昆虫病原线虫的分离与检测装置以及土壤中昆虫病原线虫的分离方法及种群密度测量方法

摘要

昆虫病原线虫的分离与检测装置以及土壤中昆虫病原线虫的分离方法及种群密度测量方法，解决了现有技术中存在的需时较长和破坏作物等问题。该装置由采集管和捕捉管组成，采集管由采集管上盖、采集管壁和网罩组成，捕捉管由捕捉管壁和无纺布条组成。分离方法：将大蜡螟装入采集管的网罩内然后将采集管放入土壤，两天后取回培养1天，再利用WhiteTrap法培养七到十天可分离线虫。种群密度测量方法：将盛有清水的捕捉管与装有大蜡螟的采集管安装后放入土壤，48小时后取回，观察记录水里线虫个数，计算得土壤线虫种群密度。本发明可用于昆虫病原线虫的野外采集及应用该线虫作生物防治因子对田间土壤线虫种群密度的跟踪和测定。

说明书

技术领域

本发明涉及一种线虫的分离与检测装置、分离方法以及种群密度测量方法。

背景技术

昆虫病原线虫是一类专门寄生于土壤害虫的微小动物，它隶属于动物界，线虫门（Nematoda），侧尾腺口纲（Secernentea），圆线虫目（Rhabditida），斯氏线虫科（Steinernematidae）和异小杆线虫科（Heterhabditidae）。这类线虫的侵染期阶段可以在土壤中存活较长时间并能主动搜寻对人类有害的昆虫寄主，找到寄主后，它通过昆虫的口道、气门或体壁钻入昆虫血液循环系统，然后通过释放共生菌，使寄主昆虫在24到48小时内死亡。国内外科学工作者研究认为，这类线虫对人畜以及其它有益生物包括害虫天敌等均无任何不良影响，而且全世界各地区均有分布。利用昆虫病原线虫进行以虫治虫可以使农民在无公害生产中减少农药用量，起到保护水质和环境的作用。目前国内外一些发达地区越来越多地生产和使用这类生物进行地下害虫和钻蛀性害虫的防治。

在应用昆虫病原线虫进行防治的过程中，有效地从当地土壤中分离适合于地方生态条件的线虫品种和品系是成功防治害虫的关键。此类工作目前是通过田间取回土样后，将土样分装在培养皿或塑料袋内，然后放入大蜡螟(Galleriamellonella)等幼虫进行诱集。这种方法费时费力，且需要占用较大的空间，花费大量时间来检查实验结果，以上种种因素限制了对该线虫的野外搜寻范围从而减少了分离机会。

另外，在科技人员或植物保护工作者将该线虫释放到田间进行防治某种害虫后需要跟踪监测线虫在土壤中的存活情况以便决定下一次应用的必要性、应用时间及用量。这一过程在以往和现在采用的方法如上述，所不同的是田间取样势必会破坏田间的作物。另外在定量时采用大蜡螟诱集直至土样中没有线虫为止要花费很多时间，同时还要对被侵染的大蜡螟逐头解剖数虫，此过程费时费力。

发明内容

本本发明的目的是解决目前昆虫病原线虫的分离方法及定量测量方法中，存在需要采集土样、解剖死虫体、需时较长、破坏作物以及解剖大蜡螟导致的费时费力的问题，提供了一种昆虫病原线虫的分离与检测装置以及土壤中昆虫病原线虫的分离方法及种群密度测量方法。

昆虫病原线虫的分离与检测装置，它由采集管和捕捉管组成；所述采集管由采集管上盖、采集管壁和网罩组成，采集管壁为两端开口的管状结构，采集管上盖密封安装在采集管壁的上端，网罩的上端开口、下端封闭，网罩的上端开口处与采集管壁的下端封闭连接，网罩的下端暴露在采集管壁外；所述捕捉管由捕捉管壁和无纺布条组成，捕捉管壁为上端开口、下端封闭的管状结构，捕捉管壁的侧壁上设有一个横向长孔，无纺布条封闭安装在此长孔处；采集管壁的下端与捕捉管壁的上端插接在一起，且网罩置于捕捉管壁内。

