一株海洋真菌爪曲霉、其活性提取物以及活性提取物和活性组分的制法和用途

摘要

本发明属于生物领域，涉及一株海洋真菌爪曲霉、其活性提取物以及活性提取物和活性组分的制法和用途，一株从大连海域分离获得的海洋真菌菌株DLEP2008001，鉴定为爪曲霉Aspergillus unguis。该菌株经摇瓶发酵后，将其发酵液的乙酸乙酯提取物与菌丝体甲醇提取物合并得到具有抗耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及白色假丝酵母活性的总粗提物，该提取物经硅胶柱层析、硅胶薄层层析及反相高效液相分离，得到两个有效部分的白色粉末组分1和组分2，对耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色假丝酵母具有显著抗菌活性，具有作为抗菌药物的潜在用途。

说明书

技术领域

本发明涉及一株海洋真菌爪曲霉DLEP2008001，特别是该菌株培养物的活性提取物及活性组分的制法和该提取物及组分在抗细菌、真菌药物方面的用途。

背景技术

目前在临床治疗中发现病原微生物的耐药性越来越强，尤其是耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)、铜绿假单胞菌(俗称绿脓杆菌)和白色假丝酵母(俗称白色念珠菌)造成的感染越来越严重，很多传统抗生素已基本丧失疗效，因此有必要寻找新型的抗生素及抗生素产生菌来应对此挑战。近半个多世纪来的研究发现陆地微生物作为新型抗生素的来源，其潜力日益枯竭。而海洋微生物来源的新药开发是二十一世纪世界范围的研究热点问题，以其新菌种来源、产生新结构活性物质、克服传统抗生素耐药性以及实现资源可持续等特点而为人们所普遍关注。海洋真菌具有易于培养、代谢产物丰富的特点，目前已经从各种海洋真菌中分离到许多结构新颖的抗细菌抗生素、抗真菌抗生素、抗病毒抗生素、抗肿瘤抗生素以及一些抗炎症和镇痛的活性物质、酶抑制剂等，因此可作为新型抗生素等药物的重要资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海洋真菌爪曲霉菌株培养液的活性提取物及其活性组分。

本发明的另一个目的是提供了该活性提取物及活性组分的制备及分离方法。

本发明进一步的目的是提供了该活性提取物及活性组分在制备抗细菌、真菌药物中的应用。

发明人同时要求保护海洋真菌爪曲霉DLEP2008001本身。

本发明涉及的一株海洋真菌爪曲霉DLEP2008001是从中国大连海域的一种海洋生物扇形拟伊藻体表分离获得。该菌株合适的生长盐浓度范围为2.0％～5.0％；对耐药性金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色假丝酵母均有抗性。依据《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)，经鉴定为爪曲霉Aspergillus unguisDLEP2008001菌株，已于2009年10月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏编号为：CGMCC No.3372。

海洋真菌爪曲霉DLEP2008001具有下述性质：接种到海水马铃薯蔗糖培养基(海水PSA)平板上，30℃培养，菌落开始为白色，圆形，向四周扩展，后从菌落中央向边缘产生灰绿色孢子，菌落边缘颜色略浅，整个菌落呈松散絮状。菌丝生长较慢，培养2天菌落直径仅达0.7cm。具有典型的放射状球形分生孢子头，孢子头由膨大的顶囊、顶囊外围的初生小梗、次生小梗以及每个次生小梗顶端串生的6到10个分生孢子组成，孢子圆形，绿色；分生孢子梗基部具有足细胞。最佳生长温度范围26～30℃，最佳生长pH为6.0～7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源。该菌株在海水马铃薯蔗糖液体培养基中摇床发酵可产生抗菌活性物质。

海洋真菌爪曲霉DLEP2008001的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列(533bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为GU117635。其全序列如下：

GCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCTTGAATACTAAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAGCCCCTTCCGGGGGGCAAGCCGCCGGGGACCACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAATTATAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGATTAGGGCCGGCCGGGC

GCCAGCCGGCGTCATCAATCTATTTTACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAAGA

这种海洋真菌菌株爪曲霉DLEP2008001可以利用常规的摇瓶方法培养，培养基中可含有用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源，对光照无严格限制，以适宜于该菌株生长为准。以制备抗菌活性产物为目的时，培养基的组分、离子强度、酸碱度、培养温度、装液系数、摇床转速、培养周期等因素会影响活性提取物的收率，发酵培养应选择使培养物的活性提取物的收率最高的条件为好。由以上所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能提取其中的活性组分，这些方法是常用于提取代谢物的方法，例如可利用活性提取物与其它杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取，这些方法可以单独使用，也可以适当配合或反复使用。其中，以如下培养基、培养方法和提取方法来培养海洋真菌菌株爪曲霉DLEP2008001产生抗生素最佳：

种子固体培养基：

蔗糖                                    20.0g；

马铃薯煮汁                              500ml；

人工海水或4％半人工海水                 500ml；

琼脂                                    15.0g；

自然pH值。

液体培养基为：

蔗糖                                    20.0g；

马铃薯煮汁                              500ml；

人工海水或4％半人工海水                 500ml；

自然pH值。

马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500ml煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500ml。

人工海水：NaCl 25.0g、Na₂SO₄ 4.0g、KCl 0.70g、NaHCO₃ 0.20g、KBr 0.10g、H₃BO₃ 0.03g、NaF 0.003g、MgCl₂ 5.04g、CaCl₂ 1.11g、SrCl₂ 0.014g，溶于1000ml蒸馏水，过滤得到。

4％半人工海水：40g粗天然海盐，溶于1000ml蒸馏水，过滤得到。

A.种子培养：将菌种从斜面上转接到无菌的固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中26～30℃下培养。培养时间为4～7天；

B.扩大培养：液体培养基灌装到透气防菌玻璃容器中，装液系数为0.15～0.25，封口后于高压消毒器中121℃、0.105Mpa灭菌20min；冷却后按每1000ml液体培养基接种上述种子平板带菌琼脂块40～80cm²比例接种，封口，置于恒温振荡培养箱中以160～200rpm转速、于26～30℃下培养，自然光照。培养时间为5～9天；

C.提取：将完成扩大培养过程的培养液用双层脱脂纱布过滤分别得到澄清发酵液和菌丝体，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取4次，每1000ml发酵液得到的菌丝体用200ml无水甲醇浸泡提取四次，每次12h，将发酵液的乙酸乙酯提取物及菌丝体甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩，最后合并提取物继续用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物；

D.提纯：将上述总活性粗提物溶于少量甲醇，加入到与其干重相等的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20～50倍于样品干重的200～300目硅胶层析柱上，以下述洗脱剂逐步梯度洗脱：石油醚∶二氯甲烷＝1∶2～1∶3(v/v)、纯二氯甲烷、二氯甲烷∶甲醇＝100∶1～2∶1(v/v)，采用薄层色谱及薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分。再将活性组分点样于制备型硅胶薄层板，用二氯甲烷∶甲醇＝60∶1～20∶1展开，将活性条带分别刮下，用甲醇洗脱。洗脱相蒸干后分别通过HPLC进一步纯化，使用C₁₈反相柱，用体积浓度为60～100％的甲醇水作为流动相，进行35分钟梯度洗脱，流速0.6ml/min，检测254nm紫外吸收，通过活性色谱追踪，分别制备出保留时间在9～15min及4～9min的活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份白色粉末组分1和组分2。薄层分析显示，层析展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝40∶1时，组分1在GF₂₅₄薄层硅胶板上Rf值为0.64，组分2的Rf值为0.38，该两组分在254nm紫外光照射下在GF₂₅₄硅胶板上呈现暗紫色。

