大豆提取物和叶酸一起发酵产生的生物聚合物以及含有所述生物聚合物的组合物

摘要

本发明提供一种通过使用微生物使包含叶酸和大豆提取物的培养物发酵而产生的叶酰发酵大豆提取物(extract of fermented soybean，EFS)，以及提供包含所述叶酰EFS的组合物。所述叶酰EFS具有抗组胺作用、抗过敏作用、促进钙吸收的作用、促进骨骼生长的作用、促进细胞生长的作用、促进胶原生物合成的作用、改善皱纹的作用以及抑制紫外线(UV)诱导的细胞损伤的作用。因此，所述叶酰EFS可用于皮肤外用品或化妆品组合物、保健补充食品组合物、饲料组合物以及药学组合物中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过使用微生物使包含叶酸和大豆提取物的培养物发酵而产生的叶酰(folyl)发酵大豆提取物(extract offermented soybean，EFS)，以及包含所述叶酰EFS的组合物。

本发明的叶酰EFS或组合物具有抗组胺作用、抗过敏作用、加速钙吸收的作用、加速骨骼生长的作用、加速细胞生长的作用、加速胶原生物合成的作用、改善皱纹的作用以及抑制由紫外线(UV)辐射引起的细胞损伤的作用。因此，本发明的叶酰EFS或组合物可用于皮肤外用品或化妆品组合物、保健补充食品(health supplement food)组合物、饲料组合物或药学组合物中。

背景技术

清蒟酱(Chungkookjang)和纳豆(Natto)是代表性发酵食品，并且是通过使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)使大豆发酵而制成。当大豆发酵时，产生γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamate)和多聚果糖(polyfructan)聚合物。已知γ-聚谷氨酸具有保湿和细胞活化功能，并且当与如泰素(Taxol)等抗癌药物一起使用时，使所用药物的作用增加。多聚果糖是一种膳食纤维，被用于减肥，当投予时，使胃部有饱足感并抑制食欲，由此可以防止肥胖。此外，据报导，多聚果糖抑制肠中有害细胞生长，而且有助于双歧杆菌(Bifidobacterium)生长(参看Journal of Applied Microbiology，92，5，第958-963页)。

关于发酵大豆的专利包含有关化妆品材料的专利(参看韩国注册专利第0451631号)和有关皮肤外用品的专利(参看韩国公开专利第2001-0083876号)。Seong mun-hoe等人开发了一种制造分子量为2,000千道尔顿(kDa)或更多的γ-聚谷氨酸的酶法技术(参看App.& Environ.Microbiol.2004；70(7)，4249-4255；和韩国注册专利第10-0399091号)。他们还注册了一项专利，这项专利是基于关于其中抗坏血酸结合具有此类高分子量的γ-聚谷氨酸的材料的研究结果(韩国注册专利第10-0485727号)。然而，尚未开发出其中叶酸(又称维生素B₉)结合γ-聚谷氨酸的一种新颖的发酵大豆聚合物，以及其应用。

已知叶酸是一种降低高半胱氨酸含量的物质，而高半胱氨酸的含量与老年人的心脏病和痴呆有关。因此，当将叶酸用于老年人的食物中时，可以获得明显作用。叶酸天然以聚谷氨酸形式存在，因此易于为动物和人体所吸收。

附图说明

图1是一系列显微图像，其显示叶酰发酵大豆提取物(叶酰EFS)的抗组胺作用，其中图1A显示正常细胞的显微图像，图1B显示用刺激物处理细胞30分钟后细胞的显微图像，而图1C显示用叶酰EFS和刺激物处理细胞30分钟后细胞的显微图像。

图2是通过定量组胺和色甘酸(已知为哮喘治疗剂)显示叶酰EFS抑制组胺分泌的作用的测试结果的柱形图。

图3是显示叶酰EFS关于过敏性反应(anaphylaxis)的测试结果的柱形图，以腹膜内注射刺激物时各组的死亡率表示。

图4是显示叶酰EFS在动物小肠中的钙吸收促进作用的测试结果的柱形图，其中在获得所述结果的实验中，对动物给予添加有叶酰EFS的饲料，分离出动物的小肠并定量各组的钙量，并且以相对于所给饲料中未添加叶酰EFS的组的比率表示定量的结果。

图5是显示叶酰EFS的生长促进作用的测试结果的柱形图，其中在获得所述结果的实验中，用叶酰EFS喂养大鼠预定的时间段，从各组取血，并利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)定量血液中的胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)。

图6显示成纤维细胞的原代培养物与叶酰EFS或叶酸在成纤维细胞培养基(fibroblast culture medium，FGM，KDR公司)中培育24小时后得到的显微图像。

图7是显示成纤维细胞的原代培养物与叶酰EFS或叶酸在成纤维细胞生长培养基(FGM，KDR公司)中培育24小时后，通过中性红(neutral red，NR)试验定量活细胞的结果的柱形图。

