赛葵黄脉病毒卫星的组成型表达启动子

摘要

本发明公开了一种赛葵黄脉病毒卫星的组成型表达启动子。该启动子来自于与赛葵黄脉病毒相伴随的卫星分子DNAβ。分离的启动子是该DNAβ分子的βC1 ORF的全长启动子及部分缺失启动子序列。实验表明来自于赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1 ORF的启动子为组成型表达的启动子。本发明涉及了赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1 ORF的全长启动子和缺失启动子序列以及含有该βC1 ORF全长启动子和缺失启动子序列的表达盒。

说明书

技术领域

本发明涉及一种赛葵黄脉病毒卫星的组成型表达启动子。具体地说，本发明涉及赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1 ORF全长启动子序列及其缺失启动子序列的分离、鉴定。本发明也涉及含有连接异源基因的赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF全长启动子和缺失启动子的载体盒的构建。另外，本发明也涉及用含有赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF各种启动子的表达载体进行瞬间表达和稳定表达的方法。

背景技术

植物基因工程的目的是将外源基因导入受体植物后使其正确而有效地表达。而适合的启动子是外源基因有效表达的关键因素。

目前，已有许多不同来源的启动子被用于植物品质改良基因工程、抗病育种基因工程以及植物生物反应器等基因工程领域。这些启动子中一大类是从根癌农杆菌中分离出来，另一大类为植物本身来源的启动子。但是由于上述启动子控制的目标基因表达量往往较低，以及与受体植物细胞基因组序列具有一定的同源性，所以在植物遗传转化中通常选用植物病毒启动子。已经鉴定的植物病毒启动子，主要包括组成型表达启动子和组织特异性表达启动子。组成型启动子具有在双子叶植物、单子叶植物以及真菌中都能驱动外源基因的表达，不受时空限制，表达量恒定的优势。目前在植物基因表达中广泛应用的组成型启动子有，大多数双子叶转基因植物中使用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。

DNAβ分子是与某些单组份双生病毒相伴随的卫星分子。该分子大小约1.3kb，是其辅助病毒基因组的一半左右。DNAβ分子依赖于其辅助病毒进行DNA复制、移动和包裹。其基因组中存在一个高度保守的βC1ORF，已有研究表明该编码区表达的蛋白是一种致病相关因子，其缺失并不影响DNAβ分子的复制，并且已有实验表明DNAβ分子可以做为表达载体进行遗传操作。本发明的开展一方面通过了解决定致病相关蛋白βC1的启动子的活性，可以深入了解相关蛋白的表达强度，并且能反映该表达载体的表达效率；另一方面，由于已鉴定的来源于中国番茄黄化曲叶病毒相伴随的DNAβ分子的启动子为韧皮部特异性表达的启动子，烟草曲茎病毒相伴随的DNAβ分子的启动子为组成型表达的启动子，而赛葵黄脉病毒相伴随的DNAβ分子和上述DNAβ分子在致病表型上有比较大的差异，因此期望赛葵黄脉病毒DNAβ分子的启动子在表达类型和表达强度上也有别于上述DNAβ分子的启动子，既为植物基因表达提供一些有价值的表达元件，也为不同类型DNAβ分子的致病性机理研究打下良好的分子生物学方面的基础。鉴于βC1ORF启动子是影响病毒卫星载体表达效率的重要因素，而该启动子的表达类型也决定了其在植物遗传转化中的应用价值，本发明鉴定了赛葵黄脉病毒相伴随的DNAβ分子中βC1ORF的全长启动子的表达活性及表达类型以及缺失启动子的表达活性或表达类型。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种赛葵黄脉病毒卫星的组成型表达启动子。

赛葵黄脉病毒卫星的组成型表达启动子DNA序列为赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF的全长启动子SEQ ID NO：1或其缺失启动子SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3所示DNA序列。

DNA构建体包括权利要求1所述的启动子DNA序列以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因包括杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因和抗细菌基因。

利用植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或抗细菌基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

