诱导马尾松未成熟种子胚性胚柄细胞团再生植株的方法

摘要

一种诱导马尾松未成熟种子ESM再生植株的方法，利用马尾松未成熟种子ESM所具有的持续裂生能力特征，通过固体和液体培养的交替培养，经过维持、增殖、体胚成熟前期、成熟培养四个阶段，使ESM形成发育完整、结构正常的体胚，经萌发培养获得马尾松植株。采用本发明所提供的方法，可以获得大量遗传基础一致的马尾松体胚的再生植株，为马尾松珍稀遗传资源的保存、优良基因型苗木的大量生产，提供了一种周期短、发生效率高的新技术。

说明书

一、技术领域

本发明属林业中的种苗繁殖生物技术领域，具体涉及一种诱导马尾松优树未成熟种子胚性胚柄细胞团(Embryonal Suspensor Mass，简称ESM)再生植株的方法。

二、背景技术

马尾松(Pinus massoniana)是我国南方的主要用材树种之一，分布范围广、蓄积量大。由于它的适应性强、生长快、用途广泛、造林更新容易、成本低，在绿化荒山、改善生态环境方面起了很大的作用。与商品材杉木和北方红松相比，马尾松在弯曲强度、弯曲弹性模量、顺纹压力、端面硬度4个指标上都超过杉木、红松；而且其木材纤维素含量较高，木材广泛用于建筑、板材、家具、胶合板、造纸和木纤维工业。马尾松木材很耐水湿，素有“水浸千年松”之说，适于水底地下工程，大量用于矿柱和桩木；松脂的主要成份是松香和松节油，是重要的天然化工原料，马尾松还是我国主要的产脂树种，产脂期长，产量高，单株立木胸径18cm以上，每年可割脂5～6kg；马尾松木材含纤维素62％，脱脂后是造纸和人造纤维工业的重要原料；利用松根、弯曲木可培养名贵的中药材茯苓，等等。因此，加强对马尾松现有林分的保护，研究、保护马尾松的遗传资源和发展马尾松人工林资源具有的重要意义。

在马尾松森林资源的培育中，采用遗传改良材料种植是营林成功的关键措施之一。马尾松良种繁育目前主要采用种子园育种、优树无性系扦插繁殖等传统方法，繁殖速度较慢，难以满足生产应用的需求。

被子植物体胚的发生和植株再生的思想，源于1902年Haberlandt提出的植物细胞具有全能性的概念，即植物体的每一个细胞都具有发育成为一个新个体的潜在能力。在人工培养条件下，植物体细胞可以诱导分化形成如有性生殖合子胚那样的胚状结构(胚状体)，进而通过覆被人工胚乳形成人工种子或直接再生形成完整的植株。由于植物每一个体细胞从理论上都存在诱导成胚的可能性，且繁殖速度快、不受地区、季节和灾害性气候等自然条件的限制；对于木本植物来说，不必等待漫长的有性世代，也不必像常规的无性繁殖那样需要充足的萌芽插条，一旦获得优良的材料，就可以比常规繁殖快数十倍甚至上百倍的速度繁殖优良种苗。

作为裸子植物的马尾松，体胚的发生与被子植物的体细胞胚发生有着完全不同的途径和机理，成熟的种子以及由种子发育而来的植株，营养细胞转变为胚性细胞十分困难。但在针叶树种中，雌配子体受精后发育成种子的过程中有一部分珠心细胞处于未分化的阶段，在适当的培养条件下，可以利用裂生多胚特性，诱导体胚形成。Gupta等(1985，1995)报道过利用这一生物学特性，诱导出花旗松(Pseudotsuga menziesii)和湿地松(Pinus elliottii)的体胚，其大致可以分为四个步骤：ESM的诱导、保持和增殖、体胚的成熟、萌发和植株再生，并证明该技术体系具有达到产业化的前景。