图8是显示叶酰EFS促进胶原生物合成的作用的结果的柱形图，其中在获得所述结果的实验中，使用成纤维细胞的原代培养物促进胶原的生物合成并利用ELISA定量胶原，并且将叶酰EFS促进胶原生物合成的作用与转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)(已知为促进胶原生物合成的物质)促进胶原生物合成的作用相比较。

图9是显示通过NR试验定量活细胞的结果的柱形图，其中在获得所述结果的实验中，将人角化细胞的原代培养物与叶酸含量为约10重量％的叶酰EFS在人角化细胞生长培养基(keratinocyte growth medium，KGM，KDR公司)中培育约72小时，用波长为306纳米(nm)的紫外线(UV)照射生长的细胞，随后培育约24小时。

具体实施方式

技术问题

本发明提供一种新颖的发酵大豆，其特性优良、价格便宜，并且能用于各种应用中。

技术解决方案

为此，本发明的发明人尝试使包含叶酸和大豆提取物的组合物发酵，并制得新颖的叶酰发酵大豆提取物(叶酰EFS)。

有益作用

本发明的叶酰发酵大豆提取物(叶酰EFS)抑制肥大细胞产生组胺，其中肥大细胞产生组胺的现象是发生严重皮肤不良反应(例如过敏(allergy))的人出现的一种症状。叶酰EFS还对减轻过敏性反应极为有效。此外，叶酰EFS促进小肠中如钙等矿物质的吸收，并且促进哺乳动物股骨(大腿骨)生长。另外，叶酰EFS因具有细胞活化功能，而促进胶原的生物合成，由此当施用于人皮肤时，可以获得改善皱纹的作用，由此还可以获得其它各种作用，例如保湿和抗过敏作用。而且，叶酰EFS还保护细胞以免被紫外线(UV)辐射损伤。因此，叶酰EFS和包含叶酰EFS的组合物可用于保健补充食品、化妆品、皮肤外用品、药学产品和牲畜饲料中。此外，与具有类似作用的其它产品相比，本发明的叶酰EFS的生产成本更低，而且产率更高。

发明模式

本发明针对一种通过使用微生物使包含叶酸和大豆提取物的培养物发酵而产生的叶酰发酵大豆提取物(叶酰EFS)，和其应用。

当使用微生物使大豆发酵时，产生γ-聚谷氨酸，它是一种谷氨酸的胺基肽连接(peptide-linked)到γ-羧基的聚合物。同时，叶酸(维生素B9或蝶酰谷氨酸(pteolyl glutamic acid))是谷氨酸与蝶酰环(pteolyl ring)结合的谷氨酸类似物。本发明的发明人鉴别出，常规在大豆发酵时产生的γ-聚谷氨酸可由芽孢杆菌(Bacillus)属微生物产生的合成酶产生，并且根据当使合成酶与叶酸(其中蝶酰环结合谷氨酸)接触时合成酶倾向于使叶酸聚合的事实，进行了实验。由此，本发明的发明人发现，当使用微生物使大豆发酵时添加叶酸，叶酸将通过微生物产生的酶并入γ-聚谷氨酸中，并由此可大量产生一种新的聚合物，即，包含叶酸和谷氨酸的叶酰聚谷氨酸。相应地，本发明提供一种叶酰EFS和大量产生叶酰EFS的方法。本发明的叶酰EFS包含叶酰聚谷氨酸。本发明的叶酰EFS还可包含大豆发酵时所产生的果聚糖(levan)(微生物多聚果糖)。

并入叶酰EFS中的叶酸与叶酸本身的特性极为不同，并且具有极高的水溶性，并由此可更为有效地用于工业应用中，而且更易于为动物的小肠吸收。

另外，由于本发明的叶酰EFS还可以包含大豆发酵时产生的果聚糖(微生物多聚果糖)，故可促进双歧乳杆菌(bifidus lactobacillus)的生长，并由此可获得胃肠清洁作用以及防止肥胖的作用。

本发明的叶酰EFS还具有与叶酰EFS的浓度成比例的较高的免疫刺激作用和抗过敏作用，这已通过体外(in vitro)试验和动物试验鉴别。叶酸本身不具有所述免疫刺激和抗过敏作用。本发明的叶酰EFS抑制组胺分泌(参看图1和图2)并减轻过敏性反应(参看图3)。因此，本发明的叶酰EFS可用于食品中，以防止婴儿和儿童急性过敏，并改善成人的体质(constitution)。另外，本发明的叶酰EFS可用于皮肤外用品或化妆品组合物中，以减轻异位性皮炎(atopic dermatitis)或过敏。

本发明的叶酰EFS促进胶原的生物合成(参看图6)，而且具有改善皱纹的作用(参看表5)。因此，本发明的叶酰EFS可用于基于代谢活化的保湿、改善皮肤的外用品或化妆品组合物中，而且具有改善皱纹的特性以及由此引起的作用。

本发明的叶酰EFS促进动物小肠的钙吸收(参看图4)。因此，叶酰EFS可以与如钙、铁或锰等药用金属一起使用，并由此可产生各种产品，其除包含功能性产品外，还包含药品，例如营养补充剂、孕妇用抗贫血药或糖尿病补充剂。

