一种微氧-厌氧连续流加甘油多罐串联发酵生产1,3-丙二醇的方法

摘要

一种微氧-厌氧连续流加甘油多罐串联发酵生产1，3-丙二醇的方法，属于生物化工技术领域。其特征在于根据微生物发酵生产1，3-丙二醇的微氧及厌氧特性，利用至少三个发酵罐串联的方式，在不同的发酵罐中采用不同的通气方式和甘油流加策略。第一个发酵罐微氧发酵促进菌体生长旺盛；第二个发酵罐厌氧流加甘油提高1，3-丙二醇的浓度和转化率；其它发酵罐厌氧发酵进一步提高1，3-丙二醇的浓度，同时消耗掉残余甘油。本发明的效果和益处是充分发挥每一步发酵的特点，提高菌体浓度、1，3-丙二醇的终浓度和生产强度；降低甘油的终浓度和生产成本；实现连续化生产，为微生物发酵法生产1，3-丙二醇提供一种经济可行的方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及一种微生物连续流加甘油发酵生产1，3-丙二醇的方法，特别涉及一种微氧-厌氧连续流加甘油多罐串联发酵生产1，3-丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇(1，3-Propanediol，简称1，3-PD)作为一种重要的化工原料广泛应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，还可用作医药和有机合成的中间体。1，3-PD还可作为聚合物单体合成高分子材料，特别是合成性能优异的新型聚酯纤维聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT被认为是一种兼具聚对苯二甲酸乙二酯(PET)的高性能和聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)的易加工性的新型聚酯材料，并且具有自然循环的可生物降解特性，是目前合成纤维新品种开发的热点，具有广阔的应用前景。因此，开发低成本的1，3-PD已经成为目前科研工作者关注的焦点。

近年来，1，3-PD的生产方法主要为化学法和微生物发酵法。与化学法相比，微生物发酵法具有操作条件温和、副产物少、操作简单安全及环境污染小等优点。能以甘油为底物生物转化1，3-PD的菌种中克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)具有较高的转化率和生产能力，因而受到更多的关注。克雷伯杆菌是一种兼性厌氧菌，目前研究结果表明，该菌在微氧和厌氧的条件下都能够生成1，3-PD。微氧条件能够促进菌体的生长和提高生产强度，厌氧条件有利于积累1，3-PD并提高转化率。在生成1，3-PD的过程中，菌体生长和催化是耦联的，因此在发酵过程中必须控制条件使菌体在较佳环境中得到生长。细胞生长还与底物浓度密切相关，底物浓度过高会对细胞生长产生抑制，浓度过低则生成较多的副产物，两种情形都不利于1，3-PD的生产，为此需要将底物甘油浓度控制在一个合理的范围内。

目前，微生物发酵生产1，3-PD的工艺主要包括间歇发酵、批式流加发酵和连续发酵。其中间歇发酵可以得到较高的产物浓度，但生产强度较低；批式流加是目前微生物发酵生产1，3-PD的主要方式，可以得到较高的产物浓度和生产强度，但是批式流加发酵与间歇发酵一样，由于需要频繁的放罐、灭菌等操作，导致非生产时间长、仪器使用寿命短、生产成本高，不利于进行大规模工业化生产；而连续发酵有利于提高生产强度，产品质量稳定，非生产时间短，并且可以实现有规律的自动化生产，容易实现产业化，但是连续发酵存在的突出问题是产物浓度低。为了提高1，3-PD的浓度，研究人员通过提高发酵培养基中甘油的浓度来实现，例如Menzel等人在初始甘油浓度为145g/L的条件下，厌氧连续发酵生产1，3-PD的浓度可达48.5g/L(Enzyme Microbiol Technol.1997，20(2)：82-86)，但是由于强烈的底物抑制作用，菌体干重仅为0.7g/L，而且发酵液中的残余甘油浓度高达48g/L，造成极大的原料浪费，并且加重了后续产物分离的难度。为了降低发酵液中残余甘油的浓度，Seraphim等人利用两个罐串联的方式进行厌氧连续发酵，可以将发酵液中残余甘油的浓度降低至8.6g/L，但是生产强度较低，仅为3.4g/L·h(J.Biotechnol.2000，77：191-208)。