目前虽有马尾松成熟种子诱导体胚发生的报道，但诱导率极低，难以在生产上应用。中南林业科技大学曾报道马尾松不同成熟度的幼胚离体培养，诱导愈伤组织和体胚发生，但尚未获得具体的结果。国内外尚无利用马尾松优树未成熟种子的ESM诱导体胚发生，并实现植株再生的成功方法报道。

三、发明内容

本发明的目的是针对当前马尾松组织培养器官发生困难、植株再生率低，以及用马尾松的成熟合子胚诱导体胚成功率极低，难以满足生产应用需要等问题，研究利用马尾松优树的ESM诱导体细胞胚的发生和植株再生的新途径，快速生产大批高质量的苗木，满足林业生产对优质马尾松种苗的需求。

本发明以马尾松优树未成熟种子的ESM为起始材料，在经过反复筛选的基础上获得培养基上进行多步离体培养，长期维持未成熟种子ESM的裂生多胚发生能力，经过胚性愈伤诱导、维持、增殖、体胚成熟前期和成熟等阶段培养，获得体胚，再经萌发培养实现植株的再生。

本发明的技术解决方案为：

一种诱导马尾松优树的未成熟种子ESM再生植株的方法，其特征是在每年的6月中旬采集马尾松优树球果，置于4℃冷藏保存预处理一周以上后，在无菌条件下剥取球果中的未成熟胚，按以下培养条件和先后时间顺序培养：

a.ESM的起始诱导

此阶段基本培养基采用DCR培养基。在无菌条件下将未成熟种子胚接种至下述诱导培养基中，在23℃、暗培养40天，诱导获得大量ESM，培养基配方如下。

KNO₃                      340mg/L

Ca(NO₃)₂·4H₂O            56mg/L

NH₄NO₃                    400mg/L

KH₂PO₄                    170mg/L

CaCl₂·2H₂O               85mg/L

MgSO₄·7H₂O               370mg/L

Na₂-EDTA·H₂O             37.3mg/L

FeSO₄·7H₂O               27.8mg/L

H₃BO₃                     6.2mg/L

MnSO₄·H₂O                22.3mg/L

ZnSO₄·7H₂O               8.6mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O             0.25mg/L

CuSO₄·5H₂O               0.25mg/L

KI                        0.83mg/L

CoCl₂                     0.025mg/L

NiCl₂                     0.025mg/L

MyO-Inositol              200mg/L

Glycine                   2.0mg/L

Thiamine·HCI             1.0mg/L

Nictinic·acid              0.5mg/L

Pyridoxine·HCI             0.5mg/L

2，4-D                      2mg/L

6-BA                        1mg/L

谷氨酰胺                    1g/L

水解酪蛋白                  0.5g/L

肌醇                        1g/L

糖                          30g/L

琼脂                        1.9g/L

b.EMS的维持与增殖

此阶段基本培养基采用DCR培养基。将a.中所诱导培养所得的EMS在无菌条件下转入以下配方培养基中，23℃暗培养条件下，维持培养20天：

KNO₃                        340mg/L

Ca(NO₃)₂·4H₂O              556mg/L

NH₄NO₃                      400mg/L

KH₂PO₄                      170mg/L

CaCl₂·2H₂O                 85mg/L

MgSO₄·7H₂O                 370mg/L

Na₂-EDTA·H₂O               37.3mg/L

FeSO₄·7H₂O                 27.8mg/L

H₃BO₃                       6.2mg/L

MnSO₄·H₂O                  22.3mg/L

ZnSO₄·7H₂O                 8.6mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O               0.25mg/L