另外，本发明的叶酰EFS促进骨骼生长(参看表4)，并增加血液中的生长因子(IGF-10)(参看图5)。当前可用的生长促进物质的实例是KI-180，它是由Highki生长诊所(Highki growth clinic)和韩国食品研究所(Korea FoodResearch Institute)共同研发。由于KI-180是从草药中提取出来的，故其价格昂贵，并因此被用于昂贵的药品而非食品中。因而，很难将KI-180商业化。然而，由于本发明的叶酰EFS可通过微生物发酵大量产生，故可以将叶酰EFS用于多种应用中，例如适于儿童的功能性食品、适于绝经后妇女的预防骨质疏松症的功能性食品，以及营养补充剂。由此，叶酰EFS可以比常规促进生长的物质容易商业化。

根据上述实验结果，本发明提供：

[1]一种叶酰EFS，包含叶酸聚谷氨酸(folic acid polyglutamate)作为主要组分，其中所述叶酰EFS是通过使用微生物使包含叶酸和大豆提取物的培养物发酵而产生；

[2]根据[1]所述的叶酰EFS，其中所述微生物选自芽孢杆菌(bacillus)属微生物或棒杆菌(corynebacterium)属微生物；

[3]根据[1]所述的叶酰EFS，其中所述微生物是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS，其中所述叶酰EFS具有抗组胺作用；

[5]根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS，其中所述叶酰EFS具有抗过敏作用；

[6]根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS，其中所述叶酰EFS具有促进钙吸收的作用；

[7]根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS，其中所述叶酰EFS具有促进骨骼生长的作用；

[8]根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS，其中所述叶酰EFS具有促进胶原生物合成的作用；

[9]根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS，其中所述叶酰EFS具有改善皱纹的作用；

[10]根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS，其中所述叶酰EFS具有促进细胞生长的作用；

[11]一种用于皮肤外用品或化妆品的组合物，其包含根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS作为活性组分；

[12]根据[11]所述的用于皮肤外用品或化妆品的组合物，其中所述组合物用于抗过敏或改善异位性皮炎；

[13]根据[11]所述的用于皮肤外用品或化妆品的组合物，其中所述组合物用于活化皮肤细胞的代谢、防止皱纹形成或改善皱纹外观；

[14]根据[11]所述的用于皮肤外用品或化妆品的组合物，其中所述组合物用于抑制由紫外线(UV)辐射引起的细胞损伤；

[15]一种保健补充食品组合物，其包含根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS作为活性组分；

[16]根据[15]所述的保健补充食品组合物，其中所述保健补充食品组合物是用于饮品中；

[17]根据[15]所述的保健补充食品组合物，其中所述保健补充食品组合物具有促进生长的作用；

[18]根据[15]所述的保健补充食品组合物，其中所述保健补充食品组合物具有防止骨质疏松症的作用；

[19]根据[15]所述的保健补充食品组合物，其中所述保健补充食品组合物具有促进钙吸收的作用；

[20]根据[15]所述的保健补充食品组合物，其中所述保健补充食品组合物防止发生过敏或改善体质；

[21]一种饲料组合物，其包含根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS作为活性组分；

[22]一种促进细胞生长的药用组合物，其包含根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS作为活性组分；

[23]一种治疗或预防骨质疏松症的药用组合物，其包含根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS作为活性组分；

[24]一种促进钙吸收的药用组合物，其包含根据[1]至[3]中任一项所述的叶酰EFS作为活性组分；和

[25]一种制造叶酰发酵大豆提取物(EFS)的方法，其是通过使用微生物使包含叶酸和大豆提取物的培养物发酵而进行的。

本发明的叶酰EFS可使用大豆提取物制造。现将详细地描述制造大豆提取物的方法。将大豆添加到蒸馏水中，其中大豆与蒸馏水的比率为约0.1％到约50％。在100℃下加热混合物1到2小时，并缓慢冷却，随后从其中取出固体内含物，由此完全制造出大豆提取物。使用0.1％到25％葡萄糖、0.01％到10％磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)和0.01％到10％磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)制备培养基。随后，将0.1％到90％大豆提取物和0.01％到10％叶酸添加到培养基中，将所得培养基灭菌，接着将从食品中分离出来的枯草芽孢杆菌接种到培养基中，并在10℃到60℃的温度下，具体说来在35℃到55℃下，于pH 5.5到pH 8.5下，在兼性发酵条件中执行发酵工艺，持续48小时到96小时。发酵工艺完成后，通过连续离心去除不可溶的物质，例如细胞，并使用2M盐酸将所得溶液的pH值控制在pH 3到pH 5，具体说来pH 4。接着，向其中添加乙醇，其中乙醇的量是pH值被控制溶液的2倍或更多倍。由此获得叶酰EFS，冻干并以粉末形式保存。使用常规方法，根据分子量执行分组。例如，可利用色谱法或使用错流超滤单元(cross-flow ultrafiltration unit)执行分组。

