一种检测膜联蛋白A3表达水平的方法

摘要

本发明一般地涉及化疗药物耐药性领域，具体地，涉及如下方面：一种检测铂类化疗药物耐药肿瘤细胞培养基上清中膜联蛋白A3表达水平的方法、一种调节肿瘤细胞膜联蛋白A3外泌量的方法、一种评估肿瘤患者对铂类化疗药物耐药性的方法、一种调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞释放铂的方法、一种调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞中DNA与铂结合的方法、以及一种调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞中囊泡数量的方法。

说明书

技术领域

本发明一般地涉及化疗药物耐药性领域，具体地，涉及如下方面：一种检测铂类化疗药物耐药肿瘤细胞培养基上清中膜联蛋白A3(Annexin A3)表达水平的方法、一种调节肿瘤细胞膜联蛋白A3外泌量的方法、一种评估肿瘤患者对铂类化疗药物耐药性的方法、一种调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞释放铂的方法、一种调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞中DNA与铂结合的方法、以及一种调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞中囊泡数量的方法。

背景技术

卵巢癌是妇科肿瘤首位致死性疾病，晚期患者的5年生存率始终徘徊在15％-20％，肿瘤细胞对于铂类化疗药物产生耐药性是造成这一状况的主要原因之一。铂类化疗药物包括顺铂、卡铂、草酸铂、奈达铂、乐铂等，是目前最常用的治疗卵巢癌的一线化疗药物，也是治疗其它实体肿瘤包括乳腺癌、肺癌、睾丸肿瘤、头颈癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管癌等的常用药物。

铂类化疗药物与DNA结合形成交叉键，从而破坏DNA的功能不能再复制，高浓度时也能抑制RNA及蛋白质的合成。但是，铂类化疗药物在治疗上述实体肿瘤时，均出现了耐药现象，即治疗初期对于肿瘤控制良好而治疗后期便出现复发或治疗初期就无反应。

对于卵巢癌对铂类化疗药物的耐药，临床上已有明确的认识和定义。同时，对于顺铂耐药机制的研究也取得了一定的成果，如MDR-1，LRP-1，MRP-1，GST-pi等已成为众所周知的耐药相关基因。

但众多的研究结果表明，多种耐药相关基因在卵巢癌中的表达并不能良好地预测肿瘤地耐药和预后，mRNA的丰度与其相应的蛋白水平具有不一致性可能是主要原因之一。DNA是遗传信息的承载者，蛋白质才是功能的执行者。本发明人通过比较蛋白质组学技术，对铂类化疗敏感细胞和其对应的铂类化疗耐药细胞内的蛋白质表达进行了比较，并发现了5种铂类化疗耐药相关蛋白，它们分别是膜联蛋白A3(Annexin A3)、IDHc、cofilin 1、GSTO1-1、destrin，并通过RT-PCR和Western blot技术对铂类化疗耐药和敏感细胞在RNA和蛋白质水平分别进行了验证(Yan XD，Pan LY，et al.J Proteome Res.2007，6(2)：772-780)。根据5种蛋白的差异程度，选择差异最为明显的膜联蛋白A3进行相关的铂类耐药机制探讨实验，肿瘤细胞优选卵巢癌细胞。

膜联蛋白A3是annexin超家族中的一员，具有抑制磷脂酶A2和抗凝的功能，它还可以切断inositol 1，2-cyclic phosphate形成inositol 1-phosphate，在控制细胞增殖方面发挥作用(Ross TS，etal.J Biol Chem.1991，266(14)：9086-9092.)。膜联蛋白A3在一定Ca²⁺浓度下能够结合到囊泡的磷脂酰丝氨酸上，介导吞噬体与溶酶体的融合和颗粒消失等膜与膜之间的作用。做为钙连接蛋白，膜联蛋白A3具有一系列的胞内外功能，包括膜转运、淋巴细胞迁移、细胞运动、钙流出和信号转导。高丰量的膜联蛋白A3产生钙依赖的膨胀小泡结合阴性带电膜磷脂是膜联蛋白A3的重要功能之一(Gerke V，MossSE.Physiol.Rev.2002，82：331-371)。

一系列的实验表明，膜联蛋白A3是卵巢癌铂类化疗药物化疗耐药的机制之一。本发明人通过实验手段降低卵巢癌细胞内膜联蛋白A3的表达，卵巢癌对铂类化疗药物敏感性增加；反之，如果提高卵巢癌细胞内膜联蛋白A3的表达，卵巢癌对铂类化疗药物敏感性降低。这一实验结果在人卵巢癌组织和动物实验体内都得到了有效的验证(YanXD，Pan LY，et al.J Proteome Res.2007，6(2)：772-780；XuedongYan，Jie Yin，Huiyu Yao，Ning Mao，Yili Yang，Lingya Pan.CancerRes，2010，70(4)：OF1-9.)。

此外，在大约三分之二的结肠癌患者的癌组织内发现高水平的膜联蛋白A3集中在膜结合区域(Madoz-Gurpide J，Lopez-Serra P，etal.Mol Cell Proteomics.2006，5：1471-1483)。最近，在不同期别的前列腺癌患者的尿液中，用Western blot方法可以检测出变化含量的膜联蛋白A3，并与现在临床所用的特异性标记物前列腺特异性抗原做比较，发现膜联蛋白A3在早期提示前列腺癌更具优势。

综上所述，膜联蛋白A3具有成为人类肿瘤标志物的希望。基于膜联蛋白A3与铂类化疗药物耐药的相关性，本发明意在通过人体液中膜联蛋白A3的水平来临床评估肿瘤铂类化疗药物敏感性，这在肿瘤化疗耐药领域尚属首次。

鉴于目前临床上缺乏能够提早预示肿瘤铂类化疗药物的蛋白标志物，为充分发挥转化医学优势，本发明人在发现膜联蛋白A3这一铂类化疗药物耐药相关蛋白基础之上，进一步通过实验肯定了其铂类化疗药物耐药特异性标志物的地位，并探讨了其导致铂类化疗药物耐药的分子机制。同时在发现肿瘤细胞(例如卵巢癌细胞)分泌膜联蛋白A3的现象基础之上进一步探寻其外泌途径，并通过构建特异性检测人类膜联蛋白A3蛋白的酶联免疫吸附实验方案，成功地在卵巢癌患者血清中检测出膜联蛋白A3的存在，并在此基础上，评估了卵巢癌铂类化疗药物耐药患者血清中膜联蛋白A3水平和卵巢癌铂类化疗药物敏感患者血清中膜联蛋白A3的水平差异。通过大量的临床样本证明，血清中高水平的膜联蛋白A3能够准确地预示铂类化疗药物耐药的发生。及早地发现铂类化疗药物耐药，能够及时地改变肿瘤治疗方案，提高5年生存率，改善预后。