本发明中从海洋真菌菌株爪曲霉DLEP2008001中提取得到的活性提取物及活性组分，通过抗菌模型筛选，采用微量肉汤稀释法(National Committee forClinical Laboratory Standards.2003.Methods for dilution antimicrobialsusceptibility tests for bacteria that grow aerobically，5th ed.Approved standardM7-A6.；National Committee for Clinical Laboratory Standards.1997.Referencemethed for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts：approvedstandard M27-A，7th ed.NCCLS，Wayne，Pa.)测定对耐甲氧基青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)、铜绿假单胞菌和白色假丝酵母的MIC值，证实其培养液的发酵液乙酸乙酯提取物与菌丝体甲醇提取物合并得到的总粗提取具有抗MRSA金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和弱的抗白色假丝酵母菌活性，其MIC值分别为8μg/mL、4μg/mL及＞128μg/mL(128μg/mL剂量下抑制率为35.0％)；制备出的活性组分1抗MRSA的MIC值为16μg/mL，抗铜绿假单胞菌的MIC值为8μg/mL，抗白色假丝酵母的MIC值为16μg/mL；制备出的活性组分2抗MRSA的MIC值为8μg/mL，抗铜绿假单胞菌的MIC值为16μg/mL，抗白色假丝酵母的MIC值为＞128μg/mL(128μg/mL剂量下抑制率为71.5％)。

利用本发明的活性提取物及其中的有效组分，可以用于制备抗菌的药物。

以下用实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例1.

种子固体培养基：

蔗糖                     20.0g；

马铃薯煮汁               500ml；

琼脂                     15.0g；

4％半人工海水            500ml；

自然pH值。

液体培养基：

蔗糖                     20.0g；

马铃薯煮汁               500ml；

4％半人工海水            500ml；

自然pH值。

马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500ml煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500ml。

4％半人工海水：40g粗天然海盐，溶于1000ml蒸馏水，过滤得到。

A.种子培养：将菌种从斜面上转接到无菌的固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下培养。培养时间为5天；

B.扩大培养：液体培养基灌装到透气防菌玻璃容器中，装液系数为0.15，封口后于高压消毒器中121℃、0.105Mpa灭菌20min；冷却后按每1000ml液体培养基接种上述种子平板带菌琼脂块40cm²比例接种，封口，置于恒温振荡培养箱中以180rpm转速、于28℃下培养，自然光照。培养时间为6天；

C.提取：将完成扩大培养过程的培养液用双层脱脂纱布过滤分别得到澄清发酵液和菌丝体，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取4次，每1000ml发酵液得到的菌丝体用200ml无水甲醇浸泡提取四次，每次12h，将发酵液的乙酸乙酯提取物及菌丝体甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩，最后合并提取物继续用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物；

D.提纯：将上述总活性粗提物溶于少量甲醇，加入到与其干重相等的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20倍于样品干重的200～300目硅胶层析柱上，以下述洗脱剂逐步梯度洗脱：石油醚∶二氯甲烷＝1∶2～1∶3(v/v)、纯二氯甲烷、二氯甲烷∶甲醇＝100∶1～2∶1(v/v)，采用薄层色谱及薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分。再将活性组分点样于制备型硅胶薄层板，用二氯甲烷∶甲醇＝20∶1展开，将活性条带分别刮下，用甲醇洗脱。洗脱相蒸干后分别通过HPLC进一步纯化，使用C₁₈反相柱，用体积浓度为60～100％的甲醇水作为流动相，进行35分钟梯度洗脱，流速0.6ml/min，检测254nm紫外吸收，通过活性色谱追踪，分别制备出保留时间在9～15min及4～9min的活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份白色粉末组分1和组分2。薄层分析显示，层析展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝40∶1时，组分1在GF₂₅₄薄层硅胶板上Rf值为0.64，组分2的Rf值为0.38，该两组分在254nm紫外光照射下在GF₂₅₄硅胶板上呈现暗紫色。

实施例2.

种子固体培养基：

蔗糖                20.0g；

马铃薯煮汁          500ml；

人工海水            500ml；

琼脂                15.0g；

自然pH值。

液体培养基：

蔗糖                20.0g；

马铃薯煮汁          500ml；

人工海水            500ml；

自然pH值。

马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500ml煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500ml。

人工海水：NaCl 25.0g、Na₂SO₄ 4.0g、KCl 0.70g、NaHCO₃ 0.20g、KBr 0.10g、H₃BO₃ 0.03g、NaF 0.003g、MgCl₂ 5.04g、CaCl₂ 1.11g、SrCl₂ 0.014g，溶于1000ml蒸馏水，过滤得到。

A.种子培养：将菌种从斜面上转接到无菌的固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下培养。培养时间为5天；