可用于使叶酸和本发明所用的大豆提取物发酵的微生物可以是芽孢杆菌属微生物或棒杆菌属微生物，其能够产生γ-聚谷氨酸。芽孢杆菌属微生物的实例包含枯草芽孢杆菌、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。例如，芽孢杆菌属微生物可以是枯草芽孢杆菌。棒杆菌属微生物可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，但不限于此。

另外，叶酰EFS具有抗过敏作用，并促进包含人在内的动物的生长以及双歧杆菌和乳杆菌(Lactobacillus)的生长，由此产生高牲畜收益和高肉质。因此，叶酰EFS可以在动物饲料行业中用作饲料添加剂。

本发明的组合物可以包含叶酰EFS，其中叶酰EFS的量可占组合物0.01重量％到60重量％，具体说来0.1重量％到50重量％。

在本发明的化妆品组合物中，叶酰EFS可以与适量的常规皮肤化妆品材料中所用组分一起使用。此类组分的实例包含油料、水、表面活性剂、润湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、着色剂、防腐剂和香料。本发明包含叶酰EFS的化妆品组合物可用于保湿化妆品、面部清洁产品或其它化妆品中，但不限于此。具体说来，本发明包含叶酰EFS的化妆品组合物可用于化妆品中，例如收敛化妆水(astringent cosmetic water)、柔肤化妆水(emollient cosmeticwater)、营养化妆水(nutrient cosmetic water)、各种乳霜、精油、面膜(pack)或粉底(foundation)；清洁产品；面部清洁产品；肥皂；修护品(treatment)；或化妆液(cosmetic solution)。更具体说来，本发明包含叶酰EFS的化妆品组合物可用于润肤乳液(skin lotion)、柔肤液(skin softener)、调肤液(skintoner)、收敛乳液(astringent lotion)、牛奶乳液(milk lotion)、保湿乳液(moisturizing lotion)、营养乳液(nutrient lotion)、按摩乳霜(massage cream)、营养乳霜(nutrient cream)、保湿乳霜(moisturizing cream)、润手乳霜(handcream)、精油、营养精油、面膜、肥皂、洗发精、清洁泡沫、清洁乳(cleansinglotion)、清洁霜(cleansing cream)、身体乳(body lotion)、洁肤液(bodycleanser)、油料、粉饼(press powder)、散粉或眼影中。

本发明的药用组合物可以固体、半固体、溶液或油形式使用，或以分散剂、微胞或脂质体形式使用。药用组合物可以包含：适于肠或非口服投药的有机或无机载剂或赋形剂；以及本发明的叶酰EFS作为活性成分。活性组分可与适于例如片剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、溶液制剂、油制剂、悬浮液制剂、油膏剂或容易使用的任一类制剂的常规无毒的药学上可接受的载剂混合。可用载剂可以是葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁盐、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶状二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素、具有中等链长的甘油三酸酯，或适于制造制剂的任一类载剂，其可以是固体、半固体或液体。药用组合物可进一步包含补充剂、稳定剂、增稠剂、着色剂或香料。包含活性组分的药用组合物可形成为易于口服的任何制剂，例如片剂、锭剂、菱形片剂、水性或油性悬浮液制剂、可分散粉剂、颗粒剂、油、硬或软胶囊剂、糖浆剂或酏剂。可使用用于制造药用组合物并且此项技术中已知的任何方法，来制备这些口服用组合物。为获得优良的药用特性以及使这些口服用组合物的味道更吸引人，所述口服用组合物可进一步包含至少一种选自由以下组成的群组的功能剂：甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精；调味剂，例如薄荷、鹿衔草(pyrola japonica)或樱桃；着色剂；和防腐剂。可使用常规方法制备包含活性组分和无毒的药学上可接受的赋形剂的片剂。无毒的药学上可接受的赋形剂可以是：无活性赋形剂，例如碳酸钙、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂或分解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或海藻酸；粘合剂，例如黄芪胶(tragerkans rub)、玉米马铃薯、明胶或阿拉伯胶(Acasia)；或润滑剂，例如硬质酸镁、硬质酸或滑石。片剂可以未包覆包衣，或可使用常规方法包覆包衣以延迟片剂在胃肠中的分解或吸收，并由此使药物作用持续一段较长的时间。用于此目的的延迟材料可以是单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。这些材料还可以用于形成渗透性治疗片剂，以控制活性组分的放出。

在一些情况下，口服制剂可以是硬明胶胶囊，其中活性组分与如碳酸钙、磷酸钙或高岭土(kaolin)等无活性固体稀释剂混合；或软明胶胶囊，其中活性组分与水或如花生油、液体石蜡或橄榄油等油介质混合。

由于待治疗的个体具有多种症状，并且药物具有特定治疗特性，故应由专家来测定个体对治疗的反应以及根据反应来改变投药剂量。通常，每天的投药剂量可以是每公斤体重约10微克到约200毫克，具体说来，每公斤体重约50微克到约100毫克。每天的投药频率可以是4次或更少。