发明内容

本发明的一个方面是提供一种检测膜联蛋白A3表达水平的方法，所述方法使用铂类化疗药物耐药肿瘤细胞培养基上清作为被检测的样品。

其中，优选地，所述铂类化疗药物为顺铂；优选地，所述肿瘤细胞为卵巢癌细胞；优选地，所述培养基为无血清培养基，并且更优选为DMEM；优选地，所述检测优选为免疫学检测，并且更优选为Westernblot或ELISA检测。

在本发明的一个实施方案中，当使用Western blot进行检测时，所述方法包括如下步骤：

1)收集铂类化疗药物耐药肿瘤细胞培养基上清和铂类化疗药物敏感的同类型肿瘤细胞培养上清并分别进行浓缩，浓缩倍数均为75～100倍，得到两个浓缩液体；

2)检测所述两个浓缩液体中annenxin A3表达水平；

3)将所述两个浓缩液体中annenxin A3表达水平相比较，对铂类化疗药物耐药肿瘤细胞培养上清中膜联蛋白A3表达水平进行半定量。

本发明的另一个方面是提供一种调节肿瘤细胞膜联蛋白A3外泌量的方法，所述方法包括改变肿瘤细胞中annenxin A3表达水平的步骤，其中，优选地，所述铂类化疗药物是顺铂；优选地，所述肿瘤细胞为卵巢癌细胞。

在本发明的一个实施方案中，通过提高肿瘤细胞中的膜联蛋白A3表达而提高肿瘤细胞对铂类化疗药物的耐受性，优选地，通过在肿瘤细胞中表达膜联蛋白A3基因而提高细胞中的膜联蛋白A3表达，更优选地，通过使用表达正义膜联蛋白A3基因的质粒来提高所述细胞中的膜联蛋白A3的含量。

在本发明的一个实施方案中，通过减少和/或抑制肿瘤细胞中的膜联蛋白A3表达而降低肿瘤细胞对铂类化疗药物的耐受性，优选地，通过在肿瘤细胞中表达膜联蛋白A3的反义核酸和/或特异于膜联蛋白A3的核酶而减少和/或抑制细胞中的膜联蛋白A3表达，更优选地，通过使用表达反义膜联蛋白A3的DNA构建体或表达载体来降低细胞中的膜联蛋白A3的含量。

本发明的又一个方面是提供一种评估肿瘤患者对铂类化疗药物耐药性的方法，包括如下步骤：

1)检测患者体液样品中膜联蛋白A3水平；

2)若步骤1)中的膜联蛋白A3水平高于1.34ng/ml，判断肿瘤患者对铂类化疗药物耐药；

其中，优选地，所述体液为血清；优选地，步骤1)中的检测为ELISA检测。所述癌症是能够用铂类化疗药物治疗的癌症，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睾丸肿瘤、头颈癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管癌等，优选卵巢癌。

在本发明的研究中，本发明人首次运用酶联免疫吸附实验检测并定量人血清中膜联蛋白A3的含量，同时通过比较铂类化疗药物耐药患者和铂类化疗药物敏感患者血清中膜联蛋白A3表达水平，获得膜联蛋白A3预示铂类化疗药物耐药最佳敏感性和特异性的表达水平。建立临床通过检测血清膜联蛋白A3水平提示铂类化疗耐药的平台。

首先，通过进一步的实验证明膜联蛋白A3是铂类化疗药物耐药特异性标志蛋白，并通过细胞内铂含量的检测说明膜联蛋白A3引起铂类化疗药物耐药的机制可能是通过细胞内铂的释放来实现的。在通过转染正义膜联蛋白A3上调细胞内膜联蛋白A3表达水平后的铂类化疗药物敏感肿瘤细胞对顺铂的耐药性增强，但是对紫杉醇和表阿霉素的耐药性并改变，这说明膜联蛋白A3是铂类化疗药物耐药的特异性相关蛋白，膜联蛋白A3的表达水平决定了肿瘤细胞对铂类化疗药物的敏感性。一个理想的标志物是能够分泌到外周血或者人体的其它体液中，便于检测。本发明人收集铂类化疗药物敏感和耐药肿瘤细胞的培养基上清，检测肿瘤细胞是否能够外分泌膜联蛋白A3以及蛋白分泌量的调节方式。为避免高丰度蛋白影响，培养基优选无血清培养基。采用离心超滤技术，将培养基中的液体进行浓缩，采用免疫印记技术检测浓缩液中膜联蛋白A3含量并进行半定量。发现铂类化疗药物耐药的肿瘤细胞(卵巢癌细胞)外泌膜联蛋白A3的能力明显强于药物敏感细胞。改变膜联蛋白A3外泌量，可以通过改变细胞内膜联蛋白A3含量实现。这说明外液中膜联蛋白A3水平能准确地反应细胞内膜联蛋白A3的表达水平，并且能够判定细胞对铂类化疗药物敏感性。

其次，本发明人发现并验证了卵巢癌细胞膜联蛋白A3的外泌现象和膜联蛋白A3外泌途径，而一种好的预示铂类化疗药物耐药的标志物是能够在人体外分泌的体液或者血液中以便检测到这种物质，并且这种物质在人体液体中的表达水平与铂类化疗药物敏感性具有一定的相关性。使用人类膜联蛋白A3酶联免疫吸附实验试剂盒(ANXA3 ELISAkit)成功检测并定量了人血清中膜联蛋白A3的含量，正常妇女血清膜联蛋白A3平均表达水平为0.859±0.0744，卵巢癌患者血清膜联蛋白A3平均表达水平为1.6898±2.6563，两组进行Mann-Whitney检验，P＜0.0001。将所有卵巢癌患者分为铂类化疗药物耐药组和铂类化疗药物敏感组，耐药组膜联蛋白A3平均水平为2.1145±3.3833，敏感组膜联蛋白A3平均水平为1.0528±0.1178，两组比较P＝0.0003＜0.05。当膜联蛋白A3水平大于1.13ng/ml时，该蛋白预测卵巢癌铂类化疗药物耐药的敏感性达到63％，特异性80％。卵巢癌患者血清全部收集于化疗前，未受化疗影响，全部卵巢癌患者在术后都接受了铂类化疗药物为主的联合化疗。综上，肿瘤患者血清中膜联蛋白A3表达水平能够很好地预测卵巢癌患者对铂类化疗药物的敏感性。

本发明的又一个方面是提供一种调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞释放铂的方法，所述方法包括改变肿瘤细胞中annenxin A3表达水平的步骤，其中，优选地，所述铂类化疗药物是顺铂；优选地，所述肿瘤细胞为卵巢癌细胞。

本发明的又一个方面是提供一种调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞中DNA与铂结合的方法，所述方法包括改变肿瘤细胞中annenxin A3表达水平的步骤，其中，优选地，所述铂类化疗药物是顺铂；优选地，所述肿瘤细胞为卵巢癌细胞。

