga ccaatctatc    2280

accctataga agaactaatg ttagtataag taacatgaaa acattctcct ccgcataagc    2340

ctgcgtcaga ttaaaacact gaactgacaa ttaacagccc aatatctaca atcaaccaac    2400

aagtcattat taccctcact gtcaacccaa cacaggcatg ctcataagga aaggttaaaa    2460

aaagtaaaag gaactcggca aatcttaccc cgcctgttta ccaaaaacat cacctctagc    2520

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aaccgtgcaa aggtagcata atcacttgtt ccttaaatag ggacctgtat gaatggctcc    2640

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ggcataacac agcaagacga gaagacccta tggagcttta atttattaat gcaaacagta    2760

cctaacaaac ccacaggtcc taaactacca aacctgcatt aaaaatttcg gttggggcga    2820

cctcggagca gaacccaacc tccgagcagt acatgctaag acttcaccag tcaaagcgaa    2880

ctactatact caattgatcc aataacttga ccaacggaac aagttaccct agggataaca    2940

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ggacatcccg atggtgcagc cgctattaaa ggttcgtttg ttcaacgatt aaagtcctac    3060

gtgatctgag ttcagaccgg agtaatccag gtcggtttct atctacnttc aaattcctcc    3120

ctgtacgaaa ggacaagaga aataaggcct acttcacaaa gcgccttccc ccgtaaatga    3180

tatcatctca acttagtatt atacccacac ccacccaaga acagggtttg ttaagatggc    3240

agagcccggt aatcgcataa aacttaaaac tttacagtca gaggttcaat tcctcttctt    3300

aacaacatac ccatggccaa cctcctactc ctcattgtac ccattctaat cgcaatggca    3360

ttcctaatgc ttaccgaacg aaaaattcta ggctatatac aactacgcaa aggccccaac    3420

gttgtaggcc cctacgggct actacaaccc ttcgctgacg ccataaaact cttcaccaaa    3480

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ctcaccatcg ctcttctact atgaaccccc ctccccatac ccaaccccct ggtcaacctc    3600

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acaatctcat atgaagtcac cctagccatc attctactat caacattact aataagtggc    3780

tcctttaacc tctccaccct tatcacaaca caagaacacc tctgattact cctgccatca    3840

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gaccttgccg aaggggagtc cgaactagtc tcaggcttca acatcgaata cgccgcaggc    3960

cccttcgccc tattcttcat agccgaatac acaaacatta ttataataaa caccctcacc    4020

actacaatct tcctaggaac aacatatgac gcactctccc ctgaactcta cacaacatat    4080

tttgtcacca agaccctact tctaacctcc ctgttcttat gaattcgaac agcatacccc    4140

cgattccgct acgaccaact catacacctc ctatgaaaaa acttcctacc actcacccta    4200

gcattactta tatgatatgt ctccataccc attacaatct ccagcattcc ccctcaaacc    4260

taagaaatat gtctgataaa agagttactt tgatagagta aataatagga gcttaaaccc    4320

ccttatttct aggactatga gaatcgaacc catccctgag aatccaaaat tctccgtgcc    4380

acctatcaca ccccatccta aagtaaggtc agctaaataa gctatcgggc ccataccccg    4440

aaaatgttgg ttataccctt cccgtactaa ttaatcccct ggcccaaccc gtcatctact    4500

ctaccatctt tgcaggcaca ctcatcacag cgctaagctc gcactgattt tttacctgag    4560

taggcctaga aataaacatg ctagctttta ttccagttct aaccaaaaaa ataaaccctc    4620

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taatagctat cctcttcaac aatatactct ccggacaatg aaccataacc aatactacca    4740

atcaatactc atcattaata atcataatag ctatagcaat aaaactagga atagccccct    4800

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taaaaataaa atgacagttt gaacatacaa aacccacccc attcctcccc acactcatcg    5460

cccttaccac gctactccta cctatctccc cttttatact aataatctta tagaaattta    5520

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tctacaacgt tatcgtcaca gcccatgcat ttgtaataat cttcttcata gtaataccca    6120