包含本发明叶酰EFS的食品组合物可用于制造各种食品。此类食品的实例包含肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、糖食(confectionary)、比萨饼(pizza)、各种面条、口香糖、乳制品(包含冰淇淋)、各种汤、饮料、茶、饮品、酒和复合维生素，但本发明不限于此。

将参照以下实例及实验实例更详细地描述本发明。这些实例和实验实例只是出于说明的目的，而不打算限制本发明的范围。

<实例1>

制造叶酰EFS

为了制造叶酰发酵大豆提取物(叶酰EFS)，首先制备大豆提取物。具体地说，将大豆添加到蒸馏水中，其中大豆与蒸馏水的比率为50％，并在100℃下加热混合物1小时并缓慢冷却，随后从其中取出固体内含物，由此产生大豆提取物。使用2.0％葡萄糖、1.0％Na₂HPO₄和0.5％NaH₂PO₄制备培养基。随后，将90％大豆提取物和0.5％叶酸添加到培养基中，将所得培养基灭菌，随后将从食品中分离出来的枯草芽孢杆菌接种到培养基中，并在45℃温度下执行发酵工艺，持续72小时。发酵工艺完成后，通过连续离心去除不可溶的物质，例如细胞，并使用2M盐酸将所得溶液的pH值控制在pH 4。接着，向其中添加乙醇，其中乙醇的量是pH值被控制溶液的2倍或更多倍。由此获得叶酰EFS，冻干并以粉末形式保存。为了制备分子量为1000千道尔顿的聚合物，使用琼脂糖凝胶(Sepharose)4B去除分子量为500千道尔顿或更低的聚合物，并使用错流超滤单元(由Vivascience公司制造)将所得溶液分成含有分子量为1,000千道尔顿或更高的聚合物的部分，以及含有分子量低于1,000千道尔顿的聚合物的部分。通过凝胶渗透色谱法(gel permeationchromatography，GPC)，使用液相色谱(Liquid chromatography，LC)测量具有分子量为1,000千道尔顿或更高的聚合物的部分的平均分子量，并且所测得的平均分子量为2,500千道尔顿。将这两部分干燥，并使用相同的粉末量。

<实例2>

制造包含叶酰EFS的组合物

制备包含0.0重量％到10.0重量％实例1中制备的叶酰EFS和可用于食品和药物中的添加剂的各种组合物。

(1)制备实例1：包含叶酰EFS的食品组合物

制备包含表1中所示组分和其量的食品组合物，以制造可饮用的保健补充食品。在这些组合物中，根据天然防腐剂的量，适当地控制精制水的量。

[表1]包含叶酰EFS的食品组合物(重量％)

  组分  组合物  1  组合物  2 组合物3  组合物  4  组合物  5  组合物  6  实例1中制备的叶酰EFS  色甘酸钠盐(cromoline   sodium salt)  环糊精  微量添加剂，例如矿物质  蒸馏水  天然防腐剂  -   -   2  3  95  适量  -   1   2  3  94  适量 0.05  -  2 3 94 适量  0.1   -   2  3  94  适量  0.2   -   2  3  94  适量  0.3   -   2  3  94  适量

(2)制备实例2：包含叶酰EFS的化妆品组合物

配制包含表2中所示的组分和其量的化妆品组合物以及包含蒸馏水替代叶酰EFS的对照组合物。在表2中，(A)表示水溶性物质，而(B)表示油溶性物质。根据防腐剂、调味料和颜料的量，适当地控制无菌蒸馏水的量。

[表2]包含叶酰EFS的化妆品组合物(重量％)

  组分  组合物1  组合物2  A  乙醇  实例1中制备的叶酰EFS  甘油  1，3-丁二醇  无菌蒸馏水  5.0  -  4.0  4.0  68.5  5.0  1.0  4.0  4.0  67.5  B  乙醇  鲸蜡醇  蜂蜡  凡士林(Vaseline)  角鲨烯  二甲基聚硅氧烷  POE(10)单油酸酯  单硬脂酸甘油酯  防腐剂  调味料  颜料  5.0  1.0  0.5  2.0  6.0  2.0  1.0  1.0  适量  适量  适量  5.0  1.0  0.5  2.0  6.0  2.0  1.0  1.0  适量  适量  适量

(3)制备实例3：包含叶酰EFS的饲料组合物

制备包含表3中所示的组分和其量的饲料组合物。

[表3]包含叶酰EFS的饲料组合物(重量％)

