大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的抗病性基因工程应用

摘要

本发明公开了大TLP蛋白编码基因GmTLP1的抗病性基因工程应用，属于生物技术领域。GmTLP1是定位于细胞膜上的类甜味蛋白，mRNA表达分析表明该基因为组成性表达，只是荚中表达量相对低一些，并且GmTLP1的表达受大豆花叶病毒(SMV)胁迫的诱导。将构建的植物过量表达载体35S-GmTLP1-pMDC83转化烟草获得过量表达GmTLP1的转基因烟草，并且得到mRNA高水平表达，过表达转GmTLP1基因植株出现病斑比野生型未转基因烟草早14h，叶片枯斑损失面积达到叶片面积一半时相对对照早20h以上，表明该基因可作为目的基因反义导入植物，提高转基因植物的综合抗病性。

说明书

技术领域

本发明涉及大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的抗病性基因工程应用，属于基因工程领域，具体地讲涉及植物病毒胁迫应答的第5类病程相关蛋白。

背景技术

类甜蛋白最早是从非洲甜菊当中分离出来，后来在烟草、土豆、大麦、水稻上相继发现，研究表明它在离体条件下具有很强的抑菌抗菌活性(Ren et al.，2000)，将该蛋白导入植物体内可明显提高植物的抗病性，而且这类蛋白还对渗透胁迫产生反应(Ren etal.，2005)。许多类甜味蛋白基因已经被分离，并转化到了土豆，水稻，小麦和其它作物中。土豆中，转基因株系提高了对土豆晚疫病的抗性，表现为：转基因株系发病时间晚1-2d，病斑从接种点蔓延较慢，多数叶片上接种点病斑不扩散，叶片仍为绿色，嫩叶表现尤为突出(金红等，2001)。水稻中，转基因株系提高了对水稻纹枯病的抗性，表现为：接种Rhizoctonia solani Kühn两周后，T1和T2代转基因植株的受害面积均明显小于非转基因植株(Datta et al.，1999)。小麦中，转基因株系提高了对小麦白粉病的抗性，表现为：T1和T2代转基因植株推迟了病斑的发展，并且减轻了白粉病症状(XING et al.，2008)。其它作物如西红柿(Radhajeyalakshmi et al.，2005)、杂草(Fu et al.，2005)也有类似的报道。

本研究从大豆品种科丰1号中利用SMV诱导的双向电泳技术分离克隆了类甜味蛋白编码基因GmTLP1，并研究了其与SMV胁迫的关系，提出了利用GmTLP1基因进行植物提高综合抗病性的基因工程改良方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于公开一个大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的抗病性基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，提高植物的综合抗病性，以进行植物品种改良。

技术方案

大豆TLP基因GmTLP1，其序列为：SEQ ID NO.2。其基因工程应用，包括：

1)大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的克隆

通过研究SMV诱导后的蛋白质差异表达图谱，分析鉴定出一个甜味蛋白，在大豆序列数据库中进行搜索，得到大豆TLP基因的全长序列，设计两端引物，引物序列见SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

以大豆(Glycine max)叶片的总RNA为模板，经反转录合成cDNA后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃复性50秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，72℃保温10分钟，随后12℃恒温，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的1021bp大小的大豆TLP基因的cDNA序列，见SEQ ID NO.1，其中编码区序列见SEQ ID NO.2，命名为GmTLP1，由669bp组成；

2)植物表达载体的构建

将GmTLP1基因与试剂盒中的pdonr vector载体进行BP反应，并进行菌液PCR测序验证，PCR引物见SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，PCR程序同步骤1)，获得入门克隆(entry clone)；将得到的入门克隆与目的表达载体(destination vector)pMDC83进行重组反应，得到35S-GmTLP1-pMDC83植物过量表达载体，然后采用冻融法将35S-GmTLP1-pMDC83转入根癌农杆菌菌株EHA105中。

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的表达载体，通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR，引物和具体的PCR过程与步骤1)相同，实时荧光定量PCR引物序列见SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，Southern blot分析引物序列见SEQID NO.10和SEQ ID NO.11验证后进行植物的抗病性评价：

在直径为15cm的培养皿中，先用含终浓度为50μg/ml筛选抗生素Hgy的1/2MS生根培养基培养，待野生型未转基因烟草(C)及T₁代转基因株系萌发生长成小苗后(约两周)，将它们移栽至带有营养土的花盆中，用保鲜膜封口保湿，待小苗长到顶住保鲜膜后揭开保鲜膜，让其自由生长。待长到具有四出复叶时，在第二出复叶上接种烟草花叶病毒，每株接半片叶子，为避免磨擦接种时力度不一致造成的误差，接种时轻轻涂抹均匀即可。转基因植株出现病斑比野生型未转基因烟草C早14h，叶片枯斑损失面积达到叶片面积一半时相对C早20h以上。