本发明的又一个方面是提供以及一种调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞中囊泡数量的方法，所述方法包括改变肿瘤细胞中annenxin A3表达水平的步骤，其中，优选地，所述铂类化疗药物是顺铂；优选地，所述肿瘤细胞为卵巢癌细胞。

为了更好地说明肿瘤细胞(卵巢癌细胞)能够持久地外泌膜联蛋白A3蛋白，本发明申请人运用电镜技术观察了膜联蛋白A3的外泌途径。以两种顺铂耐药卵巢癌细胞SKOV3/Cis和A2780/Cis，两种顺铂敏感卵巢癌细胞SKOV3和A2780，两种转染了膜联蛋白A3正义质粒上调顺铂敏感细胞内膜联蛋白A3表达的细胞SKOV3/Ann和A2780/Ann，两种转染了膜联蛋白A3反义质粒下调顺铂耐药细胞内膜联蛋白A3表达的细胞SKOV3/Cis/R和A2780/Cis/R为研究对象，运用免疫荧光法和免疫电镜法观察膜联蛋白A3蛋白在细胞亚微结构地分布，探讨膜联蛋白A3外泌途径。透射电镜下，观察上述顺铂敏感和耐药卵巢癌细胞亚微结构，与顺铂敏感细胞相比，发现顺铂耐药细胞胞浆内出现更多的囊泡样结构，该结构散在分布于胞浆内，表面光滑，不同于粗面内质网和高尔基体，囊泡内也没有类似线粒体样的脊，某些囊泡内还存在某些不明的颗粒物质，不同于溶酶体内的均质。延细胞膜观察囊泡，则能观察到某些囊泡离胞膜很近，有些跟胞膜融合破口，有些则已经突破胞膜外。运用透射电镜观察转染膜联蛋白A3正义质粒上调顺铂敏感细胞内膜联蛋白A3水平后，发现在敏感细胞与转染前相比胞浆内也出现了很多类似顺铂耐药细胞胞浆内的囊泡结构；相反，转染膜联蛋白A3反义质粒下调顺铂耐药细胞内膜联蛋白A3水平后，顺铂耐药细胞胞浆内囊泡则大量减少了，以上说明细胞内上调的膜联蛋白A3可以导致胞内囊泡结构的产生。运用免疫荧光技术，特异性的染色上述8种细胞胞核胞浆内的膜联蛋白A3蛋白，发现卵巢癌细胞种膜联蛋白A3主要分布于胞浆，少数分布于胞核，主要还是一种胞浆蛋白。运用免疫电镜技术，对膜联蛋白A3细胞分布进行亚细胞器定位，对上述8种细胞内膜联蛋白A3进行免疫染色，采用胶体金颗粒标记膜联蛋白A3蛋白，发现膜联蛋白A3大量分布于胞浆内膜结构上，包括透射电镜下发现的囊泡的膜表面，同时在个别囊泡，特别是靠近胞膜的囊泡内可以发现膜联蛋白A3的存在，说明膜联蛋白A3通过囊泡的形式外泌。

上述的调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞释放铂的方法、调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞中DNA与铂结合的方法、以及调节铂类化疗药物耐药肿瘤细胞中囊泡数量的方法，都包括改变肿瘤细胞中annenxinA3表达水平的步骤，该步骤可以通过下面的方法实现，例如：

通过提高肿瘤细胞中的膜联蛋白A3表达实现，优选地，通过在肿瘤细胞中表达膜联蛋白A3基因而提高细胞中的膜联蛋白A3表达，更优选地，通过使用表达正义膜联蛋白A3基因的质粒来提高所述细胞中的膜联蛋白A3的含量；或者

通过减少和/或抑制肿瘤细胞中的膜联蛋白A3表达实现，优选地，通过在肿瘤细胞中表达膜联蛋白A3的反义核酸和/或特异于膜联蛋白A3的核酶而减少和/或抑制细胞中的膜联蛋白A3表达，更优选地，通过使用表达反义膜联蛋白A3的DNA构建体或表达载体来降低细胞中的膜联蛋白A3的含量。

在本发明的所有方面，如果适用的话，优选的是，所述肿瘤细胞包括但不限于如下癌症的细胞，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睾丸肿瘤、头颈癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管癌等的细胞，优选卵巢癌细胞。

在本发明的所有方面，如果适用的话，优选的是，所述铂类化疗药物包括但不限于顺铂、卡铂、草酸铂、奈达铂、乐铂等，优选的是顺铂。

在本发明中，术语“耐药细胞”是指相对于同类亲本细胞，不易接受一些刺激而发生相应改变的细胞。本发明中对应为不易接受铂类化疗药物刺激发生相应改变的细胞。

在本发明中，术语“敏感细胞”是指容易接受一些刺激而发生相应改变的细胞。本发明中对应为易对铂类化疗药物刺激发生相应改变的细胞。

在本发明中，术语“耐药性”是指随时间延长药物效果降低，或者需加大剂量才能保证药效不减。本发明指细胞对铂类化疗药物的耐药性，通常用药物半数致死量(IC50)和耐药指数(RI)来表示。

在本发明中，对于术语“敏感性”，当与特异性相提时或者作为统计学上的概念时，是指化验检查结果为“真阳性”的百分率；其它情况则指与“耐药性”相对的概念。

在本发明中，术语“特异性”是指化验检查结果为“真阴性”的百分率。

在本发明中，如果没有特殊说明，SKOV3和A2780为转染空质粒的SKOV3和A2780，SKOV3/Cis是转染空质粒的SKOV3顺铂耐药细胞亚系，A2780/Cis是转染空质粒的A2780顺铂耐药细胞亚系，上述空质粒为pcDNA3.1(+)质粒。

发明的有益效果

本发明首次通过铂类化疗药物耐药肿瘤细胞培养基上清实现了膜联蛋白A3表达水平的检测，并且首次给出了评估肿瘤患者对铂类化疗药物敏感性的方法，使得能够及早地发现铂类化疗药物耐药，及时地改变肿瘤治疗方案，提高5年生存率，并改善预后。

附图说明

在下面的附图中，SKOV3和A2780为转染空的pcDNA3.1(+)质粒的SKOV3和A2780细胞；SKOV3/Cis是转染空的pcDNA3.1(+)质粒的SKOV3顺铂耐药细胞亚系，A2780/Cis是转染空的pcDNA3.1(+)质粒的A2780顺铂耐药细胞亚系；SKOV3/Ann和A2780/Ann细胞系分别是SKOV3和A2780转染正义膜联蛋白A3质粒后获得的稳定转染克隆；SKOV3/Cis/R和A2780/Cis/R是SKOV3/Cis和A2780/Cis转染反义膜联蛋白A3质粒后获得的稳定转染克隆。