为了解决连续发酵中存在的细胞密度低、产物浓度低、残留甘油浓度高等问题，本发明采用微氧-厌氧联合连续流加甘油的多罐串联发酵方式生产1，3-PD。在整个连续发酵过程中至少采用三个串联发酵罐，第一个发酵罐采用微氧发酵方式促进菌体生长旺盛，保证菌体活力；第二个发酵罐采用厌氧连续发酵方式，流加甘油将罐中残余甘油的浓度控制在合理范围内，以利于1，3-PD的生成，提高1，3-PD浓度和转化率；串联的其它发酵罐采用厌氧连续发酵，主要任务是消耗掉第二个罐中残余的甘油。

发明内容

本发明利用克雷伯氏菌、柠檬菌等兼性厌氧菌通过微氧-厌氧联合连续流加甘油的多罐串联培养模式，提高连续发酵过程中1，3-PD的浓度和生产强度，降低最终发酵液中的甘油浓度。

本发明的技术方案是在整个连续流加发酵的过程中至少采用三个串联发酵罐。第一个发酵罐采用微氧发酵方式连续培养，第二个罐中厌氧连续流加甘油，将罐中残余甘油的浓度控制在有利于1，3-丙二醇形成的范围内，串联的其它发酵罐采用厌氧连续发酵，用来消耗掉第二个罐中残余的甘油。

实现本发明的步骤如下：

1)微生物培养基的制备：培养基中必须具备微生物生长所需要的营养成分，如葡萄糖或甘油等碳源，尿素、铵盐、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸盐(磷源)和硫酸盐(硫源)等。此外还需要钠、钾、镁、钙等阳离子以及锌、铁、锰、铜、钴、硼和钼等微量元素，每种微量元素的含量大约在0.01mg/L～50mg/L的范围内。培养基在121℃下灭菌15～20min后使用。

2)种子培养：在摇瓶中进行，摇床转速为100～300r/min，温度为27～40℃，培养时间为10～15h。

3)发酵培养：在多个发酵罐中进行，发酵罐接种量为5％～20％，搅拌浆转速为100～300r/min，温度为27～40℃，pH值为6～8。在发酵过程中向发酵罐中分别通入氮气和空气，通气量为0.02～0.1vvm，发酵方式为连续发酵或连续流加发酵。具体发酵操作过程如下：

(1)第一发酵罐用10～60g/L甘油培养基进行间歇培养，通入空气维持微氧环境以保证菌体生长旺盛，待发酵液中的菌体达到一定密度(OD₆₅₀为2～5)时，再以0.1～0.3h^-1的稀释速率流加发酵培养基(甘油浓度为20～110g/L)进行连续培养，在培养过程中调整稀释速率和发酵培养基甘油浓度，以防止底物浓度过高或过低而抑制或限制菌体生长。

(2)将第一发酵罐中的发酵液泵入第二发酵罐，通入氮气维持厌氧环境以提高1，3-PD的浓度和转化率；以一定速率流加甘油，保持该第二发酵罐中残余甘油浓度为15～30g/L，以促进1，3-PD的积累。

(3)将第二发酵罐中的发酵液泵入第三个发酵罐，通入氮气维持厌氧环境以利于生成1，3-PD，并且进一步消耗残余的甘油。可以通过调整第三个发酵罐的稀释速率或继续增加新的发酵罐的方式将残余甘油消耗至理想的水平，如小于1g/L。

通过这种多罐串联连续流加发酵工艺，最终1，3-PD的浓度可以达到37～46g/L，生产强度为4～8g/L·h，终产物残余甘油的浓度仅为1～13g/L。

本发明的效果和益处在于利用兼性厌氧菌生长和产物积累的特点，充分发挥微氧条件对细胞生长有利和厌氧条件下适度的甘油浓度对产物形成有利的规律，解决连续发酵中存在的细胞生长与产物积累的矛盾，在提高菌体密度的同时提高1，3-PD的终浓度和生长强度，降低残余甘油的浓度，节省产物与甘油分离的费用，降低生产成本，实现连续化生产。