CuSO₄·5H₂O                 0.25mg/L

KI                          0.83mg/L

CoCl₂                       0.025mg/L

NiCl₂                       0.025mg/L

MyO-Inositol                200mg/L

Glycine                     2.0mg/L

Thiamine·HCI               1.0mg/L

Nictinic·acid              0.5mg/L

Pyridoxine·HCI             0.5mg/L

2，4-D                      0.6mg/L

6-BA                        0.2mg/L

谷氨酰胺                    1g/L

水解酪蛋白                  0.5g/L

肌醇                        1g/L

糖                          30g/L

琼脂                        7.0g/L

将维持培养20天后的EMS移入以下液体培养基中，23℃暗培养，摇床转速为80～100r.p.m的条件下增殖培养7天：

KNO₃                        340mg/L

Ca(NO₃)₂·4H₂O              556mg/L

NH₄NO₃                      400mg/L

KH₂PO₄                      170mg/L

CaCl₂·2H₂O                 85mg/L

MgSO₄·7H₂0                 370mg/L

Na₂-EDTA·H₂0               37.3mg/L

FeSO₄·7H₂O                 27.8mg/L

H₃BO₃                       6.2mg/L

MnSO₄·H₂0                  22.3mg/L

ZnSO₄·7H₂0                 8.6mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O               0.25mg/L

CuSO₄·5H₂O                 0.25mg/L

KI                          0.83mg/L

CoCl₂                       0.025mg/L

NiCl₂                       0.025mg/L

MyO-Inositol                200mg/L

Glycine                     2.0mg/L

Thiamine·HCI               1.0mg/L

Nictinic·acid              0.5mg/L

Pyridoxine·HCI             0.5mg/L

2，4-D                      0.6mg/L

6-BA                        0.2mg/L

谷氨酰胺                    1g/L

水解酪蛋白                  0.5g/L

肌醇                        1g/L

糖                          30g/L

c.体胚的成熟前期培养

此阶段基本培养基采用DCR培养基。将b.中所增殖培养完成后的EMS转移到以下配方液体培养基中，23℃、暗培养，摇床转速为80～100r.p.m的条件下，成熟前期培养7天：

KNO₃                        909.9mg/L

Ca(NO₃)₂·4H₂0              236.2mg/L

NH₄NO₃                      603.8mg/L

KH₂PO₄                      136.1mg/L

Mg(NO₃)₂·6H₂0              256.6mg/L

MgSO₄·7H₂0                 246.5mg/L

MgCl₂·6H₂0                 50.0mg/L

Na₂-EDTA·H₂0               9.33mg/L

FeSO₄·7H₂O                 6.95mg/L

H₃BO₃                       15.5mg/L

MnSO₄·H₂0                  10.5mg/L

ZnSO₄·7H₂0                 14.4mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O               0.125mg/L

CuSO₄·5H₂O                 0.125mg/L

KI                          4.15mg/L

CoCl₂                       0.125mg/L

MyO-Inositol                1000mg/L

Glycine                     2.0mg/L

Thiamine·HCI               1.0mg/L

Nictinic·acid              0.5mg/L

Pyridoxine·HCI             0.5mg/L

ABA                         5mg/L

d.体胚的成熟培养

此阶段基本培养基采用改良P6培养基。将c.中经成熟前期培养的材料转移到以下培养基中，在23℃的温度下暗培养40天：

KNO₃                        909.9mg/L

Ca(NO₃)₂·4H₂O              236.2mg/L

NH₄NO₃                      603.8mg/L

KH₂PO₄                      136.1mg/L

Mg(NO₃)₂·6H₂O              256.6mg/L

MgSO₄·7H₂O                 246.5mg/L

MgCl₂·6H₂O                 50.0mg/L

Na₂-EDTA·H₂O               9.33mg/L

FeSO₄·7H₂O                 6.95mg/L

H₃BO₃                       15.5mg/L

MnSO₄·H₂O                  10.5mg/L

ZnSO₄·7H₂O                 14.4mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O               0.125mg/L    