图1：八种卵巢癌细胞内的铂浓度比较，^*P＜0.01，^**P＜0.001。

图2：SKOV3、SKOV3/Ann细胞Pt排出率比较。

图3：八种卵巢癌细胞Pt-DNA浓度比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图4：卵巢癌细胞培养基上清中膜联蛋白A3检测。Parental代表亲本细胞，即未转染质粒的肿瘤细胞；Transfectant代表转染质粒后的肿瘤细胞。图A：SKOV3和A2780均转染正义膜联蛋白A3质粒，胞内膜联蛋白A3水平上调；图B：SKOV3/Cis和A2780/Cis均转染反义膜联蛋白A3质粒，胞内膜联蛋白A3表达水平下调；β-actin为肌动蛋白，为本实验内参照。

图5：A：顺铂敏感卵巢癌细胞(SKOV3和A2780)及其顺铂耐药细胞(SKOV3/Cis和A2780/Cis)透射电镜下亚微结构的改变(50,000x)。B：延细胞膜观察胞浆内增多的囊泡结构与细胞膜的关系(100,000x)。C：转染膜联蛋白A3正、反义质粒后，卵巢癌细胞胞浆内囊泡的变化。箭头所示为胞浆内异常囊泡结构。

图6：免疫荧光技术检测膜联蛋白A3在卵巢癌细胞中的定位。

图7：免疫电镜技术检测膜联蛋白A3亚细胞器定位(50,000x和100,000x对比观察)。A：对照(PBS代替膜联蛋白A3抗体)；B、C、D显示的是膜联蛋白A3在囊泡表面及囊泡内的定位。胞浆内的黑色颗粒为胶体金颗粒，每一个颗粒都代表膜联蛋白A3蛋白；小箭头所指示的是膜联蛋白A3蛋白所在的位置。大箭头指示囊泡。100,000x图为50,000x图内方框的放大图。

图8：膜联蛋白A3在耐药细胞SKOV3/Cis培养上清中exosome(细胞内囊泡释放到细胞外的一种存在形式)的表达。图A：透射电镜观察exosome的形态，多为圆形或椭圆形，直径在40-100nm之间；图B和C：免疫电镜观察膜联蛋白A3在exosome中的表达；图D：DMEM1代表正常SKOV3/Cis培养上清浓缩液(浓缩倍数75x)，DMEM2代表去除了exosome的SKOV3/Cis培养上清浓缩液(浓缩倍数75x)，sucrose代表提取exosome过程中的exosome上层蔗糖液，Hsp70为exosome内参照(exosome多表达Hsp70)。

图9：图A：30例化疗耐药卵巢癌患者、20例化疗敏感卵巢癌患者和30例正常妇女血清中膜联蛋白A3的表达水平散点图；图B：将血清中膜联蛋白A3的水平大于1.13ng/ml的卵巢癌患者列为A组，小于1.13ng/ml的卵巢癌患者列为B组，绘制Kaplan Meier曲线，两组的无铂间期(第一疗程的含铂类化疗药物的联合化疗结束后到卵巢癌复发的时间)长度存在显著统计学差异(P＝0.009＜0.05)。IQR：四分位间距数。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：膜联蛋白A3调节卵巢癌上皮细胞铂类化疗药物耐药机制体外研究

1.实验方法

1)细胞系及其培养条件

人上皮性卵巢癌细胞SKOV3细胞系购于中国医学科学院基础医学细胞中心，SKOV3/Cis是本发明人诱导的SKOV3顺铂耐药细胞亚系(可参考闫雪冬，张明伟，潘凌亚.基础医学与临床，2006，26(7)：739-744)。本实验还使用A2780及其顺铂耐药细胞亚系A2780/Cis(可以参考LuanYZ，Li L.et al.Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2004，39(6)：403-407.)。这些细胞均转染有空的pcDNA3.1(+)质粒。SKOV3/Ann和A2780/Ann细胞系分别是SKOV3和A2780转染正义膜联蛋白A3质粒后获得的稳定转染克隆，SKOV3/Cis/R和A2780/Cis/R是SKOV3/Cis和A2780/Cis转染反义膜联蛋白A3质粒后获得的稳定转染克隆(可参考Xuedong Yan，Jie Yin，Huiyu Yao，Ning Mao，Yili Yang，Lingya Pan.Cancer Res，2010，70(4)：OF1-9.)，所有稳定转染克隆都经过Western blot技术验证过。同时采用SKOV3和A2780转染空质粒的细胞(可参考Xuedong Yan，Jie Yin，Huiyu Yao，Ning Mao，Yili Yang，Lingya Pan.Cancer Res，2010，70(4)：OF1-9.)作为对照。

上述所有细胞系都在含10％胎牛血清的DMEM(HG)的培养基中贴壁生长，置于37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养，生长至80％密度时采用0.25％胰酶消化传代。

2)药物敏感实验

检测细胞对顺铂(Cisplatin，CDDP)、卡铂(Carboplatin，CBP)、紫杉醇(Taxol)和表阿霉素(epirubicin)的敏感性。

取指数生长期细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，按2000/孔/100μL，每种药物每个浓度设6个平行孔，对照孔12个，不加药物，其中6个孔为阴性对照(加入细胞、不加药物)，6个孔为空白对照(只加培养基)。37℃、5％CO₂培养24小时后加入化疗药物，稀释成7个梯度，继续培养72小时，加入5mg/mL MTT20μL，37℃、5％CO₂继续培养4小时，控净培养基，加100μL裂解液(含20％SDS，50％N-N二甲基甲酰胺，pH 4.7)，过夜，全自动酶标仪以540nm测定吸光值(OD值)，可求算每种药物浓度吸光值的平均值，计算细胞存活率及抑制率，根据药物浓度和抑制率，使用SPSS11.5软件计算IC50(抑制50％细胞生长的药物浓度)及耐药指数(RI)。

抑制率(inhibition rate)＝[(OD对照-OD实验)/OD对照]×100％

RI＝耐药细胞系的IC50/敏感细胞系的IC50

3)细胞内铂(Pt)浓度测定

待各细胞长至对数生长期，消化、计数，以2×10⁶细胞种至100mm培养皿，24小时后加入CDDP至终浓度10μM，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时(对照组不加药物)，弃去培养基，PBS洗3次，用细胞刮将细胞刮下，收集至Ep管中。使用50-100μL 70％硝酸裂解细胞，置65℃水浴2小时(此时取出部分裂解产物利用BCA法检测蛋白浓度)，向裂解产物中加入蒸馏水，将其稀释至5％的硝酸浓度。利用电感偶合等离子质谱检测细胞内的铂(Pt)含量。为检测CDDP排出情况，将细胞加入CDDP至终浓度10μM，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时，弃去培养基，换成无药培养基孵育2小时，如前步骤收集和处理细胞，检测Pt含量。Pt排出率＝(1-无药培养2小时细胞内Pt浓度/加药24小时细胞内Pt浓度)×100％。

