假交替单胞菌、所产的κ-卡拉胶水解酶及其制备和应用

摘要

本发明公开了一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.3407。上述的假交替单胞菌WZU4771所产的κ-卡拉胶水解酶，能够水解κ-卡拉胶，最终得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。

说明书

技术领域

本发明涉及一种假交替单胞菌、所产的κ-卡拉胶水解酶及其制备和应用，属于微生物应用技术领域。

背景技术

海藻寡糖硫酸酯具有抗病毒、抗发炎、抗凝血、抗血栓、抗肿瘤等多种生物和生理功能，其功能决定于结构特征，譬如糖单元结构、分子量、硫酸酯化程度和硫酸酯化位置等(Liu J M，et al.Anticancer Res，2000，20：3265-3271)。

卡拉胶(又称角叉菜胶、鹿角菜胶)是许多海洋红藻细胞壁的主要组分，这类含有硫酸酯基团的线性多糖由交叉连接的(1→3)-β-D-半乳吡喃糖与(1→4)-α-D-半乳吡喃糖(或3，6-脱水-α-D-半乳吡喃糖)构成其骨架结构。商业上应用广泛的主要是κ-卡拉胶、ι-卡拉胶和λ-卡拉胶，它们在每个二糖单元上分别有1、2和3个硫酸酯。因此，卡拉胶的降解产物引起人们广泛的兴趣(MouH，et al.J Appl Phycol，2003，15：297-303)。现行的酸法水解条件过于强烈，往往造成卡拉胶易变但富有价值的骨架结构遭受破坏(Barbeyron T，et al.Mol BiolEvol，1998，15：528-537)。酶法水解很受期待(Knutsen S H，et al.Carbohydr Ploym，1992，19：199-210)，并且已经从噬纤维菌(Cytophaga，Potin P，et al.Eur J Biochem，1991，201：241-247)、假单胞菌(Pseudomonas，K，et al.Enzyme MicrobTechnol，1993，15：326-333)、弧菌(Vibrio，Araki T，et al.Fish Sci，1999，65：937-942)、交替单胞菌(Alteromonas，Michel G，et al.Acta Crystallogr D，2000，56：766-768)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas，Michel G，et al.Structure，2001，9：513-525)等海洋细菌中分离得到卡拉胶水解酶。但是，其应用因卡拉胶水解酶生产率过低而受到很大的限制(Dyrset N，et al.Enzyme Microb Technol，1997，20：418-423)。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种假交替单胞菌所产的κ-卡拉胶水解酶及其制备和应用。

本发明提供的假交替单胞菌WZU4771菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3407。

上述的假交替单胞菌菌株用于发酵得到κ-卡拉胶水解酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)发酵：将所述假交替单胞菌WZU4771接入含κ-卡拉胶的培养基中，温度20～35℃，优选25℃，培养24～48h，离心，取上清液。

2)分离：0～4℃下，将步骤1)所述上清液经(NH₄)₂SO₄盐析和DEAE-纤维素层析，冷冻干燥后，得到所述的κ-卡拉胶水解酶。具体步骤为：(1)向所述上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄至56％的饱和度，搅拌，离心，得上清液II，向上清液II中加入固体(NH₄)₂SO₄至65％的饱和度，搅拌，离心，收集沉淀物；(2)将步骤1)所述沉淀物溶于浓度为0.05mM、pH 7.1的Tris-HCl缓冲溶液，所述缓冲溶液中还含有0.01M的2-巯基乙醇，在相同的缓冲溶液中透析后，装载到DEAE-纤维素DE52层析柱上，用浓度为0.1M的KCl溶液洗脱，收集具有κ-卡拉胶水解酶活性的馏分；(3)向步骤(2)所述的馏分中加入固体(NH₄)₂SO₄至65％的饱和度，搅拌，离心，收集沉淀物，将沉淀物溶于浓度为0.05mM、pH 7.1的Tris-HCl缓冲溶液，所述缓冲溶液中还含有0.01M的2-巯基乙醇，在相同的缓冲溶液中透析，冷冻干燥，得到κ-卡拉胶水解酶。

