一种用甲醇酵母制备抑肽酶衍生物的新方法

摘要

本发明涉及一种用甲醇酵母基因工程重组制备抑肽酶衍生物的新方法。运用此方法制备的抑肽酶衍生物纯度高、N端均一、具有天然抑肽酶的生物活性；运用此方法构建的甲醇酵母工程菌菌株上罐发酵时，抑肽酶衍生物以分泌的方式高效表达。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种用甲醇酵母表达制备抑肽酶衍生物的新方法。

背景技术

上世纪三十年代，人们从牛肺中分离了一种抑制激肽释放酶(kallikrein)的物质，后来发现这是牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)。早在1959年德国首先以商品名为Trasylol^@上市用于治疗胰腺炎。1987年外国科学家偶然发现了Trasylol^@具有非常显著的止血作用。牛胰蛋白酶抑制剂是一种很强的广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂，它可以抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶和血浆激肽释放酶等，人们又称之为抑肽酶(aprotinin)。天然抑肽酶是由58个氨基酸残基组成的单链多肽，有三对二硫键，其活性中心位于15位赖氨酸。

抑肽酶具有抑制纤溶系统的激活、保护血小板的功能、止血和抑制炎性反应等多种作用，是一种很有价值的药物。抑肽酶是国家基本医疗保险药品中之一，首次收载于中国药典(90版)。抑肽酶在预防和治疗各种出血，如纤溶系统亢进引起的出血、外伤引起的出血性休克和产后大出血等，尤其在心脏直视手术中，能使术中、术后出血量减少一半以上(30％-100％)，缩短手术时间，减少术后并发症(感染等)发生率，减少可能由输血引起病毒(爱滋病、肝炎)感染的危险性。此外，抑肽酶还可用于其他疾病的治疗，如急、慢性胰腺炎、肺气肿、喘息性支气管哮喘的首选药物，也用于胸、腹膜粘连的预防；还有抑制胶原酶的作用，治疗急性关节炎疗效极佳；近来，在抗病毒、抗癌症方面治疗作用的研究报道越来越多，显示出非常广阔的应用前景。

目前临床上使用的抑酶肽都从牛胰或牛肺中提取，价格昂贵，这使得它的应用受到一定的限制。尽管如此，国内心胸外科和胰腺手术仍广泛使用抑肽酶，仅阜外医院每年进口的抑肽酶用量就价值约400万人民币(参见中国专利0113609.1)。

近年来，疯牛病蔓延到许多国家，这使得抑肽酶的原料来源大大减少，况且从牛胰或牛肺提取的抑肽酶成本高，质量不稳定，还有潜在疯牛病的危险。

抑肽酶是由58个氨基酸残基组成的单链多肽，从理论上是可以用基因工程重组的方法制备，国外也有文献和专利报道。(参见美国专利：4,894,436、5,258,302、5,164,482；5,591,603、5,707,831；中国专利：95106042.2，96120494.x，97115348.5)。他们企图用大肠杆菌表达系统或酵母表达系统来表达。但是大肠杆菌胞内表达容易形成包含体，变复性也十分困难，收率很低，大肠杆菌分泌表达，表达量低。酵母表达存在严重的N端不均一的问题。Vedvick等人曾报道抑肽酶发酵表达量可达0.93克/升，其生物活性也和天然的抑肽酶一样，很遗憾的是：其表达产物N端不均一，有的N端会多2个额外的氨基酸，有的多4个额外的氨基酸，有的多11个额外的氨基酸，这些产物在在理化性质上非常相似，很难被分离开来，即使分离开，收率也很低。

国内也有人从事这方面的研究，如甘肃大得利生化制药厂，他们用细菌表达系统表达，表达量低；还有中国药科大学用包涵体表达，需要复性，收率低。

本专利描述了用甲醇酵母表达系统，以分泌的方式高效表达融合蛋白，然后在用酶或者化学方法切开，从而得到N端均一的抑肽酶衍生物。

发明内容

本发明的目的提供一种基因工程方法生产、表达量高、高纯度的抑肽酶衍生物的新方法。这种抑肽酶衍生物具有完全的天然抑肽酶的生理活性。

本发明提供的抑肽酶衍生物的制备新方法包括以下步骤：

1.抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白的构建

经过大量查阅文献资料，我们找到几种在甲醇毕赤酵母中高效表达的蛋白，例如，凝胶蛋白(gelatins)、醇氧化酶、血清白蛋白和水蛭素等，我们将其中的一种蛋白放在抑肽酶衍生物的N端之前，中间用连接肽相连。连接肽和抑肽酶之间加上切割位点。在融合蛋白切割位点之前的任何位置，可以插入组氨酸，组氨酸可以是一个或多个，可以连在一起或者分散插入。