(a)以可表达的方式将杀虫剂基因、除草剂基因、抗真菌基因、抗病毒基因或抗细菌基因连接到权利要求1所述的启动子DNA序列下游以获得重组DNA片段；

(b)将该重组DNA片段插入植物表达载体中；

(c)用上述重组表达载体转化植物细胞；

(d)培养该植物细胞表达杀虫剂基因、抗除草剂基因、抗真菌基因、抗病毒基因或抗细菌基因。

利用植物细胞制备蛋白质的方法包括如下步骤：

(a)以可表达的方式将编码所需蛋白质的DNA连接到权利要求1所述的启动子DNA序列下游，获得重组DNA片段；

(b)将重组DNA片段插入表达载体中，获得重组表达载体；

(c)重组表达载体经农杆菌或基因枪法转化植物细胞，培养转化的植物细胞以表达所需的蛋白质；

(d)从培养物中回收所需的蛋白质。

表达载体含有权利要求1所述的启动子DNA序列，其中所述载体是适用于植物细胞的质粒载体或表达载体，所述载体能够插入杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或抗细菌基因。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：

1)应用本发明中的启动子，在植物抗病毒基因工程中可以实现有效的抗病目的。虽然许多植物病虫害，特别是一些刺吸式昆虫的直接侵害目标主要是在韧皮部，但是也有一些病虫害是系统侵染植物除了韧皮部以外的其它组织。采用转基因方法对这些病毒病以及病虫害的进行防治，如果应用组织特异性启动子，那么其作用效果只能局限在植物的某些部位，不能将病虫害完全有效的控制。所以在此类抗病虫防治过程中应用组成型启动子就显得尤为重要。组成型启动子与组织特异性启动子相比，它能持续高效地表达目的基因，能有效控制病虫害在整个植株中蔓延，使植物各类组织细胞都得到保护。组织化学染色法结果表明，本发明中的全长启动子和较小缺失启动子在转基因植株根、茎、叶的皮层细胞，叶肉细胞以及维管组织的韧皮部，部分木质部中都能够表达(如图6，图7)。组成型表达的强启动子，通常会导致外源基因在植株体内的过量表达，从而对植株生长发育产生负面影响。本发明中全长启动子活性明显强于缺失启动子的活性，但与强组成型表达启动子CaMV 35S启动子活性相比，全长启动子活性仅是它的28.05％，所以该启动子驱动的外源基因的表达量并不会对植株的生长发育产生不利影响。综合本发明中启动子的组成型表达和非过量表达外源基因的优点，应用于植物抗病基因工程中能够达到经济有效的抗病目的。

2)应用本发明中的组成型表达启动子，可以高效表达外源基因，增加外源蛋白的产量。组成型表达的启动子在植物的所有组织中以及生长发育的所有阶段都能启动基因表达，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也是相对恒定的。如果要生产某种目的蛋白，应用组成型表达的启动子蛋白表达量明显高于组织特异性启动子。

3)应用本发明中的启动子，可以有效进行植物转基因工程。

植物基因工程中使用的植物来源的启动子由于与受体植物基因组具有一定的同源性，往往会在寄主植物体内引起基因沉默现象而造成外源基因失活。这种现象在多基因转化时更为普遍。而本发明中的启动子，由于与植物基因组序列没有同源性，所以能够避免基因沉默现象的发生。此外，大量研究表明，侵染双子叶植物的病毒来源的启动子可有效地应用于单子叶植物的遗传转化。本发明中的启动子来源于侵染双子叶植物的病毒卫星分子，开发该启动子应用于多种作物(包括禾谷类)的基因转化，应用前景将会十分广阔。

附图说明

图1是赛葵黄脉病毒DNAβ分子的βC1ORF启动子的结构图。以βC1ORF的转译起始位点(ATG)为+1位；

图2是启动子表达载体构建图。克隆后的启动子片段分别经限制性内切酶HindⅢ/BamHI和EcoRI/SacI双酶切后插入表达载体pINT121和pCHF3：eGFP的同酶切位点，构建成启动子表达载体；