作为优选，步骤1)将假交替单胞菌WZU4771以占含κ-卡拉胶的培养基体积3％～10％的接种量接入含κ-卡拉胶的培养基中。

作为优选，步骤1)所述培养基为含质量浓度6％～10％碳源、0.3％～0.7％氮源、0.3％κ-卡拉胶和1.5％NaCl的水溶液。所述碳源为葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖或乳糖中的一种，优选葡萄糖。所述氮源为玉米浆、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸铵、硝酸铵或硝酸钠中的一种，优选玉米浆。

上述方法制备的κ-卡拉胶水解酶，分子量为45000，能够水解κ-卡拉胶中的β-(1→3)-键，最终得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。

本发明还提供一种上述κ-卡拉胶水解酶用于制备κ-新卡拉四糖硫酸酯的方法，包括如下步骤：

1)向κ-卡拉胶水溶液中加入所述的κ-卡拉胶水解酶，混合液经搅拌，离心去除不溶物，真空蒸发，冷冻干燥，得冻干粉；

2)将步骤1)所述冻干粉溶解于乙醇水溶液中，离心去除不溶物，取上清液、蒸发去除乙醇后，用蒸馏水稀释，然后装载到聚丙烯胺凝胶Bio-Gel P-6 DG层析柱上，以浓度为0.1M的NaNO₃水溶液洗脱，收集含κ-新卡拉四糖硫酸酯的馏分，在蒸馏水中透析，真空蒸发，冷冻干燥，得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。

本发明能够达到以下技术效果：

1、假交替单胞菌WZU4771在κ-卡拉胶的诱导下合成并向胞外分泌κ-卡拉胶水解酶，葡萄糖和玉米浆分别是其最佳碳源和最佳氮源。采用间歇发酵，通过优化培养基和培养条件，可以获得50U/mL所述的κ-卡拉胶水解酶。与迄今已见报道的、间歇发酵产生33U/mL的κ-卡拉胶水解酶的假单胞菌Pseudomonas carrageenovora NCIMB 302(Dyrset N，et al.Enzyme MicrobTechnol，1997，20：418-423)比较，所述假交替单胞菌WZU4771的κ-卡拉胶水解酶生产能力大为提高，极具开发前景。

2、本发明提供的κ-卡拉胶水解酶的分子量为45000，不能水解ι-卡拉胶、λ-卡拉胶、琼脂、海藻酸、几丁质、淀粉和纤维素，能够水解κ-卡拉胶中的β-(1→3)-键，最终得到κ-新卡拉四糖硫酸酯，具有很高的商业应用价值。。

3、本发明提供的κ-卡拉胶水解酶，40℃热处理2hr能够保持90％的酶活性，而70℃热处理7.5min则完全失活。与迄今已见报道、来源于噬纤维菌(Cytophaga)、40℃热处理1hr保持90％的酶活性的κ-卡拉胶水解酶(BarbeyronT，et al.Mol Biol Evol，1998，15：528-537)比较，更具热稳定性。最适温度30℃，最适pH值7.5。在所述的最适温度和最适pH值下，酶促反应服从米氏方程，转换数为125s^-1，米氏常数为0.015mM(0.56mg/mL)。迄今已见报道的κ-卡拉胶水解酶的米氏常数为3.3mg/mL(来源于弧菌Vibrio sp.CA-1004，Araki T，etal.Fish Sci，1999，65：937-942)和6.66mg/mL[来源于假单胞菌Pseudomonaselongta(MTCC 5261)syn.Microbulbifer elongates，Khambhaty Y，et al.BiotechnolBioprocess Eng，2007，12：668-675]。米氏常数小，表明酶对底物的亲和力强。

附图说明

图1是κ-新卡拉四糖硫酸酯的洗脱曲线；

图2是假交替单胞菌WZU4771生物量和κ-卡拉胶水解酶活性的时间曲线；

图3是κ-新卡拉四糖硫酸酯的核磁共振图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

(一)假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771的筛选

假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771从浙江省温州市瓯江口洞头海域收集的红藻活体叶片上采用平板划线法分离得到，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.3407，保藏起始日期为2009年11月5日。具体的筛选步骤如下：