4)DNA结合Pt的检测

待各细胞长至对数生长期，消化、计数，以2×10⁶细胞种至100mm培养皿，24小时后加入CDDP至终浓度10μM，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时(对照组不加药物)，弃去培养基，PBS洗3次，用细胞刮将细胞刮下，收集至Ep管中。按照Qiagen DNA提取试剂盒说明书提取DNA，将300μL Buffer FG1裂解细胞，吹打混匀，加入300μL Buffer FG2/protease，颠倒混匀3次，置65℃水浴10分钟，加入600μL异丙醇，颠倒混匀，直至出现DNA线状或块状的沉淀，10000g离心3分钟，弃上清，将Ep管倒置在滤纸上吸干水分，加入600μl 70％乙醇，涡旋5s，10000g离心3分钟，弃上清，将Ep管倒置在滤纸上吸干水分，空气风干DNA沉淀直至液体挥发为止，加入50-100μL 70％硝酸裂解细胞，置65℃水浴2小时(此时取出部分裂解产物利用分光光度计检测DNA浓度)，向裂解产物中加入蒸馏水，将其稀释至5％的硝酸浓度。利用电感偶合等离子质谱检测与DNA结合的Pt含量。

5)统计学分析

实验数据使用SPSS11.5统计软件处理，经t检验和方差检验(Oneway Anova)进行统计分析。

2.实验结果

1)细胞对顺铂、卡铂、紫杉醇、表阿霉素的耐药性检测

CDDP耐药细胞SKOV3/Cis和A2780/Cis，不仅对CDDP耐药，而且对CBP也产生了相同的耐药性(表1)。另外检测了各转染细胞对紫杉醇和表阿霉素的敏感性。我们可以看到，与敏感细胞SKOV3和A2780相比，耐药细胞SKOV3/Cis和A2780/Cis不仅对铂类产生了耐药，而且对紫杉醇和表阿霉素出现了交叉耐药，他们的RI分别显示在表2中。而将膜联蛋白A3过表达或不表达的细胞与其对照(转染空质粒的细胞)相比，对紫杉醇和表阿霉素的敏感性无明显改变(表2)。

表1 铂类耐药细胞对顺铂和卡铂的耐药性比较

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与亲本细胞相比

表2稳定转染后细胞及其对照细胞对紫杉醇、表阿霉素的耐药性。

2)Pt浓度的测定

各细胞经10μM CDDP作用24小时后，检测细胞内的Pt浓度。与转染空质粒的敏感细胞(SKOV3、A2780)相比，在膜联蛋白A3过度表达的细胞(SKOV3/Ann，A2780/Ann)中，Pt浓度显著降低(P＜0.001，P＝0.002)。与转染空质粒的耐药细胞(SKOV3/Cis、A278/Cis)相比，在膜联蛋白A3表达下调的细胞(SKOV3/Cis/R、A2780/Cis/R)中，Pt浓度明显升高(P＝0.008，P＝0.009)(图1)。在检测Pt排出率的实验中，SKOV3细胞为(31.4±4.0)％，SKOV3/Ann细胞为(59.2±2.2)％，SKOV3/Ann细胞中Pt排出明显增加(P＜0.001)(图2)。另外，在检测Pt-DNA结合的结果中，发现在SKOV3/Ann、A2780/Ann中，与DNA结合的Pt浓度降低(P＝0.007，P＝0.011)。在SKOV3/Cis/R、A2780/Cis/R中，与DNA结合的Pt浓度明显升高(P＝0.003，P＝0.026)(图3)。

3.结论

细胞内药物蓄积减少是造成铂类耐药的重要机制之一，而膜联蛋白A3的一个重要功能是介导膜与膜之间的接触，它可以通过磷脂酰丝氨酸结合到质膜上，使细胞膜的通透性发生改变，并且参与细胞的吞噬、分泌等活动。因此，我们检测了膜联蛋白A3过表达和膜联蛋白A3下调的细胞中是否存在铂的蓄积改变。实验结果表明，在膜联蛋白A3过表达细胞中，铂浓度明显减少，Pt-DNA结合明显减少，而在膜联蛋白A3下调的细胞中获得了与此相一致的结果，说明细胞内铂类药物蓄积减少是膜联蛋白A3导致铂类耐药的重要因素。铂类药物通过与DNA形成加合物来损伤DNA，错配修复系统识别加合物可以导致p53活化，激活MAPK通路，诱导BAX表达，最终导致凋亡(Hartwell LH，et al.Science，1994，266(5192)：1821-1828)。本实验也证实了这一点。与转染了空的pcDNA3.1(+)质粒的亲本细胞相比较，在膜联蛋白A3过表达细胞中，给予顺铂处理后，铂浓度明显减少，Pt-DNA结合明显减少，p53增加的程度小于亲本细胞，因此凋亡减少，导致耐药。由于临床治疗中CDDP化疗剂量的血浆峰值浓度为10μM，因此在这部分实验中CDDP的作用浓度均采用此剂量。

实施例2：上皮性卵巢癌细胞外泌膜联蛋白A3的鉴定

1.实验方法

1)细胞系与细胞培养

同实施例1。

2)上皮性卵巢癌细胞系培养基上清的收集和浓缩

取2×10⁵个细胞接种于25cm²细胞培养瓶内贴壁生长，生长至70％的时候更换无血清DMEM，约每1×10⁶细胞给予5ml培养基，置细胞培养箱内继续培养48小时，然后将此无血清DMEM收集置10ml离心管内，1000g离心10分钟，以去除DMEM中的有形成分，离心后小心收集上清，置于Amicon Ultra-15超滤管(美国Millipore公司)内，3000g水平离心15分钟，收集浓缩后的液体于Ep管内，-70℃保存。