图3是对照表达载体构建图。表达载体pINT121经限制性内切酶BamH I/EcoR I双酶切后产生的GUS-NOS片段与BamH I/EcoR I双酶切后的pBINPLUS载体片段连接，构建成表达载体pBINGUS，其中pINT121用于阳性对照，pBINGUS用于阴性对照；

图4是各启动子的瞬时表达GUS活性分析A，各启动子的多次重复GUS活性；B，各启动子的相对平均GUS活性。A，B中pBINGUS为阴性对照，pINT121为阳性对照，n代表每个启动子的独立实验重复次数。通过统计软件SAS 8.0中的多重比较方法ANOVA中的LSD检验对实验数据进行差异显著性分析(P＜0.05orP＜0.01)，误差线代表标准差；

图5是各启动子的瞬时表达GFP荧光强度分析a.pCHF3：eGFP为阳性对照；b.pCHF3-991：eGFP；c.pCHF3-991Δ573：eGFP；d.pCHF3-991Δ777：eGFP；e.pCHF3为阴性对照；

图6是全长启动子991(a-e)的转基因染色图片。a.茎部横切面；b.叶片背面；c.叶片横切面；d.根纵切面；e.根部。rc，根冠；vb，维管束；X，木质部；ip，内韧皮部；ep，外韧皮部；pm，栅栏组织；sm，海绵组织；bar＝25μm；

图7是缺失启动子991Δ777的转基因染色图片(a-e)；a.根部；b.叶片背面；c.叶片横切面；d.茎横切面；e.根部纵切面。rc，根冠；vb，维管束；X，木质部；ip，内韧皮部；ep，外韧皮部；pm，栅栏组织；sm，海绵组织；bar＝25μm。

具体实施方式

赛葵黄脉病毒卫星的组成型表达启动子DNA序列为赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF的全长启动子SEQ ID NO：1或其缺失启动子SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3所示DNA序列。

DNA构建体包括权利要求1所述的启动子DNA序列以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因包括杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因和抗细菌基因。

利用植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或抗细菌基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

(a)以可表达的方式将杀虫剂基因、除草剂基因、抗真菌基因、抗病毒基因或抗细菌基因连接到权利要求1所述的启动子DNA序列下游以获得重组DNA片段；

(b)将该重组DNA片段插入植物表达载体中；

(c)用上述重组表达载体转化植物细胞；

(d)培养该植物细胞表达杀虫剂基因、抗除草剂基因、抗真菌基因、抗病毒基因或抗细菌基因。

利用植物细胞制备蛋白质的方法包括如下步骤：

(a)按照编码所需蛋白质的DNA以被表达的方式将该DNA连接到权利要求1所述的启动子DNA序列下游，获得重组DNA片段；

(b)将重组DNA片段插入表达载体中，获得重组表达载体；

(c)重组表达载体经农杆菌或基因枪法转化植物细胞，培养转化的植物细胞以表达所需的蛋白质；

(d)从培养物中回收所需的蛋白质。

表达载体含有权利要求1所述的启动子DNA序列，其中所述载体是适用于植物细胞的质粒载体或表达载体，所述载体能够插入杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或抗细菌基因。

本发明提出的对转化烟草植株的基因表达产物进行检测，以评价启动子的表达强度，并且分析启动子在植物体内表达的组织化学定位，使用了许多对本领域技术人员来说非常熟知的技术，其中包括不限于用于GUS酶活性分析的荧光分光光度法，用于组织化学分析的徒手切片法等技术。

本发明描述了能组成型表达的赛葵黄脉病毒卫星启动子，它是与赛葵黄脉病毒相伴随的DNAβ分子(NC_004733.1)的βC1ORF启动子。本发明中以感染有赛葵黄脉病毒的烟草植物总DNA为模板，克隆并鉴定了赛葵黄脉病毒相伴随的DNAβ分子的βC1ORF全长启动子以及缺失启动子，序列表显示了各启动子的序列。赛葵黄脉病毒相伴随的DNAβ的βC1ORF全长启动子的全部天然序列有991个碱基对(启动子的序列为SEQ ID NO：1)，根据DNAβ分子基因组的结构特征，对全长启动子进行缺失。缺失启动子991Δ573的特征是缺失全长启动子中-419至-991的片段(启动子的序列为SEQ ID NO：2)，991Δ777的特征是缺失全长启动子中-215至-991的片段(启动子的序列为SEQ ID NO：3)，在启动子的活性分析中发现，这两个缺失启动子仍保留了活性(图4)。