CuSO₄·5H₂O                 0.125mg/L

KI                          4.15mg/L

CoCl₂                       0.125mg/L

MyO-Inositol                1000mg/L

Glycine                     2.0mg/L

Thiamine·HCI               1.0mg/L

Nictinic·acid              0.5mg/L

Pyridoxine·HCI             0.5mg/L

ABA                         2mg/L

GA3                         1mg/L

活性炭                      1g/L

PEG8000                     130g/L

糖                          25g/L

谷氨酰胺                    1g/L

琼脂                        7g/L

经过上述培养阶段，体胚完成形态成熟和生理成熟，具备胚根、胚轴和子叶，形成结构完整的体胚。当具子叶的体胚生长发育到约2mm左右长度时，采用改良P6基本培养基进行培养萌发，即可实现植株的再生和培育成苗。

四、附图说明

图1为诱导初始阶段的胚性胚柄细胞团显微照片；

图2为诱导初始阶段的非胚性胚柄细胞团显微照片；

图3为维持和增殖培养初始阶段的ESM显微照片；

图4为维持和增殖培养早期的ESM显微照片；

图5为维持和增殖培养后期的ESM显微照片；

图6为成熟前期培养的早期体性胚显微照片；

图7为成熟过程中的体胚；

图8为发育至子叶期的体胚；

图9子叶胚萌发

五、具体实施方式

供试材料为马尾松优树的未成熟胚，分别采自广西南宁和福建南平两地的马尾松无性系嫁接种子园，重复3个年度。球果采集时间为每年的5月底至9月底，每10天采集一次。各个采种时间点相对应的种子发育阶段分别为幼胚至成熟胚发育阶段进程。球果采集后，现场置预冻好的冰盒中，湿润纱布包裹防止失水；随后速运回实验室置于4℃冰箱冷藏保存备用。4℃冰箱预处理至少一周，有利于ESM的高效诱导。接种前，将备用球果从冰箱取出，用含洗涤剂的洗液浸泡清洗，然后流水冲洗2小时。在无菌环境中用解剖刀将球果中带种翅、发育良好的未成熟种子取出，去除种翅。用解剖刀和镊子剥去种皮，置75％酒精中速泡30秒，无菌水冲洗3遍，再用稀释10倍的84消毒液消毒5分钟，无菌水冲洗3遍，置于无菌滤纸上吸干，随后接种于诱导培养基。

a.胚性胚柄细胞团诱导培养

本发明的诱导培养基以DCR为基本培养基，附加2，4-D 2mg/L，6-BA 1mg/L，谷氨酰胺1g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇1g/L，糖30g/L，琼脂7g/L。其中，附加较高浓度的2，4-D目的在于提高胚性胚柄细胞团的诱导率。

未成熟胚接种至上述诱导培养基中，20天左右可见经诱导的ESM呈半透明状粘稠的物质从胚珠孔增殖而出后在培养基上扩展(附图1)。只有这种呈现半透明，粘稠的丝状ESM，才能在适合的培养基下不断增殖。少数呈淡黄色致密质地且表面偏硬的ESM团，在随后的继代培养过程中均无法正常增殖(附图2)。

在ESM的诱导中，诱导频率与未成熟种子胚的采集时间有较大的关联。实验表明，用在6月10日～6月20日之间所采集的马尾松未成熟种子胚为起始材料，才能顺利诱导ESM增殖。

从显微镜下可以观察到ESM是由一系列胚头和胚柄结构物质组成。胚头部分比较小，具有细胞质，连接着长的高度液泡化的透明或者半透明胚柄。整个胚由半透明的松散胚柄束和轮廓不规则的胚性顶端构成。一系列胚性胚柄细胞就构成了胚性胚柄细胞团(附图3)。

在诱导培养基上诱导增殖的ESM培养物在达到大约4mm直径时，转移到增殖培养基上。诱导出ESM的未成熟种子胚转移到新鲜的诱导培养基上，可以继续诱导增殖更多的ESM。诱导ESM增殖的时间周期约为四十天，23℃、暗培养。