2.合成对应于抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白的cDNA

按照甲醇酵母喜好的密码子设计并人工合成融合蛋白cDNA(APN fusionDNA)。

3.融合蛋白基因工程菌的构建

将APN fusion DNA重组到甲醇酵母分泌表达载体，用单酶切方法线性化，然后转化甲醇酵母宿主菌，外源基因整合到宿主菌的染色体上，用适当的抗性筛选阳性克隆，然后进行增殖和表达筛选，从而得到高表达的基因工程菌(APNfusion)。

4.基因工程菌(APN fusion)高密度发酵

按照Invitrogen公司发酵操作手册中的方法对筛选出的APN fusion工程菌上罐发酵。甲醇诱导48小时后，经过总蛋白测定，SDS-PAGE电泳和扫描分析，培养基上清融合蛋白的表达量不低于1.5克/升。

5.融合蛋白的纯化和裂解，以及抑肽酶衍生物的获得

发酵液上清过金属螯合层析柱，经洗涤后，洗脱，收集洗脱峰。洗脱液透析后，用酶或者化学物质裂解反应。(如用有毒物质裂解，要进行脱毒处理)反应液稀释后过金属螯合层析柱，洗涤，收集流出液，流出液经透析后，过SP-Sepharose柱，经洗脱后，取样分析，得到抑肽酶衍生物，经SDS-PAGE和RP-HPLC检测，其纯度大于98％。

本专业的技术人员在不违背本专利的精神的情况下，所作出的变动仍在本专利的保护范围内。

图1是本发明制备方法的流程图。

本发明方法构建的抑肽酶衍生物基因工程菌表达量高，产生的抑肽酶衍生物纯度高，完全具有天然抑肽酶的生理活性。

附图说明

图1.本发明制备方法的流程图

图2.APN fusion的构建

图3.pPICZaA-APN fusion表达载体的构建

图4.发酵诱导表达Met-APN fusion还原型SDS-PAGE电泳图谱

A.未经甲醇诱导时的发酵上清液，上样22.5μL；B、C、D、E、F、G、H分别为甲醇诱导8、16、24、32、40、48小时后的发酵上清液，上样22.5μL；I.蛋白质中分子量标准(LMW Marker Kit，Amersham Pharmacia Biotech)。

图5.Pro-APN fusion酸裂解还原型SDS-PAGE电泳图谱

A、B为酸裂解的产物，C为融合蛋白，D为aprotinin标准品

图6.抑肽酶衍生物(SEQ ID NO：1)的质谱

图7.本发明实例中提到的抑肽酶衍生物的氨基酸序列同抑肽酶的氨基酸序列比较

具体实施方式

实施例1：

抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白APN fusion的构建及相应的核酸序列的设计和合成

实施例1.1：

Met-APN fusion(SEQ ID NO：4)的构建及相应核苷酸序列的获得

我们设计如图1的序列。该序列的特点如下：

1)该序列将凝胶蛋白片段(SEQ ID NO：2)通过连接肽和抑肽酶衍生物(SEQID NO：1)相连，连接肽和抑肽酶衍生物之间有一个甲硫氨酸，为溴化氰裂解位点。这里的抑肽酶衍生物为52Leu抑肽酶。

2)为了便于分离纯化，在凝胶蛋白片段N端第8个氨基酸后插入6个His(SEQ ID NO：3)。

3)在凝胶蛋白片段之前的EAEA序列作为Ste 13的切割识别位点，在EAEA序列之前加LEKR作为Kex2酶切识别位点。

4)为了便于克隆，将Kex2酶切识别位点的LE设计为CTCGAG，它可被XhoI识别；在抑肽酶衍生物序列之后加终止密码子TGA，紧接着是NotI的酶切位点GCGGCCGC。

5)上述DNA序列(Met-APN fusion DNA)是用甲醇酵母偏好密码子设计。Met-APN fusion DNA(SEQ ID NO：5)委托上海生宏生物公司合成。该序列克隆到载体PUC18，经DNA测序分析，与设计完全一致。