3)Western blot半定量检测培养基内膜联蛋白A3的含量

a.检测样品的准备

经过浓缩的细胞培养基上清和细胞内总蛋白为本实验待测样品，培养基上清样品与laemmli上样缓冲液(美国Bio-Rad公司)2∶1混合制成上样样品，置于冰水浴中，体积大约20微升为好。取对数生长期的非耐药和耐药细胞，胰酶消化，1500rpm离心5分钟，弃去上清，加入无菌PBS(pH 7.4)重悬，进行细胞计数，1500rpm离心5分钟，弃上清，用冷PBS洗细胞两次，吸净上清。约10⁶个细胞加laemmli裂解液(美国Bio-Rad公司)，在裂解细胞时，其它细胞处于冰水浴。加入裂解液后，99℃煮沸10分钟，10000g、4℃离心10分钟，取出后冰水浴。取出测定蛋白浓度的样品后，将剩余的样品每100μl加入2-ME(2-巯基乙醇)5μl，10000g、4℃离心10分钟，-20℃保存。

b.BCA法测细胞内总蛋白浓度

取BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce)A液、B液以50∶1(v∶v)混合，取上述样品加入500μl AB混合液中，混匀，空白对照为2μl裂解液加入到500μl AB混合液，37℃水浴30分钟，以空白对照调零，在Smartspec^TM plus spectrophotometer(Bio-Rad)测562nm波长的OD值。使用Excel绘制标准曲线，求算样品浓度。

c.SDS-PAGE电泳

制胶：先制备10％分离胶5ml：去离子水1.9ml，30％丙烯酰胺1.7ml，1.5％Tris 1.3ml(pH 8.8)，10％SDS 0.05ml，10％过硫酸胺0.05ml，TEMED 0.002ml。待30分钟分离胶凝固后，再配制5％浓缩胶2ml：去离子水1.4ml，30％丙烯酰胺0.33ml，1.0％Tris0.25ml(pH 6.8)，10％SDS 0.02ml，10％过硫酸胺0.02ml，TEMED0.002ml。加样：待浓缩胶凝固后，取20μl浓缩培养基上样样品、30μg细胞内总蛋白加入样品槽中。电泳：加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，0.1％SDS)80-100v，电泳2小时。

d.转膜

制备转移缓冲液：48mM Tris-HCl，39mM甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇。剪好6张与凝胶大小一致的滤纸和一张PVDF膜(美国Millipore公司)，滤纸置于转移缓冲液中浸泡15分钟，PVDF膜用甲醇激活10秒后再浸泡于转移缓冲液中。滤纸、凝胶和PVDF膜按照三层滤纸-PVDF膜-凝胶-三层滤纸的次序叠放，整个操作过程在转移缓冲液中完成，注意不能有气泡。右下角标记。270mA、冰水浴中电转移1小时。

e.免疫印迹

取下转上蛋白的PVDF膜，蛋白面朝上，TBST(200mM Tris-HCl，1.5mM NaCl，0.05％Tween-20)摇洗3次，每次5分钟后，在含5％脱脂奶粉的TBST中封闭1小时后取出，加入封闭液配制的一抗(兔抗人膜联蛋白A3特异性多克隆抗体)，4℃轻轻摇晃过夜。以TBST摇洗3次，每次5分钟，之后加入封闭也配制的HRP标记的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体)，室温孵育1小时，TBST摇洗三次，将化学发光底物液ECL(美国Thermo公司)A、B液按体积1∶1混合，将PVDF膜作用5分钟，暗示X光片曝光显影。

2.实验结果

肿瘤细胞无血清培养基蛋白含量很低，上清经过超滤管浓缩之后，体积可以由15ml浓缩到500μl，这样大大提高了培养基中蛋白的含量，对通过Western blot方法检测出膜联蛋白A3提供了基础。运用Western blot技术成功的在浓缩的培养基上清中检测出膜联蛋白A3，并对上述8种卵巢癌细胞系的培养基上清中膜联蛋白A3进行半定量。半定量比较主要是比较免疫印迹膜联蛋白A3蛋白条带的粗细。在上述2种顺铂耐药卵巢癌细胞系培养基上清和细胞内膜联蛋白A3表达水平均高于其对应的顺铂敏感细胞系，尤其是上清中的膜联蛋白A3表达水平升高更为明显。在转染膜联蛋白A3反义质粒下调顺铂耐药细胞内膜联蛋白A3表达水平后(SKOV3/Cis/R和A2780/Cis/R细胞系)，细胞培养基中膜联蛋白A3水平则明显下降。相反，在转染了正义膜联蛋白A3质粒的SKOV3/Ann和A2780/Ann细胞的培养基中膜联蛋白A3表达水平明显上调(图4)。

3.结论

卵巢癌细胞培养基上清中含有一定量的膜联蛋白A3，说明卵巢癌细胞具有分泌膜联蛋白A3的功能，通过半定量比较，说明卵巢癌细胞膜联蛋白A3外泌量的多少与细胞内膜联蛋白A3的含量成正相关关系，培养基中高水平的膜联蛋白A3能够准确地反应卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。基于以上，膜联蛋白A3具有成为有效的预示铂类化疗药物耐药的生物学标志物的基础。

实施例3：膜联蛋白A3在卵巢癌细胞中的外泌途径

1.实验方法

1)细胞系及培养

本实验所用细胞及其培养条件与“实施例二”完全一致，此不重复叙述。

2)细胞免疫荧光及其激光共聚焦成像

以2×10⁴细胞种至已铺好玻片的24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养过夜后，弃去培养基，PBS洗3次，4％多聚甲醛固定20分钟，PBS洗3次，0.5％TritonX-100透膜20分钟，PBS洗3次，2％BSA封闭30分钟，1∶50兔抗人膜联蛋白A3多克隆抗体(一抗)孵育，4℃过夜。PBS洗3次，山羊抗兔FITC二抗孵育1小时，PBS洗3次后1∶1000含0.1％RNase的PI染色液室温孵育20分钟，PBS洗3次，利用含90％甘油的PBS封片。在Radiance 2100激光共聚焦显微镜下观察，拍照。

3)透射电镜

a.对数期生长的细胞(细胞总数≥1×10⁶)，弃培养基，PBS洗涤2此。

b.加入PBS 10ml，送军事医学科学院(北京海淀区太平路27号)仪器检测中心电镜室制备细胞透射电镜标本。

c.标本制作过程如下：细胞长至对数生长期，PBS洗两遍，用细胞刷将细胞刮下，1000g离心10分钟，3％戊二醛(1/15M PBS pH 7.4)，4℃下固定2小时，4℃下1/15M PBS+0.19M蔗糖缓冲液漂洗15分钟。乙醇4℃下梯度脱水(50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、90％乙醇+90％丙酮、90％丙酮、100％丙酮各10分钟)，100％丙酮在室温下脱水10分钟。100％丙酮∶包埋剂(1∶1)室温浸透30分钟，纯包埋剂浸透过夜。进行包埋：聚合时间为35℃，12小时：45℃，12小时；60℃，24小时。ULTRACUT E/S型切片机(美国RMC公司)进行超薄切片，醋酸铀染液避光染色10分钟，柠檬酸铅染色10分钟。

d.电压75kV，EM400T电镜(荷兰Philips公司)观察，选择×8000、×22000电镜照相，观察细胞亚微结构。

4)免疫电镜

a.对数期生长的细胞(细胞总数≥1×10⁶)，弃培养基，PBS洗涤2次。

b.加入PBS 10ml，送中国医学科学院电镜室制备细胞超薄切片(70-80nm厚)。过程如下：细胞长至对数生长期，PBS洗两遍，用细胞刷将细胞刮下，1000g离心10分钟，4％磷酸多聚甲醛和0.1％戊二醛1∶1混合的固定液，4℃下固定4-6小时，经乙醇梯度脱水后采用特殊的白树脂(美国Sigma公司)包埋细胞。待包埋剂凝聚后，ULTRACUT E/S型切片机(美国RMC公司)进行超薄切片。

c.免疫染色：去离子水冲洗超薄切片三次，置于1％BSA的封闭液中封闭30分钟，1∶200兔抗人膜联蛋白A3多克隆抗体4℃湿盒中孵育过夜，0.1M PBS清洗3次，1∶40胶体金颗粒标记的驴抗兔二抗室温孵育1小时，去离子水清洗3次。

d.染色观察：免疫染色后，细胞超薄切片再经过醋酸铀染液避光染色10分钟，柠檬酸铅染色10分钟。置电镜下观察胶体金颗粒标记的膜联蛋白A3蛋白，50000×电镜下照相。