B.扩大培养：液体培养基灌装到透气防菌玻璃容器中，装液系数为0.20，封口后于高压消毒器中121℃、0.105Mpa灭菌20min；冷却后按每1000ml液体培养基接种上述种子平板带菌琼脂块80cm²比例接种，封口，置于恒温振荡培养箱中以180rpm转速、于28℃下培养，自然光照。培养时间为7天；

C.提取：将完成扩大培养过程的培养液用双层脱脂纱布过滤分别得到澄清发酵液和菌丝体，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取4次，每1000ml发酵液得到的菌丝体用200ml无水甲醇浸泡提取四次，每次12h，将发酵液的乙酸乙酯提取物及菌丝体甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩，最后合并提取物继续用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物；

D.提纯：将上述总活性粗提物溶于少量甲醇，加入到与其干重相等的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于40倍于样品干重的200～300目硅胶层析柱上，以下述洗脱剂逐步梯度洗脱：石油醚∶二氯甲烷＝1∶2～1∶3(v/v)、纯二氯甲烷、二氯甲烷∶甲醇＝100∶1～2∶1(v/v)，采用薄层色谱及薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分。再将活性组分点样于制备型硅胶薄层板，用二氯甲烷∶甲醇＝40∶1展开，将活性条带分别刮下，用甲醇洗脱。洗脱相蒸干后分别通过HPLC进一步纯化，使用C₁₈反相柱，用体积浓度为60～100％的甲醇水作为流动相，进行35分钟梯度洗脱，流速0.6ml/min，检测254nm紫外吸收，通过活性色谱追踪，分别制备出保留时间在9～15min及4～9min的活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份白色粉末组分1和组分2。薄层分析显示，层析展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝40∶1时，组分1在GF₂₅₄薄层硅胶板上Rf值为0.64，组分2的Rf值为0.38，该两组分在254nm紫外光照射下在GF₂₅₄硅胶板上呈现暗紫色。

实施例3.活性提取物及活性组分活性测定结果

采用微量肉汤稀释法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.2003.Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that growaerobically，5th ed.Approved standard M7-A6.；National Committee for ClinicalLaboratory Standards.1997.Reference methed for broth dilution antifungalsusceptibility testing of yeasts：approved standard M27-A，7th ed.NCCLS，Wayne，Pa.)测定对耐甲氧基青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)、铜绿假单胞菌和白色假丝酵母的MIC值，证实其培养液的发酵液乙酸乙酯提取物与菌丝体甲醇提取物合并得到的总粗提取具有抗MRSA金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和弱的抗白色假丝酵母菌活性，其MIC值分别为8μg/mL、4μg/mL及＞128μg/mL(128μg/mL剂量下抑制率为35.0％)；制备出的活性组分1抗MRSA的MIC值为16μg/mL，抗铜绿假单胞菌的MIC值为8μg/mL，抗白色假丝酵母的MIC值为16μg/mL；制备出的活性组分2抗MRSA的MIC值为8μg/mL，抗铜绿假单胞菌的MIC值为16μg/mL，抗白色假丝酵母的MIC值为＞128μg/mL(128μg/mL剂量下抑制率为71.5％)。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>大连交通大学

<120>一株海洋真菌爪曲霉、其活性提取物以及活性提取物和活性组分的制法和用途

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>533

<212>DNA

<213>海洋真菌爪曲霉DLEP2008001的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列

<400>1

gcgggctgcc tccgggcgcc caacctccca cccttgaata ctaaacactg ttgcttcggc    60

ggggagcccc ttccgggggg caagccgccg gggaccactg aacttcatgc ctgagagtga    120

tgcagtctga gtctgaatta taaatcagtc aaaactttca acaatggatc tcttggttcc    180

ggcatcgatg aagaacgcag cgaactgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa    240

tcatcgagtc tttgaacgca cattgcgccc cctggcattc cggggggcat gcctgtccga    300

gcgtcattgc tgcccttcaa gcccggcttg tgtgttgggt cgtcgtcccc cccgggggac    360

gggcccgaaa ggcagcggcg gcaccgtgtc cggtcctcga gcgtatgggg ctttgtcacc    420

cgctcgatta gggccggccg ggcgccagcc ggcgtcatca atctatttta ccaggttgac    480

ctcggatcag gtagggatac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga aga           533