实施例1.2：Pro-APN fusion(SEQ ID NO：7)和Gly-APN fusion(SEQ ID NO：10)的构建及相应核苷酸序列的获得

用酸裂解位点Asp-Pro和Asp-Gly分别替换Met-APNfusion溴化氰裂解位点Met，同时将52Leu替换为Met，就得到Pro-APN fusion和Gly-APN fusion。通过酸裂解分别可得到Pro-aprotinin(SEQ ID NO：6)或Gly-aprotinin(SEQ IDNO：9)。

按照《分子克隆》的方法以Met-APN fusion DNA为最初的模板，分别用PCR的方法实现上述替换，得到Pro-APN fusion DNA(SEQ ID NO：8)和Gly-APNfusion DNA(SEQ ID NO：11)。

实施例1.3：TEV-APN fusion(SEQ ID NO：12)的构建及相应核苷酸序列的获得

用TEV酶裂解位点GluAsnLeuTyrPheGlnGlyGly替换Met-APN fusion溴化氰裂解位点Met，同时将52Leu替换为Met，就得到TEV-APNfusion。通过TEV裂解分别可得到GlyGly-aprotinin(SEQ ID NO：13)。

按照《分子克隆》的方法以Met-APN fusion DNA为最初的模板，分别用PCR的方法实现上述替换，得到TEV-APN fusion DNA(SEQ ID NO：12)。

实施例2：

APN fusion表达菌株的构建

1)选用pPICZαA为表达载体。该载体作为穿梭质粒，其特点为，有一个强的启动子(AOX1)，可分泌表达，Zeocin^r为其抗性筛选标记，容易筛选到高考贝的菌株，可在XhoI和NotI之间插入外源基因。

2)用XhoI-NotI双切PUC18质粒得到DNA片段，克隆到pPICZαA的XhoI-NotI位点，构建重组质粒pPICZαA-APN fusion。

3)重组质粒经测序分析正确后，用SacI酶切线性化处理后，电转化宿主菌X33感受态细胞，并涂布分别含有100、200、300、400μg/mL Zeocin的四块YPD平板，大量挑取单菌落，接种YPD液体培养基，用摇瓶筛选，SDS-PAGE电泳检测，挑出表达量最高的一株作为工程菌株记为pPICZαA-APN fusion/x33。

实施例3：

APN fusion基因工程菌的高密度发酵

采用分批补料发酵的方式。

1)种子液的制备

取甘油保存管，按1∶100的比例接人装20mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃，250r/min，培养16-24小时。然后按1∶10的比例接人装500mL种子培养基的1000mL三角瓶中，30℃，250r/min，培养12小时。镜检无杂菌。

2)9L分批补料高密度发酵

按1∶10的接种比例，将种子液接入已预先灭菌装有4.5L分批发酵培养的9L发酵中进行分批补料培养(温度控制在30℃，用氨水将pH调为至5.0左右)，当碳源耗尽后(Do陡然上升，1min内)，流加补料生长培养基(流加速率维持溶氧大于20％)。当菌体湿重为200克/L左右停止补料，甘油耗尽后，补入甲醇诱导表达(pH用25％氨控制为3.0，温度控制在20℃)，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速率使溶氧大于20％，并且停止补加甲醇后，溶氧在1min内可升高10％。在发酵的过程中，空气流量保持在5-20L/min，罐压保持在0.5-0.8bar。每八小时取样一次。离心的上清液，用上清液做SDS-PAGE电泳，每孔加入20μL上清液，用靠马斯亮蓝染色。图4.发酵液中APN fusion的还原型SDS-PAGE电泳图谱。

实施例3：

APN fusion分离纯化、裂解和抑肽酶衍生物的获得

APN fusion分离纯化

发酵上清液过含有20mM磷酸钠盐缓冲液(pH 7.8)预平衡的Ni(II)-Chelating Sepharose FF柱，以含20mM磷酸钠盐缓冲液(pH7.8)洗涤10个柱体积后，以20mM柠檬酸钠盐缓冲液(pH 3.0)洗脱，收集洗脱峰。融合蛋白的裂解