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acctattctg atttttcggt caccctgaag tttatattct tatcctacca ggcttcggaa    6660

taatctccca tattgtaact tactactccg gaaaaaaaga accatttgga tacataggta    6720

tggtctgagc tatgatatca attggcttcc tagggtttat cgtgtgagca caccatatat    6780

ttacagtagg aatagacgta gacacacgag catatttcac ctccgctacc ataatcatcg    6840

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aatgatctgc tgcagtgctc tgagccctag gattcatctt tcttttcacc gtaggtggcc    6960

tgactggcat tgtattagca aactcatcac tagacatcgt actacacgac acgtactacg    7020

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atttcactat catattcatc ggcgtaaatc taactttctt cccacaacac tttctcggcc    7200

tatccggaat gccccgacgt tactcggact accccgatgc atacaccaca tgaaacatcc    7260

tatcatctgt aggctcattc atttctctaa cagcagtaat attaataatt ttcatgattt    7320

gagaagcctt cgcttcgaag cgaaaagtcc taatagtaga agaaccctcc ataaacctgg    7380

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ctagacaaaa aaggaaggaa tcgaaccccc caaagctggt ttcaagccaa ccccatggcc    7500

tccatgactt tttcaaaaag gtattagaaa aaccatttca taactttgtc aaagttaaat    7560

tataggctaa atcctatata tcttaatggc acatgcagcg caagtaggtc tacaagacgc    7620

tacttcccct atcatagaag agcttatcac ctttcatgat cacgccctca taatcatttt    7680

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tactaacatc tcagacgctc aggaaataga aaccgtctga actatcctgc ccgccatcat    7800

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aataattaca tcacaagacg tcttgcactc atgagctgtc cccacattag gcttaaaaac    8100

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attaattccc ctaaaaatct ttgaaatagg gcccgtattt accctatagc accccctcta    8280