附图说明

附图是本发明微氧-厌氧连续流加甘油多罐串联发酵生产1，3-丙二醇的工艺流程示意图。

F₁、F₂、F₃分别是三个串联的发酵罐，其中F₁是微氧连续发酵的第一发酵罐，F₂是厌氧连续发酵的第二发酵罐，F3是厌氧连续发酵的第三发酵罐。

具体实施方式

以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。

1)菌种：克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)CGMCC 2028，是一种兼性厌氧菌。

2)培养基：

A.种子培养基(1L)：

甘油：20g，KH₂PO₄：1.3g，K₂HPO₄·3H₂O：4.56g，(NH₄)₂SO₄：2.0g，MgSO₄·7H₂O：0.2g，酵母粉：1g，CaCO₃：2g。微量元素A：2mL，Fe²⁺溶液：1mL，Ca²⁺溶液：1mL。

微量元素A(1L)：ZnCl₂：70mg，MnCl₂·4H₂O：100mg，H₃BO₃：60mg，CoCl₂·6H₂O：200mg，CuCl₂·6H₂O：20mg，NiCl₂·6H₂O：25mg，Na₂MoO₄·2H₂O：5mg，HCl(12M)：0.9mL。

Fe²⁺溶液(1L)：FeSO₄·7H₂O：5g，HCl(12M)：4mL

Ca²⁺溶液(1L)：CaCl₂：20g。

B.发酵培养基(1L)：甘油：40g，KH₂PO₄：1.36g，(NH₄)₂SO₄：6.61g，MgCl₂·6H₂O：0.26g，CaCl₂：0.29g，柠檬酸：0.42g，酵母粉：2g。微量元素B：5mL。

微量元素B(1L)：ZnCl₂：0.68g，MnCl₂·4H₂O：0.17g，H₃BO₃：0.06g，CuCl₂·2H₂O：0.47g，Na₂MoO₄·2H₂O：0.005g，FeCl₂·4H₂O：3.97g，CoCl₂·6H₂O：0.47g，HCl(12M)：10mL。

3)种子培养：在250mL的三角瓶中进行，装液量为100mL，接种量为1％，于37℃、150r/m摇床培养12h。

实例1

在全自动发酵罐中进行连续发酵，工作体积为5L，实际装液量为1.5L，接种量为10％，转速控制为150r/m，空气或氮气的通气量为0.04vvm，用5mol/LNaOH溶液调节pH值为7.0，温度控制在37℃。发酵罐1、2和3中的初始甘油浓度分别为40、20和20g/L。

发酵罐1：通入空气维持微氧环境，先进行间歇培养，待菌体OD₆₅₀达到3.0时，再以0.2h^-1的稀释速率流加发酵培养基进行恒化培养，培养基中的甘油浓度为40g/L，达到稳态时菌体OD₆₅₀值为5.1，残余甘油浓度为0.9g/L，1，3-PD的浓度和摩尔转化率分别为15.2g/L和0.47mol/mol。

发酵罐2：将罐1中的发酵液泵入发酵罐2中，通入氮气维持厌氧环境，匀速流加95％甘油使残余甘油维持在30.9g/L。达到稳态时，罐2中1，3-PD的浓度和摩尔转化率均有所提高，分别为32.2g/L和0.54mol/mol。

发酵罐3：将罐2中的发酵液泵入发酵罐3中，通入氮气维持厌氧环境，消耗残余的甘油浓度。最终1，3-PD的浓度可以达到37.3g/L，生产强度为7.5g/L·h，残余甘油的浓度仅为3.7g/L。

实例2

发酵过程同实例1，进入发酵罐1的培养基中甘油浓度为70g/L，稀释速率0.1h^-1，发酵罐2中控制残余甘油浓度为18.9g/L。

实验结果，最终1，3-PD的浓度可以达到39.5g/L，生产强度为4.0g/L·h，残余甘油的浓度仅为1.4g/L。

实例3

发酵过程同实例1，发酵罐1的培养基中甘油浓度为90g/L，稀释速率0.1h^-1，发酵罐2中控制残余甘油浓度为18.4g/L。

实验结果，最终1，3-PD的浓度可以达到41.1g/L，生产强度为4.1g/L·h，残余甘油的浓度为10.1g/L。

实例4

发酵过程同实例1，发酵罐1的培养基中甘油浓度为110g/L，稀释速率0.1h^-1，发酵罐2中控制残余甘油浓度为21.2g/L。

实验结果，最终1，3-PD的浓度可以达到45.7g/L，生产强度为4.6g/L·h，残余甘油的浓度为13.3g/L。