5)SKOV3/Cis细胞系培养上清中exosome提取、观察以及膜联蛋白A3表达鉴定

a.取约5×10⁶个SKOV3/Cis细胞平均接种于2个T75细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，更换为无血清培养基(DMEM)，置5％CO₂细胞培养箱中培养48小时。收集培养基上清大约60ml。

b.将收集来的培养基上清于1000×g，10min离心，去除细胞及碎片成分，收集离心后取上清。再将上清置于Centricon Plus-20filter capsule(Millipore，USA)中，4000×g离心30分钟，最终将60ml上清浓缩为1.5ml浓缩液，再将浓缩液以PBS稀释至15ml，置于100kDa Amicon Ultra-15(Milipore，USA)中，4000×g离心30分钟，浓缩为200μl浓缩液。

c.收集200μl浓缩液，PBS稀释至5ml，并转移入5ml超离管中，同时以300μl 30％sucrose/D₂O垫底，100,000×g，4℃离心40分钟，收集350μl底部葡萄糖垫，并以PBS稀释至15ml，再次用100kDaAmicon Ultra-15(Milipore，USA)浓缩至200μl(此为含exosome的液体)。同时收集上层350μl低浓度葡萄糖液(后面用“sucrose”表示此样本)，作为无exosome的对照液体，-20℃保存，用于westernblot分析。将100μl含exosome的液体保存在-20℃冰箱中。低浓度葡萄糖液和含exosome液体在western blot分析时，先将液体样本按1∶1比例于laemmli上样缓冲液(美国Bio-Rad公司)混合，检测sucrose和exosome中膜联蛋白A3的表达(western blot方法已在实施例2中详细描述，此不重复描述)。

d.此200μl浓缩液中含有大量exosome，将浓缩液滴至炭膜覆盖的400目镍网上，自然晾干，此时exosome已吸附至镍网上，1％戊二醛固定exosome，再以1％醋酸双氧铀负染色，于透射电镜下观察exosome形态。

e.免疫电镜观察时，先将exosome吸附至镍网后，PBS反复冲洗3次，1∶200兔抗人膜联蛋白A3多克隆抗体4℃湿盒中孵育过夜，0.1MPBS清洗3次，1∶40胶体金颗粒标记的驴抗兔二抗室温孵育1小时，其后再以1％戊二醛固定，透射电镜下观察。

6)无exosome的细胞培养基上清收集

a.将5×10⁶个SKOV3/Cis细胞平均接种于2个T75细胞培养瓶中，待细胞贴壁后更换无血清培养基，继续培养48小时后收集培养基上清约30ml。

b.将收集来的培养基上清1000×g离心10分钟，收集上清30ml。

c.将收集的上清平分两份，一份运用100kDa Amicon Ultra-15(Millipore，USA)在4000×g条件下离心30分钟，收集下层非浓缩液体，体积大约15ml，再将15ml液体运用10kDa AmiconUltra-15(Millipore，USA)在同样条件下离心30分钟，收集上层约200μl的浓缩液，此浓缩液便是去除了exosome的上清，该样本命名为DMEM2。

d.平分的另外一份上清运用10kDa Amicon Ultra-15(Millipore，USA)在4000×g条件下离心30分钟，收集上层大约200μl的浓缩液体，此液体为含有exosome的浓缩上清，该样本命名为DMEM1。

e.所有样本保存在-20℃冰箱中，将其1∶1与laemmli上样缓冲液(美国Bio-Rad公司)混合，运用western blot方法检测膜联蛋白A3的表达水平(western blot实验步骤可以参考实施例2)。

2.实验结果

透射电镜下，观察上述顺铂敏感和耐药卵巢癌细胞亚微结构，与顺铂敏感细胞相比，发现顺铂耐药细胞胞浆内出现更多的囊泡样的结构，该结构散在分布于胞浆内，表面光滑，不同于粗面内质网和高尔基体，囊泡内也没有类似线粒体样的脊，某些囊泡内还能看见存在某些不明的颗粒物质，不同于溶酶体内的均质。延细胞膜观察囊泡，则能观察到某些囊泡离胞膜很近，有些跟胞膜融合破口，有些则已经突破胞膜外(图5A～B)。运用透射电镜观察转染膜联蛋白A3正义质粒上调顺铂敏感细胞内膜联蛋白A3水平后，发现在敏感细胞与转染前相比胞浆内也出现了很多类似顺铂耐药细胞胞浆内的囊泡结构；相反，转染膜联蛋白A3反义质粒下调顺铂耐药细胞内膜联蛋白A3水平后，顺铂耐药细胞胞浆内囊泡则大量减少了(图5C)，以上说明细胞内上调的膜联蛋白A3可以导致胞内囊泡结构的产生。运用免疫荧光技术，特异性的染色上述8种细胞胞核胞浆内的膜联蛋白A3蛋白，发现卵巢癌细胞种膜联蛋白A3主要分布于胞浆，少数分布于胞核，主要还是一种胞浆蛋白(图6)。运用免疫电镜技术，对膜联蛋白A3细胞分布进行亚细胞器定位，对上述8种细胞内膜联蛋白A3进行免疫染色，采用胶体金颗粒标记膜联蛋白A3蛋白，发现膜联蛋白A3大量分布于胞浆内膜结构上，包括透射电镜下发现的囊泡的膜表面，同时在个别囊泡，特别是靠近胞膜的囊泡内可以发现膜联蛋白A3的存在(图7)，说明膜联蛋白A3通过囊泡的形式外泌。运用western blot法，检测DMEM1和DMEM2之间膜联蛋白A3表达含量差异，说明exosome携带了大量膜联蛋白A3蛋白。同时检测exosome和sucrose之间膜联蛋白A3水平，以说明exosome的纯化度(图8)。