1.初筛：取从浙江省温州市瓯江口洞头海域收集的红藻活体叶片，用无菌海水洗净，浸没在所述的初筛培养基中，摇床培养数日。将培养液在含有所述的初筛培养基的琼脂平板上平行划线，培养数日。将在琼脂平板上形成透明圈的菌落转接到新的琼脂平板上，培养数日。重复以上步骤，直至得到纯培养物。

初筛培养基为含有以下浓度成分的水溶液(g/L)：κ-卡拉胶2、NaCl 15，NaNO₃ 2、KH₂PO₄ 1.3、MgSO₄·7H₂O 0.5、CaCl₂ 0.1和FeCl₃ 0.01，pH值7.5。

2.复筛：将纯培养物接种到所述的复筛培养基中，摇床培养。离心分离得到上清液，测定上清液的κ-卡拉胶水解酶活性。

复筛培养基为含有以下浓度成分的水溶液(g/L)：κ-卡拉胶2、酵母膏1、NaCl 15、NaNO₃ 2、KH₂PO₄ 1.3、MgSO₄·7H₂O 0.5、CaCl₂ 0.1和FeCl₃ 0.01，pH值7.5。

3.酶活性测定方法：取1.0mL上清液与2.0mL底物[以浓度为20mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)配制的、质量浓度为0.25％的κ-卡拉胶水溶液]混合，置于(37±2)℃保温2hr，然后将混合液置于沸水浴中热处理15min以终止酶反应。采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定还原糖，定义每分钟从κ-卡拉胶中水解出1μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活性单位(U)。

4.筛选指标：以上清液的κ-卡拉胶水解酶活性浓度(U/mL)为指标，筛选得到κ-卡拉胶水解酶生产率高的菌株。

5.得到的假交替单胞菌WZU4771具有如下特征：

菌株的形态学特征为：细胞分散，短杆状，长(1.0～2.5)μm、宽(0.5～0.7)μm，革兰氏阴性，不形成孢子，端生鞭毛，能够运动。菌落呈叶状边缘的不规则圆形，直径(3～7)mm，中间稍突起，粘性，不透明，黄色。

菌株的生理学特征为：化能异养，专性好氧，触酶和氧化酶阳性。生长需要NaCl，无NaCl时几乎不能生长，高浓度的NaCl抑制其生长，而浓度在(10～60)g/L时NaCl对生长基本没有影响。最适生长温度为(23～27)℃。

根据16S rRNA序列分析结果，结合其形态学和生理学特征，所述的菌株鉴定为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)，命名为WZU4771。

所述的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771在κ-卡拉胶的诱导下合成并向胞外分泌κ-卡拉胶水解酶，葡萄糖和玉米浆分别是其最佳碳源和最佳氮源。采用间歇发酵，通过优化培养基和培养条件，可以获得50U/mL所述的κ-卡拉胶水解酶。与迄今已见报道的、间歇发酵产生33U/mL、流加发酵产生84U/mL的κ-卡拉胶水解酶的假单胞菌Pseudomonas carrageenovora NCIMB302(Dyrset N，et al.Enzyme Microb Technol，1997，20：418-423)比较，所述的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771极具开发前景。

(二)κ-卡拉胶水解酶的生产

1.发酵：所述的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771的优化培养基为含有质量浓度6％～10％的碳源、0.3％～0.7％的氮源、0.3％的κ-卡拉胶和1.5％的NaCl的水溶液；优化培养条件是以占优化培养基体积3％～10％的接种量接入所述的优化培养基，采用间歇发酵以(20～35)℃、(100～400)rpm培养(24～48)hr。发酵液以(8000～15000)g离心(20～40)min，得到上清液。上清液的κ-卡拉胶水解酶活性浓度为(40～50)U/mL。

2.分离：所有步骤在(0～4)℃下操作。向上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄至56％的饱和度，搅拌6hr，以15000g离心分离20min。向上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄至65％的饱和度，搅拌6hr，以15000g离心分离20min，收集沉淀物。将沉淀物溶于浓度为0.05mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.1)中，上述缓冲溶液中还含有浓度为0.01M的2-巯基乙醇，在相同的缓冲溶液中透析6hr，装载到DEAE-纤维素DE52层析柱上，用浓度为0.1M的KCl溶液以90mL/hr的速率洗脱。收集具有κ-卡拉胶水解酶活性的馏分，加入固体(NH₄)₂SO₄至65％的饱和度，搅拌6hr，以15000g离心分离20min，收集沉淀物。将沉淀物溶于以浓度为0.05mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.1)中，上述缓冲溶液中还含有浓度为0.01M的2-巯基乙醇，在相同的缓冲溶液中透析6hr，冷冻干燥，得到所述的κ-卡拉胶水解酶。