  组分  组合物1  组合物2  实例1中制备的叶酰EFS  碳酸钙  沸石  -  70  30  1  70  29

<实例3>抗过敏试验

实例3-1：通过显微镜观察肥大细胞来鉴别抗组胺作用

为了鉴别叶酰EFS的抗组胺作用，将试验材料施用于肥大细胞(ATCCTIB-64，P815)，并通过显微镜观察肥大细胞(参看George Chiang等人，TheJournal of Urology，12月，164，2000年，第2119-2125页)。图1A显示正常肥大细胞的图像；图1B显示用10微克/毫升C48/80(sigma公司)作为刺激物处理并静置30分钟的肥大细胞的图像；而图1C显示用叶酰EFS和刺激物处理并静置30分钟的肥大细胞的图像。参看图1A到图1C，正常肥大细胞圆而光滑。当发生免疫反应时，肥大细胞变粗糙。然而，当用C48/80作为刺激物处理肥大细胞并静置15分钟时，肥大细胞变形而且其表面上具有突起，并且当30分钟过去后，肥大细胞完全失去其初始形状并破裂，由此分泌出组胺。肥大细胞表面变形是C48/80刺激肥大细胞的细胞膜而分泌出各种信号递送物质并且细胞膜的稳定性减低，由此使细胞膜表面不稳定的现象。因此，可根据C48/80处理后，肥大细胞的初始表面形状维持的程度，来鉴别抗组胺作用。然而，当用叶酰EFS处理并静置15分钟时，肥大细胞保持其初始形状，并且甚至在30分钟过去后，仅少数的细胞分泌组胺并且其细胞膜破裂。

实例3-2：通过定量肥大细胞的组胺来鉴别抗组胺作用

执行本实验是为了鉴别叶酰EFS降低用刺激物处理肥大细胞时所分泌的组胺量的程度。使用ELISA定量所分泌的组胺的量。将1％色甘酸钠(已知为哮喘治疗药)用作对照组，而C48/80用作刺激物来诱导肥大细胞活化(ATCC TIB-64，P815)。图2是显示实验结果的柱形图。

参看图2，当使用约0.5％作为哮喘治疗药的色甘酸钠时，组胺分泌的抑制率为50％，由此ED50(50％有效剂量)值为0.5％；而当使用叶酰EFS时，ED50值为约0.063％，是使用色甘酸钠时的1/8。如上文所述，可以看出，叶酰EFS具有优良的抗组胺(抗过敏)作用。

实例3-3：抗过敏(抗过敏性反应)试验

为了确认叶酰EFS的抗组胺作用(已在实例3-1中鉴别)，用制备实例1中所用的组合物1-6喂养小鼠7天，随后对其经腹膜内注射C48/80以诱导抗过敏性反应。图3是显示实验结果的柱形图。

C48/80是一种当经腹膜内注射时刺激免疫器官并在30分钟内诱导急性过敏性反应的物质。在本实验中，计出腹膜内注射C48/80后在预定时间段(24小时)内死亡的试验小鼠的数量。在本实验中，每组使用10只小鼠(BALB/C，雄性)，并且各组测试3次，并将三次实验结果的平均值表示为死亡率(％)。

参看图3，用未进行添加的组合物1喂养的组的死亡率为93.3％，在注射C48/80后24小时内10只小鼠中有9只死亡。用添加色甘酸钠的组合物2喂养的组的死亡率(即，对照组的死亡率)为20％。实验组分别用添加0.05％到0.3％的各种浓度叶酰EFS的组合物3到6喂养。添加0.05％叶酰EFS的组合物3的实验组死亡率为33.3％，组合物4的死亡率为20％，组合物5的死亡率为6.7％，而组合物6的死亡率为16.7％。鉴于这些结果，可以看出1％作为哮喘治疗药的色甘酸钠对过敏性反应发生的抑制高达80％，而且浓度为0.2％的叶酰EFS对过敏性反应发生的抑制高达94％。然而，注射刺激物C48/80后24小时内存活的小鼠出现异常肛门肿胀。在约80％喂食包含色甘酸钠的组合物2的小鼠，以及当分别使用包含各种浓度叶酰EFS的组合物3到6时于约10％、0％、0％和0％的小鼠中发现此事件。因此，可以看出，色甘酸钠抑制过敏性反应的发生，并且防止小鼠死亡，但不抑制过敏性反应的后遗症，而叶酰EFS抑制过敏性反应的后遗症以及小鼠死亡。

<实例4>促进钙吸收的作用

使用小鼠(BALB/C，雄性)执行本实验，并且每天两次，使小鼠口服各饲料。口服期为3天，并且在口服期后，分离出小鼠的小肠。用生理盐水洗涤所得小肠3次或更多次，并用特氟隆匀浆器(teflon homogenizer)研磨从各组分离的小肠组织。离心所得产物，并分离上清液。随后，使用钙定量试剂盒(Wako公司)测量吸收到小肠中的钙量。图4是显示实验结果的柱形图。

参看图4，与给予未进行添加的饲料的对照组相比较，给予添加有叶酰EFS的饲料的组的钙吸收率增加约84％到96％。给予添加有钙盐的饲料的组的钙吸收率为约4.7％，给予添加有酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptide，CPP)的饲料的组为约21％，而给予添加有γ-聚谷氨酸的饲料的组为约56.8％。对于叶酰EFS，当分子量为500到1,000千道尔顿时，钙吸收率比分子量高于1,000千道尔顿时高。这一结果可能归因于当叶酰EFS的分子量过高时，钙离子(一种二价离子)与带负电荷的叶酰EFS反应，并由此可能产生不可溶的沉淀。因此，当叶酰EFS的分子量较高时，理想的是产生可溶的钙-叶酰EFS复合物。