ccccctctag agcccactgt aaagctaact tagcattaac cttttaagtt aaagattaag    8340

agaaccaaca cctctttaca gtgaaatgcc ccaactaaat actaccgtat ggcccaccat    8400

aattaccccc atactcctta cactattcct catcacccaa ctaaaaatat taaacacaaa    8460

ctaccaccta cctccctcac caaagcccat aaaaataaaa aattataaca aaccctgaga    8520

accaaaatga acgaaaatct gttcgcttca ttcattgccc ccacaatcct aggcctaccc    8580

gccgcagtac tgatcattct atttccccct ctattgatcc ccacctccaa atatctcatc    8640

aacaaccgac taatcaccac ccaacaatga ctaatcaaac taacctcaaa acaaatgata    8700

accatacaca acactaaagg acgaacctga tctcttatac tagtatcctt aatcattttt    8760

attgccacaa ctaacctcct cggactcctg cctcactcat ttacaccaac cacccaacta    8820

tctataaacc tagccatggc catcccctta tgagcgggca cagtgattat aggctttcgc    8880

tctaagatta aaaatgccct agcccacttc ttaccacaag gcacacctac accccttatc    8940

cccatactag ttattatcga aaccatcagc ctactcattc aaccaatagc cctggccgta    9000

cgcctaaccg ctaacattac tgcaggccac ctactcatgc acctaattgg aagcgccacc    9060

ctagcaatat caaccattaa ccttccctct acacttatca tcttcacaat tctaattcta    9120

ctgactatcc tagaaatcgc tgtcgcctta atccaagcct acgttttcac acttctagta    9180

agcctctacc tgcacgacaa cacataatga cccaccaatc acatgcctat catatagtaa    9240

aacccagccc atgaccccta acaggggccc tctcagccct cctaatgacc tccggcctag    9300

ccatgtgatt tcacttccac tccataacgc tcctcatact aggcctacta accaacacac    9360

taaccatata ccaatgatgg cgcgatgtaa cacgagaaag cacataccaa ggccaccaca    9420

caccacctgt ccaaaaaggc cttcgatacg ggataatcct atttattacc tcagaagttt    9480

ttttcttcgc aggatttttc tgagcctttt accactccag cctagcccct accccccaat    9540

taggagggca ctggccccca acaggcatca ccccgctaaa tcccctagaa gtcccactcc    9600

taaacacatc cgtattactc gcatcaggag tatcaatcac ctgagctcac catagtctaa    9660

tagaaaacaa ccgaaaccaa ataattcaag cactgcttat tacaatttta ctgggtctct    9720

attttaccct cctacaagcc tcagagtact tcgagtctcc cttcaccatt tccgacggca    9780

tctacggctc aacatttttt gtagccacag gcttccacgg acttcacgtc attattggct    9840

caactttcct cactatctgc ttcatccgcc aactaatatt tcactttaca tccaaacatc    9900

actttggctt cgaagccgcc gcctgatact ggcattttgt agatgtggtt tgactatttc    9960

tgtatgtctc catctattga tgagggtctt actcttttag tataaatagt accgttaact    10020

tccaattaac tagttttgac aacattcaaa aaagagtaat aaacttcgcc ttaattttaa    10080

taatcaacac cctcctagcc ttactactaa taattattac attttgacta ccacaactca    10140

acggctacat agaaaaatcc accccttacg agtgcggctt cgaccctata tcccccgccc    10200

gcgtcccttt ctccataaaa ttcttcttag tagctattac cttcttatta tttgatctag    10260

aaattgccct ccttttaccc ctaccatgag ccctacaaac aactaacctg ccactaatag    10320

ttatgtcatc cctcttatta atcatcatcc tagccctaag tctggcctat gagtgactac    10380

aaaaaggatt agactgaacc gaattggtat atagtttaaa caaaacgaat gatttcgact    10440

cattaaatta tgataatcat atttaccaaa tgcccctcat ttacataaat attatactag    10500

catttaccat ctcacttcta ggaatactag tatatcgctc acacctcata tcctccctac    10560

tatgcctaga aggaataata ctatcgctgt tcattatagc tactctcata accctcaaca    10620

cccactccct cttagccaat attgtgccta ttgccatact agtctttgcc gcctgcgaag    10680

cagcggtggg cctagcccta ctagtctcaa tctccaacac atatggccta gactacgtac    10740

ataacctaaa cctactccaa tgctaaaact aatcgtccca acaattatat tactaccact    10800

gacatgactt tccaaaaaac acataatttg aatcaacaca accacccaca gcctaattat    10860

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cctcacaatc atggcaagcc aacgccactt atccagtgaa ccactatcac gaaaaaaact    11040

ctacctctct atactaatct ccctacaaat ctccttaatt ataacattca cagccacaga    11100

actaatcata ttttatatct tcttcgaaac cacacttatc cccaccttgg ctatcatcac    11160

ccgatgaggc aaccagccag aacgcctgaa cgcaggcaca tacttcctat tctacaccct    11220

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aaacattcta ctactcactc tcactgccca agaactatca aactcctgag ccaacaactt    11340

aatatgacta gcttacacaa tagcttttat agtaaagata cctctttacg gactccactt    11400

atgactccct aaagcccatg tcgaagcccc catcgctggg tcaatagtac ttgccgcagt    11460

actcttaaaa ctaggcggct atggtataat acgcctcaca ctcattctca accccctgac    11520

aaaacacata gcctacccct tccttgtact atccctatga ggcataatta taacaagctc    11580

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tctcataatc gcccacgggc ttacatcctc attactattc tgcctagcaa actcaaacta    11760

cgaacgcact cacagtcgca tcataatcct ctctcaagga cttcaaactc tactcccact    11820

aatagctttt tgatgacttc tagcaagcct cgctaacctc gccttacccc ccactattaa    11880

cctactggga gaactctctg tgctagtaac cacgttctcc tgatcaaata tcactctcct    11940

acttacagga ctcaacatac tagtcacagc cctatactcc ctctacatat ttaccacaac    12000

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caccctcatg ttcatacacc tatcccccat tctcctccta tccctcaacc ccgacatcat    12120

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ttcatccctg tagcattgtt cgttacatgg tccatcatag aattctcact gtgatatata    12660