3.结论

膜联蛋白A3存在于卵巢癌细胞的胞浆和胞核内，但主要存在于胞浆内，是一种胞浆蛋白。上调的膜联蛋白A3能够在卵巢癌细胞胞浆内产生囊泡结构，它既不像内质网也不像高尔基体和溶酶体，免疫电镜验证了该囊泡表面和囊泡内存在膜联蛋白A3蛋白，沿细胞膜观察囊泡，可以发现囊泡有和细胞膜融合和突出细胞的趋势，由此可以说明膜联蛋白A3通过此途径外泌出细胞。该分泌机制为膜联蛋白A3作为一种分泌蛋白成为临床预示卵巢癌铂类化疗药物耐药生物学标志物，提供了更为坚实的理论基础。

实施例4：人外周血中膜联蛋白A3表达水平的检测

1.实验方法

1)临床病例资料收集

2007-2009年在中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院接受体检的健康妇女(30例)和在妇产科治疗卵巢癌患者(50例)术前(或术后化疗前)均是本实验的研究对象。健康体检妇女需满足一下条件：(1)处于育龄期、围绝经期和绝经期妇女；(2)未患有任何慢性疾病、感染性疾病和良恶性肿瘤疾病；(3)近一周未服用任何药物及保健品药物。健康妇女血清收集之后置于Ep管中，保存于-70℃，待检测。入选本实验的卵巢癌患者需满足：(1)术后组织病理确诊为原发性卵巢上皮性恶性肿瘤；(2)第一次肿瘤细胞减灭术后，所有患者均接受了正规的以铂类化疗药物为主(顺铂或卡铂)的单药或联合化疗；(3)术后和第一次化疗结束后，所有患者均接受了正规随访，随访时间约第一次化疗完成后6个月到1年。患者术后第一年每月随访1次，第二年每3个月随访一次，第三年以后每6个月随访一次。每次随访均检测外周血CA125，妇科检查，以及相应的影像学检查，必要时活检。根据入组标准纳入研究，收集患者的年龄、病理学分型、分期、分级，化疗情况(表3)。铂类化疗药物耐药定义为经过满意的肿瘤细胞减灭术和规范化疗后达到完全缓解(CR)，持续时间＜6个月；化疗期间肿瘤的最好疗效为部分缓解(PR)、稳定(SD)或进展(PD)者。铂类化疗药物敏感定义为经过满意的肿瘤细胞减灭术和规范化疗后达到临床完全缓解(CR)，持续时间＞6个月。根据以上标准，50例卵巢癌患者经过随访有30名患者符合耐药标准，剩余20名列为敏感组(表3)。

表3 50例卵巢癌患者临床病例资料统计。a和b：病理分期和临床分期均根据国际统一标准进行分期。

2)ELISA(酶联免疫吸附实验)

a.实验标本：符合上述入组条件的健康妇女和卵巢癌患者的血清为本实验的检测对象。采集血标本于5毫升采集管内，待血自然凝固后，3000g离心5分钟，收集上清(血清)，于Ep管内，保存于-70℃。

b.采用人膜联蛋白A3 ELISA检测试剂盒(美国Cusabio公司)定量检测血清中膜联蛋白A3表达水平。试剂盒内含有酶标板、标准品、样品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、底物溶液、洗涤液和终止液。具体按照ELISA检测试剂盒说明书操作，步骤如下：

(1)稀释标准品。浓度依次为0ng/ml、0.4ng/ml、0.8ng/ml、1.6ng/ml、3.2ng/ml、6.2ng/ml、12.5ng/ml和25ng/ml，标准品在实验前15分钟配制；

(2)加样。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。待测样品和标准品加入已经包埋有annxin A3抗体的酶标板内，每孔100微升，空白孔内加入100微升标准品稀释液，每孔均设复孔。加样完毕将酶标板覆膜，置于湿盒中，37℃反应120分钟；

(3)标记。弃去液体，甩干，不用洗涤，每孔加入生物素标记抗体工作液100微升，37℃，60分钟；再弃去液体，甩干，洗涤液洗板3次，每次2分钟，每孔200微升，甩干，加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100微升，37℃，60分钟；

(4)显色。温育完毕，弃去液体，甩干，洗板5次，依次每孔加入底物溶液90微升，避光37℃显色30分钟后，孔内液体颜色部分变蓝，每孔依次加入50微升终止液，此时液体转为黄色；

(5)检测。加入终止液后，15分钟内上酶标仪检测，吸收波长设为450nm，记录每孔OD值。

c.数据处理：运用Excel以OD值为Y轴，浓度的1g值为X轴制作标准曲线，获得趋势线方程式，计算出每个样本平均OD值后带入公式便可得出每个样本内膜联蛋白A3的浓度值。

3)统计学分析

数据采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析，所有数据按照正常组、卵巢癌组(分铂类化疗药物耐药组和敏感组两组)制作膜联蛋白A3表达散点图，组间差异比较运用Mann-Whitney分析，当P＞0.05时，差异具有统计学意义。

3.实验结果

运用人类膜联蛋白A3酶联免疫吸附实验试剂盒(ANXA3 ELISAkit)成功检测并定量了人血清中膜联蛋白A3的含量，膜联蛋白A3在人外周血中的表达水平比较低。正常妇女血清膜联蛋白A3平均表达水平为0.8590±0.0744，卵巢癌患者血清膜联蛋白A3平均表达水平为1.6898±2.6563，两组进行Mann-Whitney检验，P＜0.0001。将所有卵巢癌患者分为铂类化疗药物耐药组和铂类化疗药物敏感组，耐药组膜联蛋白A3平均水平为2.1145±3.3833，敏感组膜联蛋白A3平均水平为1.0528±0.1178，两组比较P＝0.0003＜0.05(图9)。当膜联蛋白A3水平大于1.13ng/ml时，该蛋白预测卵巢癌铂类化疗药物耐药的敏感性达到63.3％，特异性80％。当大于1.34ng/ml时，该蛋白预测卵巢癌铂类化疗药物的敏感性和特异性均达到100％(表4)。

4.结论

膜联蛋白A3作为一种铂类化疗药物耐药相关蛋白，经体外实验证实在卵巢癌细胞内具有外分泌的功能，并且运用ELISA法成功在人外周血检测出膜联蛋白A3。并且将耐药组和敏感组膜联蛋白A3表达水平进行比较，耐药组膜联蛋白A3表达水平明显高于敏感组，当膜联蛋白A3水平高于1.13ng/ml，其预测铂类化疗药物耐药的敏感性和特异性均超过50％，当高于1.34ng/ml时，其敏感性和特异性达到100％。本实验选取人血清作为研究对象，是基于其比较容易获得且是临床常用的检测对象而考虑的，理论上也能够采用腹水、尿液、唾液、白带等其它人体分泌物作为检测对象。在本实验中，出于质量控制的考虑，全部样本检测均有单人一次性操作完成，数据分析则采取双盲法分析。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。