<实例5>促进生长的作用

由于如实例3中所述，叶酰EFS促进钙吸收到肠中，故执行本实验以鉴别吸收到肠中的钙是否影响动物骨骼生长以及血液中的生长因子(IGF-1)。对哺乳动物给予添加有叶酰EFS的饲料2周，并测量哺乳动物股骨(大腿骨)的长度和重量，并且取血测量生长因子IGF-1。将结果与给予添加有生理盐水的饲料的对照组相比较。试验的哺乳动物为4周龄的大鼠(SD大鼠，雄性)。对比较组给予由P&B公司制造的“真生成长元(Kikerup gold)”产品，其含有五加(Acantopanax)、红花籽(red flower seed)、熟地黄(Rehmanniaeradix preparata)、茯苓(Poria cocos)、山药(Dioscoreae rhizoma)、山茱萸(Corni fructus)、鹿角(antler)等中药提取物作为主要成分，并在与使用叶酰EFS时相同的条件下进行试验。

结果如表4和图5中所示。

当标准误差为5％或更低时，用生理盐水喂养的对照组的股骨(大腿骨)的平均长度为29.22毫米，用P&B公司的促生长产品喂养的比较组的股骨(大腿骨)的平均长度为29.63毫米，而用叶酰EFS喂养的实验组的股骨(大腿骨)的平均长度为30.04毫米。与对照组相比较，比较组具有约1.4％的促生长作用，而实验组具有约3.1％的促生长作用(表4)。利用ELISA定量IGF-1(已知为血液中的生长促进因子)。由此，对照组具有1409.5微克/毫升IGF-1，比较组具有1566微克/毫升IGF-1，而实验组具有1637.1微克/毫升IGF-1。也就是说，比较组中的IGF-1比对照组中的IGF-1高11.1％，而实验组中的IGF-1比对照组中的IGF-1高16.2％(图5)。比较组和实验组股骨(大腿骨)的重量分别比对照组高约1.3％和约2.3％。鉴于这些结果，可以看出，叶酰EFS具有促进动物生长的作用。此外，当将P&B公司的促生长产品的生产成本与叶酰EFS相比较时，考虑到P&B的促生长产品(真生成长元)含有维生素和营养素，叶酰EFS的生产成本是所述促生长产品的约1/20。因此，从包含生产成本在内的各个方面看，推定叶酰EFS具有优良的特性。

表4.叶酸的促进骨骼生长作用

  试验  长度(毫米)  上段宽度  (毫米)  中间宽度(毫  米)  下段宽度(毫  米)  重量(毫克)  对照组  29.22±0.31  6.20±0.07  2.43±0.03^*  3.64±0.03^*  307.2±9.1  真生成  长元  (P&B  公司)  29.63±0.15  6.24±0.05  2.31±0.03  3.50±0.05  311.2±9.6  叶酰  EFS  30.14±0.16^*  6.22±0.12  2.31±0.03  3.55±0.05  314.3±7.6

^*：P＜0.05，邓肯多重检验(Ducan′s multiple test)

<实例6>改善皱纹的作用以及愈合创伤的作用

实例6-1：关于细胞活化和促进胶原生物合成的试验

本发明的发明人发现，叶酰EFS具有较高细胞活化作用。术语“细胞活化作用”的含义包含细胞生长的活化、代谢产物产生的活化、为解毒的细胞中线粒体的活化等。细胞活化作用可诱导皮肤创伤愈合的作用和改善皱纹的作用。

通过本实验鉴别出，叶酰EFS促进细胞生长和胶原的生物合成。本实验中所用细胞为成纤维细胞的原代培养物(人新生儿皮肤成纤维细胞；(humandermal fibroblast neonatal，HDF-N；Gibco，Cooper，M.L.等人，Biomaterials12：243，1991))，并且所用培养基为新生儿成纤维细胞生长培养基(FGM，KDR公司)。由于叶酰EFS包含并入有约10％叶酸的聚谷氨酸作为主要组分，故将叶酰EFS与普通叶酸相比较。将1×105个细胞/孔的人新生儿皮肤成纤维细胞与叶酸或叶酰EFS培育24小时，拍摄培育产物的照片(参看图6)，并通过中性红(NR)试验定量活细胞(Sigma；Shao-Zeng Z.等人，Cell Biology andToxicology，6：2，1990)(参看图7)。

当使用叶酰EFS时，细胞生长速率较高，具体地说，当使用相同浓度叶酸时，可以获得比仅使用叶酸时高的细胞生长速率。此外，当仅使用叶酸并且逐渐增加叶酸的浓度时，细胞生长速率并未相应增加。然而，当使用叶酰EFS并逐渐增加叶酰EFS的浓度时，细胞生长速率相应明显改变。所述结果可能源自叶酸和叶酰EFS水溶性的差异。具体地说，叶酰EFS具有高水溶性，并由此影响较多的细胞。所述促进细胞生长作用在用于化妆品时，引起改善皱纹的作用，而在用于药品时，引起促进创伤愈合的作用。