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ctaatcttag ttaccgctaa caacctattc caactgttca tcggctgaga gggcgtagga    12780

attatatcct tcttgctcat cagttgatga tacgcccgag cagatgccaa cacagcagcc    12840

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ctcaccctaa caggtcaacc tcgcttcccc acccttacta acattaacga aaataacccc  13680

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cccctactcc tcctagacct aacctgacta gaaaagctat tacctaaaac aatttcacag  14040

caccaaatct ccacctccat catcacctca acccaaaaag gcataattaa actttacttc  14100

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tactaaaccc ccataaatag gagaaggctt agaagaaaac cccacaaacc ccattactaa  14640

acccacactc aacagaaaca aagcatacat cattattctc gcacggacta caaccacgac  14700

caatgatatg aaaaaccatc gttgtatttc aactacaaga acaccaatga ccccaatacg  14760

caaaactaac cccctaataa aattaattaa ccactcattc atcgacctcc ccaccccatc  14820

caacatctcc gcatgatgaa acttcggctc actccttggc gcctgcctga tcctccaaat  14880

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aatcgcccac atcactcgag acgtaaatta tggctgaatc atccgctacc ttcacgccaa  15000

tggcgcctca atattcttta tctgcctctt cctacacatc gggcgaggcc tatattacgg  15060

atcatttctc tactcagaaa cctgaaacat cggcattatc ctcctgcttg caactatagc  15120

aacagccttc ataggctatg tcctcccgtg aggccaaata tcattctgag gggccacagt  15180

aattacaaac ttactatccg ccatcccata cattgggaca gacctagttc aatgaatctg  15240

aggaggctac tcagtagaca gtcccaccct cacacgattc tttacctttc acttcatctt  15300

gcccttcatt attgcagccc tagcaacact ccacctccta ttcttgcacg aaacgggatc  15360

aaacaacccc ctaggaatca cctcccattc cgataaaatc accttccacc cttactacac  15420

aatcaaagac gccctcggct tacttctctt ccttctctcc ttaatgacat taacactatt  15480

ctcaccagac ctcctaggcg acccagacaa ttatacccta gccaacccct taaacacccc  15540

tccccacatc aagcccgaat gatatttcct attcgcctac acaattctcc gatccgtccc  15600

taacaaacta ggaggcgtcc ttgccctatt actatccatc ctcatcctag caataatccc  15660

catcctccat atatccaaac aacaaagcat aatatttcgc ccactaagcc aatcacttta  15720

ttgactccta gccgcagacc tcctcattct aacctgaatc ggaggacaac cagtaagcta  15780

cccttttacc atcattggac aagtagcatc cgtactatac ttcacaacaa tcctaatcct  15840

aataccaact atctccctaa ttgaaaacaa aatactcaaa tgggcctgtc cttgtagtat  15900

aaactaatac accagtcttg taaaccggag atgaaaacct ttttccaagg acaaatcaga  15960

gaaaaagtct ttaactccac cattagcacc caaagctaag attctaattt aaactattct  16020

ctgttctttc atggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaaca  16080

accgctatgt atttcgtaca ttactgccag ccaccatgaa tattgtacgg taccataaat  16140

acttgaccac ctgtagtaca taaaaaccca atccacatca aaaccccctc cccatgctta  16200

caagcaagta cagcaatcaa ccctcaacta tcacacatca actgcaactc caaagccacc  16260

cctcacccac taggatacca acaaacctac ccacccttaa cagtacatag tacataaagc  16320

catttaccgt acatagcaca ttacagtcaa atcccttctc gtccccatgg atgacccccc  16380

tcagataggg gtcccttgac caccatcctc cgtgaaatca atatcccgca caagagtgct  16440

actctcctcg ctccgggccc ataacacttg ggggtagcta aagtgaactg tatccgacat  16500

ctggttccta cttcagggtc ataaagccta aatagcccac acgttcccct taaataagac  16560

atcacgatg                                                          16569

 

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>用于检测3.4kb mtDNA缺失序列的正向引物

 

<400>9

cccactcatc acctaaacctac            22

 

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>针对3.4kb缺失序列的反向引物

 

<400>10

ggtaggagtc aggtagttag              20