Met-APN fusion是按下述方式裂解的：

用旋转蒸发仪将上述洗脱峰真空浓缩到0.3克/mL，再加入甲酸为浓缩液体积的二倍，混匀后，按10mg/334mg(融合蛋白)的比例加入溴化氰，在22℃、保温16-18小时。然后用旋转蒸发仪真空浓缩到原来的体积。

Pro-APN fusion和Gly-APN fusion是按下述方式裂解的：

将Pro-APN fusion或Gly-APN fusion过金属鳌合层析的洗脱液，加入浓盐酸到终浓度0.01N，80℃，保温2-4小时。取样电泳直到完全裂解。调pH到中性。抑肽酶衍生物的获得

稀释后过预先用缓冲液(20mM PB，pH 7.8)平衡Ni(II)-Sepharose FF，经洗脱后，收集洗脱液。洗脱液过预先用缓冲液平衡SP Sepharose FF柱，再用缓冲液(0.6M NaCl、20mM PB，pH 6.0)洗脱，收集流出液，取样分析，得到抑肽酶衍生物。经SDS-PAGE和RP-HPLC检测，其纯度均大于98％。

实施例4：

抑肽酶衍生物的生物活性

按照中国药典上的方法，利用抑肽酶衍生物对胰蛋白酶的抑制实验和滴定分析来测定。就是抑制胰酶催化的N-苯甲酰基-L-精氨酸乙脂(BAEE)的水解，通过酸碱滴定测定反应中释放的羧基基团。胰蛋白酶的残留活性是活性化合物抑制活性的度量标准。