本发明描述了植物细胞中基因产物表达的方法。将已克隆的启动子与β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)融合构建植物表达载体，通过农杆菌浸润法使GUS基因在烟草植物细胞中进行瞬间表达；将构建后的植物表达载体通过叶盘法转入烟草细胞中，使GUS基因在烟草细胞中进行稳定表达。

本发明还描述了植物细胞中GUS活性的鉴定和检测方法。在植物细胞的瞬间表达体系中，将植物组织进行组织化学染色后通过蓝色位点的出现与否可以鉴定其GUS基因是否表达；通过荧光光度分析来检测其表达活性。本发明中的实验证明βC1ORF全长启动子的启动子活性是CaMV 35S启动子的28.05％，表达活性最小序列位于缺失启动子991Δ777；将全长启动子和缺失启动子991Δ777的表达载体通过叶盘法转入烟草植株中，GUS组织化学染色后通过蓝色位点的表达部位进一步鉴定其上游启动子的表达类型。结果表明，βC1ORF全长启动子及其缺失启动子991Δ777能够驱动GUS基因在转基因植株根、茎、叶等器官中组成型表达，具有同样的表达模式。

本发明中的赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF全长启动子和其缺失启动子可组成型表达所需要的任何异源基因。异源基因的例子包括：杀虫毒素基因，除草剂抗性基因，抗真菌基因，抗病毒基因，其它抗微生物的基因。

本发明中将含有赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF启动子和异源基因的构建体插入到一种载体中，用该载体转化植物细胞，优选的载体对于植物而言可以是一种根癌农杆菌(agrobacterium)Ti质粒衍生物，该质粒衍生物通过农杆菌介导的双元载体技术导入植物细胞，这种技术是本领域内所熟知的。将已转化植物细胞培养于一种合适培养基中，并再生出植株。

本发明包括来自于赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF全长启动子和缺失启动子DNA序列以及含有以上序列的DNA构建体。同时，本发明还包括是赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF启动子的“功能等同物”的DNA序列，以及含有有效连接到异源基因上的这样的DNA序列的构建体。

本发明还包括使用如本文所述的βC1ORF启动子的“功能等同物”赋予处于它们控制下的任何基因的组成型表达。

本发明中使用的术语“启动子活性”是指当以该基因的可表达方式将有效基因连接到启动子的下游，并导入到宿主(植物细胞)中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该有效基因产物的功能。通常是将容易定性、定量检测的蛋白质编码基因(报告基因)连接至启动子的下游，然后将构建后的基因导入宿主内，检测表达蛋白情况，以此来确定是否存在特定启动子的活性以及其效力如何。

“缺失启动子”是指任何有缺失而仍具有启动子活性的赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF启动子。

“功能等同物”是指在严格杂交条件下与一个DNA序列互补的任何DNA序列，该序列与该参照物杂交并且有类似于赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF启动子的活性。