有益效果

GmTLP1基因功能是参与植物的病毒胁迫应答反应，实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative RT-PCR)分析表明：GmTLP1基因在大豆花叶病毒(SMV)胁迫诱导条件下表达增强，进一步的过表达转GmTLP1基因烟草与野生型未转基因烟草(C)相比，过表达转GmTLP1基因植株出现病斑比C早14h，叶片枯斑损失面积达到叶片面积一半时相对C早20h以上，表明GmTLP1基因在植物细胞膜表达后，通过提高病毒复制速度使受病毒侵染的植物细胞快速凋亡，从而抑制病毒在植物体内进一步扩展，提高植物对病毒的抗性。本发明的GmTLP1可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良，所编码的蛋白质具有抗病功能。

使用GmTLP1构建植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如在植物中加入选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)。从转基因植物的安全性角度考虑，可不加任何选择性标记基因，而通过逆境筛选转化植株。

携带有本发明GmTLP1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、DNA直接转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是高粱、水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是花生、大豆、油菜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1GmTLP1在大豆不同组织和病毒胁迫诱导下的表达分析

A.1.根，2.茎，3.幼叶，4.荚；B大豆花叶病毒(SMV)胁迫处理0、2、4、8、12、24、48h时在mRNA水平的实时荧光定量PCR表达分析

图2T₀代转基因植株的qPCR鉴定

以转基因烟草植株L-8，L-17，L-18，L-33，L-49-1，L-49-2，L-1和野生型未转基因烟草植株C的cDNA作为模板，以烟草的actin作为内标，进行实时荧光定量PCR分析。

图3转GmTLP1阳性株系L-17，L-18，L-19，L-49和野生型未转基因烟草C接种TMV后0h的症状

图4过表达转GmTLP1阳性株系L-17，L-18，L-49和野生型未转基因烟草C接种TMV后50h的症状

图5过表达转GmTLP1阳性株系L-17，L-18，L-19，L-49和野生型未转基因烟草C接种TMV后54h的症状

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

1)大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的克隆

以大豆品种科丰1号为材料，已报道的大豆TLP蛋白序列(P21，登陆号gi|129320)为种子序列，采用生物信息学的方法，搜索大豆的cDNA数据库，找到一条高度同源的cDNA片段。设计引物，引物序列见SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

取大豆的嫩叶，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照美国Promega公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃复性50秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，随后72℃保温10分钟，最后12℃恒温。随后进行PCR产物割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序。测序后获得具有完整编码区的1021bp大小的大豆TLP基因的cDNA序列，见SEQ ID NO.1，其中编码区序列见SEQ ID NO.2，命名为GmTLP1，由669bp组成；

2)GmTLP1在大豆不同组织和病毒胁迫诱导下的表达分析

自然短日照后取根、茎、嫩叶和荚，液氮速冻后于-80℃保存。将培养的大豆品种科丰1号，进行大豆花叶病毒胁迫处理，取样时间分别为处理后0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h，液氮速冻后于-80℃保存。

总RNA的提取同步骤1)。以大豆组成型表达的Actin基因(GenBank accessionNo.V00450)为内部参照，以来自栽培大豆品种科丰1号不同组织的总RNA为模板，进行定量反转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)，引物和具体的PCR过程与步骤1)相同。RT-PCR分析表明GmTLP1在根、茎、叶和荚中都表达，只是在荚中表达量相对较弱。采用qPCR(实时荧光定量PCR)引物序列见SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7分析了GmTLP1在SMV胁迫条件下的表达情况，在4h、8h、24h、48h时，GmTLP1基因在转录水平上的表达量明显上升，说明GmTLP1基因对SMV的胁迫有应答，应答的模式为双峰模式。