3.κ-卡拉胶水解酶的特性：

所述的κ-卡拉胶水解酶的分子量为45000，不能水解ι-卡拉胶、λ-卡拉胶、琼脂、海藻酸、几丁质、淀粉和纤维素，能够水解κ-卡拉胶中的β-(1→3)-键，最终得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。40℃热处理2hr能够保持90％的酶活性，而70℃热处理7.5min则完全失活。与迄今已见报道、来源于噬纤维菌(Cytophaga)、40℃热处理1hr保持90％的酶活性的κ-卡拉胶水解酶(Barbeyron T，et al.MolBiol Evol，1998，15：528-537)比较，更具热稳定性。最适温度30℃，最适pH值7.5。在所述的最适温度和最适pH值下，酶促反应服从米氏方程，转换数为125s^-1，米氏常数为0.015mM(0.56mg/mL)。迄今已见报道的κ-卡拉胶水解酶的米氏常数为3.3mg/mL(来源于弧菌Vibrio sp.CA-1004，Araki T，et al.Fish Sci，1999，65：937-942)和6.66mg/mL[来源于假单胞菌Pseudomonas elongta(MTCC5261)syn.Microbulbifer elongates，Khambhaty Y，et al.Biotechnol Bioprocess Eng，2007，12：668-675]。米氏常数小，表明酶对底物的亲和力强。

(三)κ-新卡拉四糖硫酸酯的制备

配制浓度为15g/L的κ-卡拉胶水溶液，加入200U/L所述的κ-卡拉胶水解酶。混合液在所述的最适温度30℃和最适pH值7.5下，以200rpm搅拌6hr。以15000g离心分离20min，去除不溶物，真空蒸发，冷冻干燥。冻干粉溶解于体积比为5∶1的乙醇水溶液中，以15000g离心分离20min，去除不溶物。上清液真空蒸发去除乙醇后，用蒸馏水稀释，然后装载到聚丙烯胺凝胶Bio-GelP-6DG层析柱上，用浓度为0.1M的NaNO₃溶液以4mL/hr的速率洗脱，洗脱曲线见图1。收集第67-77号馏分，在蒸馏水中透析6hr，真空蒸发，冷冻干燥。

冻干粉经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和核磁共振(图谱见附图3)测定，其化学位移和不同C1信号的强度与文献报道一致(Rochas C，et al.Int JBiol Macromol，1983，5：111-115)，结构为κ-新卡拉四糖硫酸酯：4-硫酸酯-β-D-半乳吡喃糖-(1→4)-3，6-脱水-α-D-半乳吡喃糖-(1→3)-4-硫酸酯-β-D-半乳吡喃糖-(1→4)-3，6-脱水-α-D-半乳吡喃糖。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在m/z 850-910显示4个主要的峰，分别对应于4种寡糖的钠和/或钾盐(表1)。

表1基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

注：AnGalp代表3，6-脱水-α-D-半乳吡喃糖；

Galp_4SK代表硫酸酯被钾离子取代的4-硫酸

酯-β-D-半乳吡喃糖；

Galp_4SNa代表硫酸酯被钠离子取代的4-硫酸

酯-β-D-半乳吡喃糖

实施例

实施例1

取从浙江省温州市瓯江口洞头海域收集的红藻海头红(Plocamium telfairiae)活体叶片，剪成直径约为1.5cm的小圆片，用无菌海水清洗3次，浸没在装有50mL初筛培养基的500mL三角瓶中，在200rpm的摇床上于25℃培养72hr。将5mL培养液转接到装有50mL新鲜的初筛培养基的500mL三角瓶中，在相同的条件下培养。重复以上步骤，直至培养液明显浑浊。将浑浊培养液用无菌海水稀释10倍，在含有初筛培养基的琼脂平板上平行划线，置于25℃培养48hr。将在琼脂平板上形成透明圈的菌落转接到新鲜的含有初筛培养基的琼脂平板上，置于25℃培养48hr。重复以上步骤，直至得到纯培养物。