在诱导培养基上诱导EMS的培养时间十分关键。如果诱导培养时间过久，诱导出的EMS因为培养基中的能源耗尽而萎缩，半透明状粘稠的EMS转变为质地较硬的团状不透明的黄色或者淡黄色培养物，进而失去生长活力。

DCR(Gupta and Durzan medium)基本培养基的构成和标准配方如下：

                大量元素

KNO₃                        340mg/L

Ca(NO₃)₂·4H₂O              556mg/L

NH₄NO₃                      400mg/L

KH₂PO₄                      170mg/L

CaCl₂·2H₂O                 85mg/L

MgSO₄·7H₂O                 370mg/L

               铁盐

Na₂-EDTA·H₂O               37.3mg/L

FeSO₄·7H₂O                 27.8mg/L

               微量元素

H₃BO₃                       6.2mg/L

MnSO₄·H₂O                  22.3mg/L

ZnSO₄·7H₂O                 8.6mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O               0.25mg/L

CuSO₄·5H₂O                 0.25mg/L

KI                          0.83mg/L

CoCl₂                       0.025mg/L

NiCl₂                       0.025mg/L

               有机物质

MyO-Inositol                200mg/L

Glycine                     2.0mg/L

Thiamine·HCI               1.0mg/L

Nictinic·acid              0.5mg/L

Pyridoxine·HCI             0.5mg/L

b.EMS的维持与增殖培养

EMS的保持和增殖培养基，组成成分与诱导EMS的基本培养基相同，但将激素浓度降低。

马尾松ESM维持与增殖培养以DCR为基本培养基，附加2，4-D 0.6mg/L，6-BA 0.2mg/L，谷氨酰胺1g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇1g/L，糖30g/L，琼脂7g/L的固体培养基，维持培养20天，23℃、暗培养；

然后使用DCR为基本培养基组成成分的液体培养基，进行ESM的增殖。培养基的配方和固体增殖培养基的配方相同，仅除去凝固剂琼脂。培养细胞的初始密度为1.20％(V/V)，摇床转速为80～100r.p.m，23℃、暗培养，增殖培养的时间控制为7天左右。

维持与增殖阶段，固体培养主要目的是维持愈伤的胚性和扩大培养物基数；液体培养的目的是提高ESM的增殖速度。在液体培养阶段，要严格将摇床转速和增殖培养时间控制在规定范围之内。

在液体培养条件下，经过更换培养液2到3次的继代培养，胚头大多呈球形，结构致密，发育完整，细胞质更浓密，胚柄呈现有规律的排列(附图5)。

c.体胚的成熟前期培养

体胚的成熟前期培养的关键技术环节，是终止ESM的继续裂生和调节胚性培养材料发育的同步化。经过增殖培养以后，ESM的发育处于不同步状态。大部分裂生多胚发育较快，进入子叶胚前期阶段，而仍有一部分ESM尚且停留在原胚阶段。体胚发育的同步性，是后期培养过程中诱导体胚正常发育的关键。

体胚的同步化培养过程中，以P6改良液体培养基为基本培养基，去除所有附加的激素，添加ABA(脱落酸)5mg/L，终止ESM继续裂生，转向体胚的成熟发育进程。摇床转速仍然控制在100r.p.m左右，，23℃、暗培养7天左右。

ABA在促进针叶树体胚的同步化调控中具有关键作用，可明显促进体胚的成熟，抑制早熟体胚的发育进程，降低不正常胚的发生频率。ABA同时也有利于促进体胚中储藏物质的积累。经过ABA处理后，通过显微观察，可以发现胚头胚柄都得到了很好的发育(附图6)，胚头由于储藏物质的积累而更加致密光滑，胚柄更长，并且同步化有了很好的改进。