3)GmTLP1的亚细胞定位研究

设计包含GmTLP1基因完整ORF的引物(不包含终止密码子)，引物序列见SEQID NO.8和SEQ ID NO.9，通过RT-PCR的方法从大豆科丰1号嫩叶的cDNA中分离出GmTLP1基因，全长为730bp，但是不包含终止密码子，具体的PCR过程与步骤1)相同。。然后跟据Invitrogen公司Gateway试剂盒的操作说明进行BP和LR反应，将不包含终止密码子的GmTLP1基因完整的ORF插入到Invitrogen公司开发的表达载体pMDC83中，这样就把GmTLP1基因完整的ORF与表达载体pMDC83上的报告基因GFP的3’端融合，形成一个35S-GmTLP1-GFP的嵌合基因，构建了植物过量表达表达载体35S-GmTLP1-GFP-pMDC83。将其和空载体分别通过冻融法转化根癌农杆菌EHA105，然后通过农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞，结果GmTLP1基因定位在细胞膜上。

4)基因GmTLP1的基因工程应用

将步骤3)获得的植物过量表达表达载体35S-GmTLP1-pMDC83，通过根癌农杆菌EHA105介导叶盘转化法转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR，引物和具体的PCR过程与步骤1)相同，实时荧光定量PCR(qPCR)引物序列见SEQ ID NO.6和SEQID NO.7，Southern blot分析引物序列见SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11验证后进行植物的抗病性评价：

在直径为15cm的培养皿中，先用含终浓度为50μg/ml筛选抗生素Hgy的1/2MS生根培养基培养，待野生型未转基因烟草(C)及T₁代转基因株系萌发生长成小苗后(约两周)，将它们移栽至带有营养土的花盆中，用保鲜膜封口保湿，待小苗长到顶住保鲜膜后揭开保鲜膜，让其自由生长。待长到具有四出复叶时，在第二出复叶上接种烟草花叶病毒，每株接半片叶子，为避免磨擦接种时力度不一致造成的误差，接种时轻轻涂抹均匀即可。接种TMV36h后，GmTLP1基因过表达转基因株系开始出现病斑，此时未转基因烟草C未出现病斑，随着接种TMV时间的延长，C也开始出现病斑，但GmTLP1基因过表达转基因株系病斑面积相对C扩展更快，接种TMV48h后，部分转基因株系已经开始枯萎，而C只是病斑面积扩大，并未出现枯萎现象，即过表达转GmTLP1基因植株出现病斑比未转基因烟草C早14h，叶片枯斑损失面积达到叶片面积一半时相对C快至少20h以上(图3、4、5)。

序列表

<110>南京农业大学

<120>大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的抗病性基因工程应用

<130>GmTLP1.prj

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1021

<212>DNA

<213>Glycine max

<220>

<221>GmTLP1全长

<222>(1)..(1021)

<223>

<400>1

tgggcccgac gtcgcatgct cccggccgcc atggcggccg cgggaattcg attaatgact    60

ctcacaaagg cctcgttctt tgtgaccgct ctatgctgca cctctgccgc atatgctgca    120

aggtttgaca tcacaaaccg atgcccatac cctgtttggg ccgcggctgt gcctggcggt    180

ggcaggaggc tgaactcggg ccagtcatgg gctttagacg tgcctgcagg aacgaaaggg    240

gcccgcgttt gggcccgaac cggctgcaac ttcgacggct cgggccgcgg tggatgccag    300

accggtgact gcgggggtgt cctcgactgc aaagcttacg gcacgcctcc caacacccta    360

gcggaatacg cactgaacca gttcagcaat ttggacttct tcgacatctc cctcgtggac    420

ggttttaacg tgcccatgga ctttagtcca acctcgaatg ggtgcacacg tggcataagc    480

tgcactgcgg acattaacgg acagtgccct agtcagctaa agactcaagg aggctgcaac    540

aacccttgca ctgtcttcaa aaccgaccag tactgttgca attccggtag ctgtgtgccc    600

actgattatt ccagattctt caagcaaagg tgccccgatg cttatagtta ccccaaggat    660

gatccaacta gcaccttcac ttgtaagggt gggactaact atagggttgt cttttgccct    720

tgaacccaat aacctcttct attacggaca caatcactag tgaattcgcg gccgcctgca    780

ggtcgaccat atgggagagc tcccaacgcg ttggatgcat agcttgagta ttctatagtg    840

tcacctaaat agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc    900

gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta    960

atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggatc    1020

g                                                                    1021

<210>2

<211>669

<212>DNA

<213>Glycine max

<220>

<221>GmTLP1(CDS)

<222>(1)..(669)