将纯培养物接种到装有50mL复筛培养基的500mL三角瓶中，在200rpm的摇床上于25℃培养24hr。将5mL培养液转接到装有50mL新鲜的复筛培养基的500mL三角瓶中，在相同的条件下培养48hr。培养液以15000g离心分离20min，按所述的酶活性测定方法测定上清液的κ-卡拉胶水解酶活性。

以上清液的κ-卡拉胶水解酶活性浓度(U/L)为指标，筛选得到κ-卡拉胶水解酶生产率高的菌株。

根据所述的菌株的16S rRNA序列分析结果，结合其形态学和生理学特征，鉴定为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)，命名为WZU4771。

上述初筛培养基为含有以下浓度成分的水溶液(g/L)：κ-卡拉胶2、NaCl 15，NaNO₃ 2、KH₂PO₄ 1.3、MgSO₄·7H₂O 0.5、CaCl₂ 0.1和FeCl₃ 0.01，pH值7.5。

上述复筛培养基为含有以下浓度成分的水溶液(g/L)：κ-卡拉胶2、酵母膏1、NaCl 15、NaNO₃ 2、KH₂PO₄ 1.3、MgSO₄·7H₂O 0.5、CaCl₂ 0.1和FeCl₃ 0.01，pH值7.5。

酶活性测定方法：取1.0mL所述的上清液与2.0mL底物[以浓度为20mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)配制、浓度为0.25％的κ-卡拉胶溶液]混合，置于(37±2)℃保温2hr，然后将所述的混合液置于沸水浴中热处理15min以终止酶反应。采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定还原糖含量，定义每分钟从κ-卡拉胶水解出1μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活性单位(U)。

实施例2

分别选取几种不同的碳源，浓度均为1％，以0.1％的酵母膏为氮源，另加0.2％的κ-卡拉胶和1.5％的NaCl，配制培养基，接种量为10％，培养温度为25℃，摇床转速为200rpm，进行假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771的κ-卡拉胶水解酶发酵。培养48hr，结果如表1所示，葡萄糖为最佳碳源。

表1碳源对κ-卡拉胶水解酶发酵的影响

实施例3

分别选取几种不同的氮源，有机氮源浓度均为0.1％，无机氮源浓度折合相当于0.5g/L的(NH₄)₂SO₄的氮含量，以1％的葡萄糖为碳源，另加0.2％的κ-卡拉胶和1.5％的NaCl，配制培养基，接种量为10％，培养温度为25℃，摇床转速为200rpm，进行假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771的κ-卡拉胶水解酶发酵。培养48hr，结果如表2所示，玉米浆为最佳氮源。

表2氮源对κ-卡拉胶水解酶发酵的影响

实施例4

培养基含有1％的葡萄糖、0.1％的玉米浆和1.5％的NaCl，另外分别添加0.2％的κ-卡拉胶、半乳糖和乳糖，接种量为10％，培养温度为25℃，摇床转速为200rpm，进行假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771的κ-卡拉胶水解酶发酵。培养48hr，结果如表3所示，κ-卡拉胶诱导假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771合成κ-卡拉胶水解酶，而半乳糖和乳糖不能诱导假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771合成κ-卡拉胶水解酶。

表3诱导物对κ-卡拉胶水解酶发酵的影响

实施例5

培养基含有1％的葡萄糖、0.1％的玉米浆和1.5％的NaCl，另加0.2％的κ-卡拉胶，接种量为10％，摇床转速为200rpm，在不同的培养温度下，进行假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771的κ-卡拉胶水解酶发酵。培养48hr，结果如表4所示，最佳温度为(25-30)℃。

表4温度对κ-卡拉胶水解酶发酵的影响

实施例6

培养基含有8％的葡萄糖、0.5％的玉米浆和1.5％的NaCl，另加0.3％的κ-卡拉胶，接种量为10％，培养温度为25℃，摇床转速为200rpm，进行假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771的κ-卡拉胶水解酶发酵。其生物量和κ-卡拉胶水解酶活性的时间曲线如图2所示，发酵液的酶活性在对数生长期快速增加，并在稳定期达到50U/mL。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。