采用下面的非限制性实施例对本发明作进一步描述。

实施例1赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF启动子片段的克隆以及序列测定

基本上按照Sambrook等所述方法(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1989)实施分子技术。以感染赛葵黄脉病毒的赛葵植株为材料，用CTAB法提取植物总DNA[Murray MG et al.，1987，EMBO J，6：3901～3907]。预扩增的各启动子片段见图1。以植物总DNA为模板，通过特异性引物扩增赛葵黄脉病毒DNAβ的βC1ORF的各启动子片段。引物FL(5’GAATTCAAGCTTTTTCAAATAACAGATCATCAAG 3’，相应于SEQ ID NO：1中的1-22位，引入了EcoRI、HindIII位点)和RL(5’GAGCTCGGATCCCTTGCTTGTGTGATGGAAGTG 3’，相应于SEQ ID NO：1中的991-971位，引入了SacI、BamHI位点)扩增全长启动子(SEQID NO：1)。引物FL(5’GAATTCAAGCTTTTATTATTTTTTTCTTT TTTTCTTC3’，相应于SEQ ID NO：4中的1-25位，引入了EcoRI、HindIII位点)和RL(5’GAGCTCGGATCCCTTGCTTGTGTGATGGAAGTG 3’，相应于SEQ IDNO：2中的418-398位，引入了SacI、BamHI位点)扩增缺失启动子(SEQ ID NO：2)。引物FL  (5’GAATTCAAGCTTCTCATGTGTACGTATA TATACG 3’，相应于SEQ ID NO：3中的1-22位，引入了EcoRI、HindIII位点)和RL(5’GAGCTCGGATCCCTTGCTTGTGTGATGGAAGTG 3’，相应于SEQ IDNO：3中的214-194位，引入了SacI、BamHI位点)扩增缺失启动子(SEQ ID NO：3)。扩增后的PCR产物经HindIII/BamHI或EcoRI/SacI直接酶切后经QiaGene凝胶纯化试剂盒回收目的片段，用Sanger双脱氧链终止法测序验证后用于载体构建。

实施例2启动子表达载体及GUS融合表达载体的构建

用限制性酶HindIII/BamHI或EcoRI/SacI分别酶切消化双元表达载体pINT121(Liu et al，Planta，2003，216：824-833)，pCHF3：GFP。将酶切后的全长启动子和各缺失启动子片段插入对应的同酶切位点，构建为启动子表达载体(图2)：全长启动子构建体为pβC1-991，pCHF3-991：eGFP，缺失启动子pβC1-991Δ573、pβC1-991Δ777，pCHF3-991Δ573：eGFP、pCHF3-991Δ777：eGFP。

用BamHI和EcoR I双酶切表达载体pINT121，切割下的GUS-NOS片段插入到表达载体pBINPLUS(该载体的构建见Transgenic Research，1995，4，288-290)的BamHI/EcoR I位点中，构建后的载体为pBINGUS，该载体作为阴性对照，载体pINT121作为阳性对照；载体pCHF3：GFP包含CaMV 35S-GFP-nos表达盒，作为阳性对照(图3)；空载体pCHF3作为阴性对照。

实施例3农杆菌转化

将各启动子构建物通过电击法导入农杆菌宿主细胞：参照文献[DiethardMattanovich et al.，1989.Nucleic Acids Research，17：6747]，具体方法如下：28℃，200rpm条件下培养根癌土壤杆菌16h左右，用1.5ml离心管取1.5ml菌液，8000rpm离心30s后去残液，将沉淀用1ml ddH₂O充分悬浮，再8000rpm离心30s，重复以上步骤3次。去掉残液后将沉淀用200μl ddH₂O悬浮，即为电击农杆菌感受态。取200ng重组质粒至200μl感受态，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。装好电击装置，电压为2500V，双手一起按住电击按钮，直到啪的一声即电击完毕。室温静止2min后加入800μl YEP培养基，28℃静置1h，然后28℃200rpm振荡2h(电击后马上加入培养基)。8000rpm离心30s收集菌液，沉淀用200μl ddH₂O悬浮后涂板。用特异性引物对其进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。

实施例4启动子的瞬间表达

1)农杆菌的培养及诱导：参照文献[Jyoti Kapila et al.，1997.Plant Science122：101-108]将各启动子表达载体的农杆菌菌液接种于含相应抗生素的液体培养基YEB(5g/L牛肉浸膏，1g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，5g/L蔗糖，2mM硫酸镁，pH5.8)中，培养至对数生长期，离心收集菌体，重悬于MMA溶液(10mmol/L2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES，pH 5.6)、100μmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L氯化镁)，并调整菌液浓度使其OD₆₀₀＝1.5，室温静置放置3h。