<223>

<400>2

atgactctca caaaggcctc gttctttgtg accgctctat gctgcacctc tgccgcatat    60

gctgcaaggt ttgacatcac aaaccgatgc ccataccctg tttgggccgc ggctgtgcct    120

ggcggtggca ggaggctgaa ctcgggccag tcatgggctt tagacgtgcc tgcaggaacg    180

aaaggggccc gcgtttgggc ccgaaccggc tgcaacttcg acggctcggg ccgcggtgga    240

tgccagaccg gtgactgcgg gggtgtcctc gactgcaaag cttacggcac gcctcccaac    300

accctagcgg aatacgcact gaaccagttc agcaatttgg acttcttcga catctccctc    360

gtggacggtt ttaacgtgcc catggacttt agtccaacct cgaatgggtg cacacgtggc    420

ataagctgca ctgcggacat taacggacag tgccctagtc agctaaagac tcaaggaggc    480

tgcaacaacc cttgcactgt cttcaaaacc gaccagtact gttgcaattc cggtagctgt    540

gtgcccactg attattccag attcttcaag caaaggtgcc ccgatgctta tagttacccc    600

aaggatgatc caactagcac cttcacttgt aagggtggga ctaactatag ggttgtcttt    660

tgcccttga                                                669

<210>3

<211>222

<212>PRT

<213>Glycine max

<220>

<221>GmTLP1的蛋白序列

<222>(1)..(222)

<223>

<400>3

Met Thr Leu Thr Lys Ala Ser Phe Phe Val Thr Ala Leu Cys Cys Thr

1               5                   10                  15

Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Phe Asp Ile Thr Asn Arg Cys Pro Tyr

            20                  25                  30

Pro Val Trp Ala Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Arg Arg Leu Asn Ser

        35                  40                  45

Gly Gln Ser Trp Ala Leu Asp Val Pro Ala Gly Thr Lys Gly Ala Arg

    50                  55                  60

Val Trp Ala Arg Thr Gly Cys Asn Phe Asp Gly Ser Gly Arg Gly Gly

65                  70                  75                  80

Cys Gln Thr Gly Asp Cys Gly Gly Val Leu Asp Cys Lys Ala Tyr Gly

                85                  90                  95

Thr Pro Pro Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asn Gln Phe Ser Asn

            100                 105                 110

Leu Asp Phe Phe Asp Ile Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Val Pro Met

        115                 120                 125

Asp Phe Ser Pro Thr Ser Asn Gly Cys Thr Arg Gly Ile Ser Cys Thr

    130                 135                 140

Ala Asp Ile Asn Gly Gln Cys Pro Ser Gln Leu Lys Thr Gln Gly Gly

145                 150                 155                 160

Cys Asn Asn Pro Cys Thr Val Phe Lys Thr Asp Gln Tyr Cys Cys Asn

                165                 170                 175

Ser Gly Ser Cys Val Pro Thr Asp Tyr Ser Arg Phe Phe Lys Gln Arg

            180                 185                 190

Cys Pro Asp Ala Tyr Ser Tyr Pro Lys Asp Asp Pro Thr Ser Thr Phe

        195                 200                 205

Thr Cys Lys Gly Gly Thr Asn Tyr Arg Val Val Phe Cys Pro

    210                 215                 220

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Glycine max

<220>

<221>GmTLP1克隆引物正义序列

<222>(1)..(20)

<223>

<400>4

atgactctca caaaggcctc                                    20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Glycine max

<220>

<221>GmTLP1克隆引物反义序列

<222>(1)..(20)

<223>

<400>5

agggcaaaag acaaccctat                                20

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>Glycine max

<220>

<221>GmTLP1克隆荧光定量引物正义序列

<222>(1)..(18)

<223>

<400>6

aatgggtgca cacgtggc                                  18

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>Glycine max

<220>

<221>GmTLP1克隆荧光定量引物反义序列

<222>(1)..(24)

<223>

<400>7

cctttgcttg aagaatctgg aata                           24

<210>8

<211>51

<212>DNA

<213>Glycine max

<220>

<221>GmTLP1载体构建引物正义序列

<222>(1)..(51)

<223>

<400>8

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catgactctc acaaaggcct c    51

<210>9

<211>50

<212>DNA

<213>Glycine max

<220>

<221>GmTLP1载体构建引物反义序列

<222>(1)..(50)

<223>

<400>9

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc agggcaaaag acaaccctat    50

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>Glycine max

<220>

<221>Southern blot探针引物正义序列

<222>(1)..(18)

<223>

<400>10

gctcctacaa atgccatc                                18

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>Glycine max

<220>

<221>Southern blot探针引物反义序列

<222>(1)..(23)

<223>

<400>11

gattgtgtgg acaggtaatg gtt                          23