实验时，我们用天然抑肽酶(珠海丽珠集团的赫泰林)作对照，结果表明用这种基因工程方法制备的抑肽酶衍生物的比活与天然的抑肽酶一样。

序列表

(1)一般资料

(i).申请人：肖建国

(ii).发明题目：一种甲醇酵母制备抑肽酶衍生物的新方法

(iii).序列数目：11

(2)SEQ ID NO：1的资料

(i).序列特征：

a.长度：58个氨基酸

b.类型：氨基酸

c.链型：单链

d.拓扑学：未知

(ii).分子类型：多肽

(iii).序列描述：SEQ ID NO：1

1  RPDFCLEPPY TGPCKARIIR YFYNAKAGLC QTFVYGGCRA KRNNFKSAED  50

51 CLRTCGGA                                                58

(3)SEQ ID NO：2的资料：

(1).序列特征：

a.长度：17个氨基酸

b.类型：氨基酸

c.拓扑学：未知

(2).分子类型：多肽

(3).序列描述：

1 GPPGEPGNGS PGNQGQP        17

(4)SEQ ID NO：3序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：23个氨基酸

b.类型：氨基酸

c.拓扑学：未知

(2).分子类型：多肽

(3).序列描述：SEQ ID NO：3

1 GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQP        23

(5)SEQ ID NO：4序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：88个氨基酸

b.类型：氨基酸

c.拓扑学：未知

(2).分子类型：多肽

(3).序列描述：SEQ ID NO：4

1  GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQPGGSGGGM RPDFCLEPPY TGPCKARIIR    50

51 YFYNAKAGLC QTFVYGGCRA KRNNFKSAED CLRTCGGA                 88

(6)SEQ ID NO：5序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：299bp

b.类型：核苷酸

c.拓扑学：线性

(2).分子类型：人工合成DNA

(3).序列描述：SEQ ID NO：5

1   CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTGGTCCA CCCGGTGAGC CAGGTAACCA     50

51  TCATCATCAT CATCATGGATC TCCTGGTAA CCAAGGACAG CCCGGTGGTT    100

101 CCGGTGGTGG TATGAGACCT GACTTCTGTT TAGAGCCACC ATACACTGGA    150

151 CCATGCAAGG CCCGTATTAT TAGATACTTT TACAACGCTA AGGCCGGACT    200

201 GTGTCAAACT TTCGTTTACG GTGGATGTAG AGCTAAGAGA AACAACTTCA    250

251 AGTCTGCTGA GGACTGTTTA AGAACCTGTG GTGGTGCTTG AGCGGCCGC     299

(7)SEQ ID NO：6的资料

(i).序列特征：

a.长度：59个氨基酸

b.类型：氨基酸

c.链型：单链

d.拓扑学：未知

(ii).分子类型：多肽

(iii).序列描述：SEQ ID NO：6

1  PRPDFCLEPP YTGPCKARII RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE  50

51 DCMRTCGGA                                               59

(8)SEQ ID NO：7序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：89个氨基酸

b.类型：氨基酸

c.拓扑学：未知

(2).分子类型：多肽

(3).序列描述：SEQ ID NO：7

1  GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQPGGSGGGD PRPDFCLEPP YTGPCKARII    50

51 RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE DCMRTCGGA                89

(9)SEQ ID NO：8序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：302bp

b.类型：核苷酸

c.拓扑学：线性

(2).分子类型：人工合成DNA

(3).序列描述：SEQ ID NO：8

1   CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTGGTCCA CCCGGTGAGC CAGGTAACCA     50

52  TCATCATCAT CATCATGGAT CTCCTGGTAA CCAAGGACAG CCCGGTGGTT    100

101 CCGGTGGTGG TGATCCTAGA CCTGACTTCT GTTTAGAGCC ACCATACACT    150

151 GGACCATGCA AGGCCCGTAT TATTAGATAC TTTTACAACG CTAAGGCCGG    200

201 ACTGTGTCAA ACTTTCGTTT ACGGTGGATG TAGAGCTAAG AGAAACAACT    250

251 TCAAGTCTGC TGAGGACTGT ATGAGAACCT GTGGTGGTGC TTGAGCGGCC    300

301 GC                                                        302

(10)SEQ ID NO：9的资料

(i).序列特征：

a.长度：59个氨基酸

b.类型：氨基酸

c.链型：单链

d.拓扑学：未知

(ii).分子类型：多肽

(iii).序列描述：SEQ ID NO：9

1  GRPDFCLEPP YTGPCKARII RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE  50

51 DCMRTCGGA                                               59

(11)SEQ ID NO：10序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：89个氨基酸

b.类型：氨基酸

c.拓扑学：未知

(2).分子类型：多肽

(3).序列描述：SEQ ID NO：10

1  GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQPGGSGGGD GRPDFCLEPP YTGPCKARII    50

51 RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE DCMRTCGGA                89

(12)SEQ ID NO：11序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：302bp

b.类型：核苷酸

c.拓扑学：线性

(2).分子类型：人工合成DNA

(3).序列描述：SEQ ID NO：11

1   CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTGGTCCA CCCGGTGAGC CAGGTAACCA     50

53  TCATCATCAT CATCATGGAT CTCCTGGTAA CCAAGGACAG CCCGGTGGTT    100

101 CCGGTGGTGG TGATGGTAGA CCTGACTTCT GTTTAGAGCC ACCATACACT    150

151 GGACCATGCA AGGCCCGTAT TATTAGATAC TTTTACAACG CTAAGGCCGG    200

201 ACTGTGTCAA ACTTTCGTTT ACGGTGGATG TAGAGCTAAG AGAAACAACT    250

251 TCAAGTCTGC TGAGGACTGT ATGAGAACCT GTGGTGGTGC TTGAGCGGCC    300

301 GC                                                        302

(12)SEQ ID NO：12序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：320bp

b.类型：核苷酸

c.拓扑学：线性

(2).分子类型：人工合成DNA

(3).序列描述：SEQ ID NO：12

1   CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTGGTCCA CCCGGTGAGC CAGGTAACCA     50

54  TCATCATCAT CATCATGGAT CTCCTGGTAA CCAAGGACAG CCCGGTGGTT    100

101 CCGGTGGTGG TGAGAACCTG TACTTTCAAG GTGGTAGACC TGACTTCTGT    150

151 TTAGAGCCAC CATACACTGG ACCATGCAAG GCCCGTATTA TTAGATACTT    200

201 TTACAACGCT AAGGCCGGAC TGTGTCAAAC TTTCGTTTAC GGTGGATGTA    250

251 GAGCTAAGAG AAACAACTTC AAGTCTGCTG AGGACTGTAT GAGAACCTGT    300

301 GGTGGTGCTT GAGCGGCCGC                320

(10)SEQ ID NO：13的资料

(i).序列特征：

a.长度：60个氨基酸

b.类型：氨基酸

c.链型：单链

d.拓扑学：未知

(ii).分子类型：多肽

(iii).序列描述：SEQ ID NO：13

1 GGRPDFCLEP PYTGPCKARI IRYFYNAKAG LCQTFVYGGC RAKRNNFKSA  50

DCMRTCGGA