将叶酰EFS和人新生儿皮肤成纤维细胞培育3天，并分离上清液，并且使用人1型胶原ELISA试剂盒(human collagen type-1ELISA kit；Cosmo Bio公司)定量胶原。本实验中所用样品为含有制备实例2中所用组合物2的1％溶液，并将4％1，3-丁二醇添加到样品中，并保存。另外，为了与叶酰EFS的作用比较，制备叶酸浓度与叶酰EFS中相同的叶酸溶液。此外，将10纳克/毫升转化生长因子β(TGF-β；Sigma公司)(已知为胶原生物合成的促进因子)与叶酰EFS相比较。

叶酰EFS的促进胶原生物合成的作用显示于图8的柱形图中。作为化妆品原料制造的叶酰EFS是1％的液体产品。在图8中，x轴的浓度(％)表示叶酰EFS的体积与整个培养溶液的体积的比率(v/v，％)。结果表示为当将未用任何物质处理的组中胶原的平均值设为100％时，各组中胶原的值相对于未用任何物质处理的组中胶原平均值的比率。由此，对于TGF-β，在0.63％(v/v，％)下，最大促进率为22％；而对于叶酰EFS，在0.63％(v/v，％)下，最大促进率为109％。也就是说，叶酰EFS的促进率是施用于比较组的TGF-β的4倍，这表明可通过在人皮肤中产生过量胶原，获得改善皱纹的效果。同时，当仅使用叶酸时，在误差范围内未出现促进胶原生物合成的作用。由此可以看出，叶酰EFS可以极为有效地用作化妆品材料，具体说来，通过胶原生物合成来改善皱纹外观的材料。

实例6-2：有关化妆品组合物的改善皱纹效果的试验

为了鉴别叶酰EFS的改善皱纹作用，将实例2中制备的组合物1(对照组)和制备实例2中制备的组合物2(实验组)施用于29位30岁女性的眼睛周围的皱纹上，每天两次，持续1个月。1个月后，通过参考个体所回答的问卷以及关于皱纹营养素的分析结果，来评估皱纹外观改善的程度。在个体回答的问卷中，每个问题提供4个选项，即比较施用前和施用后时：“无改善”、“较少改善”、“明显改善”和“很明显的改善”。

通过图像分析评估皱纹。执行试验前，使用Visioscan SV600(CK公司)收集眼睛下方的复制品(replica)，并且当试验完成时，从同一位置收集复制品，通过图像分析来测量皱纹密度。结果表示为皱纹减少率。

结果显示于表5中，并且可以看出，当将包含叶酰EFS的组合物2与组合物1比较时，皱纹有所减轻，而且其外观有所改善。此外，当施用包含叶酰EFS的组合物2时，与施用前相比，皱纹密度降低到约45％。

所述结果表明，当将本发明的组合物用作皮肤外用品时，可有效改善皮肤中形成的皱纹的外观。由此可以看出，可将叶酰EFS有效用作化妆品材料。

表5.化妆品组合物引起的皮肤皱纹的改善程度和密度

 无改善(人 数) 较少改善(人 数) 明显改善(人 数)  很明显的改善  (人数)  皱纹密度  (％) 组合物1 25 3 1  0  95 组合物2 0 4 10  15  45

<实例7>抑制由紫外线(UV)辐射引起的细胞损伤的作用

在本实验中，本发明的发明人鉴别出，叶酰EFS抑制由UV辐射引起的细胞损伤。

在人角化细胞生长培养基(KGM，KDR公司)中培育1×10⁵个细胞/孔的人角化细胞原代培养物，连同叶酸量为约10重量％的叶酰EFS，持续约72小时，随后用波长为306纳米的UV射线照射生长的细胞预定时间段。可通过调整发酵期间在叶酰EFS中并入叶酸的浓度，来控制终产物中叶酸的浓度。在照射UV射线后，培育所得培养物约24小时，并通过NR试验来定量活细胞。照射时间定义为在预备实验中约50％细胞死亡的时间。结果解释如下：

存活率(％)＝(UV射线照射后各组的生长速率)/(未暴露于UV辐射的具有相同浓度的组的生长速率)

在生长各种浓度叶酰EFS的培养基中，对UV辐射诱导的细胞损伤的抑制与所生长细胞的浓度成比例。与实例6中促进细胞生长试验的结果不同，当叶酸浓度为0.62％时获得最高存活率。此结果可能是因为尽管在包含约0.62％叶酰EFS的培养基中生长的细胞的生长速率低于在包含约0.31％叶酰EFS的培养基中生长的细胞的生长速率，但当使用约0.62％叶酰EFS时，对UV诱导的细胞损伤的抑制率高于使用约0.31％叶酰EFS时的抑制率。由此可以看出，当将叶酰EFS添加到化妆品中时，可有效阻挡紫外线(UV)辐射。具体地说，使用约0.1％到6％叶酰EFS除有助于增加防晒产品的UV阻挡作用外，还有助于增加常规制剂(例如乳液和乳霜)的UV阻挡作用。