2)瞬间表达：参照文献[刘兆明等，2002，生物工程学报18卷4期：411-414；Yinong Yang et al.2000.The Plant Journal，22(6)，543-551]对植株叶片采取农杆菌浸润法。具体方法：选取6-7周龄本氏烟植株中部未完全展开叶片，取一支1ml的一次性注射器，摘掉针头，用针管靠压力将500μl重悬菌液完全注入每片叶片的脉间细胞中。将农杆菌浸润和农杆菌注射后的植株于25℃恒温室中培养，光照周期为16/8小时。60-72h后取样进行GUS荧光活性分析和GFP荧光检测。

实施例5GUS检测

荧光光度测定法：参照文献[Jefferson RA et al.EMBO J，1987，6：3901～3907.]将采样后的植株叶片经液氮研磨，加入3倍体积的GUS提取液(50mmol/L磷酸缓冲液pH 7.0，10mmol/L乙二胺四乙酸二钠，0.1％(w/v)Triton X-100，0.1％(w/v)十二烷基肌氨酸钠，10mmol/L β-巯基乙醇)，离心后取上清10ul与4-MUG(4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸)反应，荧光光度仪测定GUS活性。如图4，A为各个启动子构建物多次重复后(重复次数不小于6)测得的GUS活性，B为各启动子构建物的平均表达活性。实验数据通过SAS8.0软件的多次重复比较ANOVA的LSD方法进行分析，以阳性对照pINT121的35S启动子活性为参照，结果表明全长启动子991的活性是阳性对照的28.05％，缺失启动子991Δ573的活性是35S启动子活性的27.89％，缺失启动子991Δ777的活性是35S启动子活性的7.86％。而且全长启动子991与缺失启动子991Δ573没有显著性差异(P＞0.05)；两者与阳性对照pINT121之间存在极显著性差异(P＜0.01)，具体数据见表1。

表1

注：-代表无缺失片段；表中相对活性以CaMV 35S启动子为参照。

GFP荧光检测：将浸润后的本氏烟叶片，在载玻片上滴一滴水，取烟草叶片浸润部位并背面朝上铺于载玻片上，盖上盖玻片后倒置于激光共聚焦显微镜下，用蓝光激发，观察烟草表皮细胞中绿色荧光表达情况，分析启动子表达活性并拍照记录(图5)。

实施例6植物转化

从健康普通烟烟草植株上采集叶片，参照文献[Horsch RB et a1.，Science，1985，227：1229～1231]。具体如下：将消毒后切好的烟草叶片小块置于无抗的分化培养基上预培养2天。然后用培养至对数生长期的农杆菌菌液进行转化，置于无抗的分化培养基上暗培养2天，再转至抗性培养基上(卡那霉素100mg/L和羧苄青霉素500mg/L)培养。待抗性小芽长至约1厘米时切下，移至生根培养基中(卡那霉素100mg/L和羧苄青霉素100mg/L)，长至一个月大小的抗性小苗用于组织化学分析。

实施例7组织切片

切芽一个月后，随机选取3株PCR筛选到的阳性转基因小苗，分别将其根、茎制作徒手切片和小块，叶片切成小块，置于1mmol/L X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸)染色液中于37℃温育3至12小时。根、茎的徒手切片以及叶片小块用75％乙醇溶液脱水至阴性对照无色。染色后的根、茎及叶片的小块经2.5％戊二醛4℃固定过夜。用梯度浓度的乙醇溶液(50％，70％，80％，90％，95％，100％)对样品进行脱水处理，最后用环氧树脂包埋过夜。包埋好的各样品用半薄切片机进行切片，显微镜下观察照相。发现全长启动子991和缺失启动子991Δ777在转基因植株的根、茎及叶中均能表达。其中根冠和根尖分生区都有明显的GUS表达(图6，d)；在茎的切片中，皮层薄壁细胞及维管组织均观察到GUS表达位点，尤其是维管组织有较明显的GUS染色(图6，a)；在转基因植株叶片背部观察到明显的蓝色表达位点(图6，b)，叶片横切面的观察结果与此一致，在叶片的各类组织，包括栅栏组织、海绵组织以及维管组织中均观察到蓝色的表达位点(图6，c)。在缺失启动子991Δ777的转基因植株中也观察到了相同的表达模式(图7，a-e)，即在其根、茎、叶的皮层薄壁细胞，维管组织中韧皮部细胞，部分木质部细胞、叶肉细胞中都能表达gus基因，但强度较全长启动子略有下降。以上结果表明βC1ORF全长启动子991在植物细胞中具有组成型表达特性，且缺失启动子991Δ777能够保留其表达模式，说明在翻译起始位点上游-1～-214的区域中存在组成型表达的调控元件。