改良P6培养基的构成和配方如下：

             大量元素

KNO₃                        909.9mg/L

Ca(NO₃)₂·4H₂O              236.2mg/L

NH₄NO₃                      603.8mg/L

KH₂PO₄                      136.1mg/L

Mg(NO₃)₂·6H₂O              256.6mg/L

MgSO₄·7H₂O                 246.5mg/L

MgCl₂·6H₂O                 50.0mg/L

             铁盐

Na₂-EDTA·H₂O               9.33mg/L

FeSO₄·7H₂O                 6.95mg/L

             微量元素

H₃BO₃                       15.5mg/L

MnSO₄·H₂O                  10.5mg/L

ZnSO₄·7H₂O                 14.4mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O               0.125mg/L

CuSO₄·5H₂O                 0.125mg/L

KI                          4.15mg/L

CoCl₂                       0.125mg/L

             有机物质

MyO-Inositol                1000mg/L

Glycine                     2.0mg/L

Thiamine·HCI               1.0mg/L

Nictinic·acid              0.5mg/L

Pyridoxine·HCI             0.5mg/L

d.体胚的成熟培养

体胚的成熟过程与诸多因素有关：

首先，与其早期体胚的发育状况有关。早期体胚的生长状态可以通过显微观察判断。胚头细胞结构致密，体积变大，同时胚柄细胞变的修长紧密，与合子胚发育过程中的子叶胚前期类似(附图5)，这种状态的体胚，在后期培养中发育为正常体胚的成功率比较高。也有少数体胚在预成熟完成后，胚头没有变大变光滑，胚柄变短变畸形甚至于消失，这种状态在后期培养中无法发育形成体胚，或者只能形成畸形的体胚，停留在柱状胚不再继续发育生长。

其次，体胚的成熟过程还与培养基和培养微环境有关。

本实施例中体胚的成熟培养，采用P6改良基本培养基，附加2mg/L ABA和3mg/L赤霉素GA3，活性炭1g/L，琼脂7g/L。为了调节渗透压，添加PEG(聚乙二醇)8000 130g/L，另外加入试剂级纯度的糖25g/L，谷氨酰胺1g/L。

在这个阶段，渗透压的调节作用非常明显。蔗糖，盐，聚乙二醇(PEG)，甘露醇等都可以作为调节渗透压的物质。但是他们调节渗透压的机制不同。细胞对糖、盐类、甘露醇等物质具有主动运输能力。糖、盐类、甘露醇等透过细胞膜和细胞壁进入细胞内，来改变细胞的渗透压。PEG作为一种高分子渗压剂，它本身不能渗入活细胞，而是通过水分胁迫的方式调节细胞的渗透压，降低体胚内的水分。PEG与糖具有协同作用，两者可以通过调整细胞膜的渗透性和物理状态共同影响体胚的发育。相比较而言，PEG与糖组合使用，更有利于体胚的发育。

培养基中加入一定浓度的活性炭，对体细胞胚的分化和发育有一定的促进作用。单独使用ABA并不能抑制早熟子叶胚的发育，只有在含有ABA的培养基中加入活性炭，才能抑制早熟子叶胚的继续发育，改善子叶胚顶端分生组织的发育，使其形态和生理的发育上更加接近合子胚。

体胚的成熟培养时间控制为40天(23℃、暗培养)。

经过一个多月的培养，体胚完成形态成熟和生理成熟，形成具备胚根、胚轴和子叶的完整胚结构。在合适的培养条件下，此阶段的胚具有萌发能力并最终产生完整植株的形态发生能力。

子叶胚生长到大概2mm左右长度时，采用常规的方法培养萌发，实现植株的再生和培育成苗。

有益效果：

本发明的优势在于繁殖系数高、繁殖不受季节的限制，为马尾松遗传改良材料的快速繁殖提供了一种高效途径，不仅有利于马尾松遗传资源的保存，而且对于加速马尾松优良材料的发育，提供大量的经遗传改良的种植材料，缓解社会对马尾松遗传改良苗木的紧迫需求，提供了一种周期短，效率高，成本低的苗木生产技术。