以上的实例是用来描述本发明，而不是限制本发明。由前面的描述来看，除了本文所说明和描述的外，本发明的各种修改对本领域技术人员来说是浅显易懂的。

序列表

(1)一般资料

(i)申请人：浙江大学

 

(ii)发明主题：赛葵黄脉病毒卫星的组成型表达启动子

(iii)序列数：3

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：991碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)推测：非

(iv)反义：非

(v)序列描述：SEQ ID NO：1

tttcaaataa cagatcatca agtagataat aagccttact ataatcaaca acataaacgg    60

acctaacacc caacaggcca ctttcaaagg cccaatcaca ttagatccaa ttcatatggc    120

ccaaatagaa gtcaaatcca gtcaaggcag tcagtgggac ccaccaagag ccatcggtca    180

ccgctcgccc acggtaatat tagaacgtgg gcgagctatg ctccggcgta gctaaggctg    240

ctgcgtagcg tagtggtttc taccctccca ggggtacaca ccgccgcgcg tgtcggaaaa    300

ttcgactccg atcaccggga aattgcatta gagcccaaaa caggagagag aatgttaact    360

ttttcggcgc actccgacgc gcctaacaga cacaaacacg ggggtatttt tggaaagtct    420

ttatttgtcc ccaaatgagg acccgatata ttggggacaa ttttacctat tggagacagg    480

ttttttatct cctttcaccc atttaccatt taccgcgcga taaatggtaa aaaccatact    540

caccttaaaa acgtcaccgt tcaaggtccc cattattatt tttttctttt tttcttctat    600

ctcaaacgac atcgttttcg agttttattt tttttttact tttttctttt cttttctggg    660

cttctttgtt tcgagtcgct gcgctcccat tttctttctt ggattatagt tctttctttg    720

ttttcgtttt ctttcctttt cagttcagtc tacgtttttc ttatcctttt tcttgttctc    780

atgtgtacgt atatatacgt acacacccca tgtattagga tttcaactcc acttcaccac    840

acatgtaata catctccatc atatctttaa agtattgatc cacaatcaca tattaaggga    900

taaatcactc acaaccacac aacaacacca aatatctcac agttagtcct ataaatgcat    960

gtatcacaca cacttccatc acacaagcaa g                                   991

 

(3)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：418碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)推测：非

(iv)反义：非

(v)序列描述：SEQ ID NO：2

tattattttt ttcttttttt cttctatctc aaacgacatc gttttcgagt tttatttttt    60

ttttactttt ttcttttctt ttctgggctt ctttgtttcg agtcgctgcg ctcccatttt    120

ctttcttgga ttatagttct ttctttgttt tcgttttctt tccttttcag ttcagtctac    180

gtttttctta tcctttttct tgttctcatg tgtacgtata tatacgtaca caccccatgt    240

attaggattt caactccact tcaccacaca tgtaatacat ctccatcata tctttaaagt    300

attgatccac aatcacatat taagggataa atcactcaca accacacaac aacaccaaat    360

atctcacagt tagtcctata aatgcatgta tcacacacac ttccatcaca caagcaag      418

 

(4)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：214碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)推测：非

(iv)反义：非

(v)序列描述：SEQ ID NO：3

ctcatgtgta cgtatatata cgtacacacc ccatgtatta ggatttcaac tccacttcac    60

cacacatgta atacatctcc atcatatctt taaagtattg atccacaatc acatattaag    120

ggataaatca ctcacaacca cacaacaaca ccaaatatct cacagttagt cctataaatg    180

catgtatcac acacacttcc atcacacaag caag                                214