土壤中昆虫病原线虫的分离方法，它的过程如下：

步骤A1、将安装在一起的采集管和捕捉管拆离，然后将大蜡螟装入采集管，然后在采集管内塞入棉球，使大蜡螟一直停留在网罩内；

步骤A2、在待采集的土壤上打一个洞，在洞内放入装有大蜡螟的采集管；

步骤A3、48小时后，从洞中取回采集管，并在25℃下培养一天后，观察是否有大蜡螟已死亡；

步骤A4、利用WhiteTrap法对死亡的大蜡螟再进一步培养七到十天，即可分离出昆虫病原线虫。

土壤中昆虫病原线虫的种群密度测量方法，它的过程如下：

步骤B1、将安装在一起的采集管和捕捉管拆离，然后将大蜡螟装入采集管，然后在采集管内塞入棉球，使大蜡螟一直停留在网罩内；在捕捉管内装清水至长孔处，然后将盛有清水的捕捉管与装有大蜡螟的采集管安装在一起；

步骤B2、在土壤上打一个洞，然后将步骤B2中安装好的捕捉管和采集管作为整体放入洞中，其中采集管在上、捕捉管在下；

步骤B3、48小时后，从洞中取回安装在一起的采集管和捕捉管，然后卸掉捕捉管，并将捕捉管中的水吸出后，在显微镜下观察水里的昆虫病原线虫的个数；

步骤B4、根据步骤B3中观察到的昆虫病原线虫的个数，计算获得土壤中昆虫病原线虫的种群密度。

本发明既不破坏作物的正常生长，又无需将土样带回实验室，且无需进行大蜡螟的解剖，可提高效率。

附图说明

图1为本发明的昆虫病原线虫的分离与检测装置中的采集管的结构示意图；图2为本发明的昆虫病原线虫的分离与检测装置中的捕捉管的结构示意图；图3为本发明的昆虫病原线虫的分离与检测装置的采集管和捕捉管安装在一起后的整体结构示意图；图4为实施方式三中制定的标准曲线图。

具体实施方式

 具体实施方式一：结合图1至图3说明本实施方式，本实施方式的昆虫病原线虫的分离与检测装置，它由采集管和捕捉管组成；所述采集管由采集管上盖11、采集管壁12和网罩13组成，采集管壁12为两端开口的管状结构，采集管上盖11密封安装在采集管壁12的上端，网罩13的上端开口、下端封闭，网罩13的上端开口处与采集管壁12的下端封闭连接，网罩13的下端暴露在采集管壁12外；所述捕捉管由捕捉管壁21和无纺布条22组成，捕捉管壁21为上端开口、下端封闭的管状结构，捕捉管壁21的侧壁上设有一个横向长孔，无纺布条22封闭安装在此长孔处；采集管壁12的下端与捕捉管壁21的上端插接在一起，且网罩13置于捕捉管壁21内。

网罩13下端底部距采集管壁12的下端开口处的距离可为20毫米。

捕捉管壁21的上端开口处与下端底部间的距离可为45毫米。

捕捉管壁21的侧壁上的长孔可为长16毫米、宽4毫米的长方形孔。

所述长方形孔的上端边缘与采集管壁12的下端边缘之间的距离可为20毫米，长方形孔的下端边缘与捕捉管壁21的下端底部之间的距离可为21毫米。

捕捉管壁21的下部可呈倒圆锥形。

本实施方式的昆虫病原线虫的分离与检测装置，可由15毫升塑料离心管改造而成，也可由厂家直接批量生产。

将15毫升离心管由底部上量45毫米处切断，然后在上部分的内端嵌入一个由铁丝网做成的上面开口、下端带底的网罩，网罩下端暴露于离心管外的部分为20毫米，此部分作为采集管。

切下的下部分先在由底部上量25毫米处向下开长方形口（4毫米x16毫米）。然后将此开口用普通无纺布封上即成捕捉管。将采集管和捕捉管安装在一起就可以用于线虫的定量测定，野外采集时将捕捉管部分去掉就可用于定性测定和线虫新品种的诱集分离。

具体实施方式二：本实施方式的土壤中昆虫病原线虫的分离方法，它基于实施方式一中的昆虫病原线虫的分离与检测装置实现，它的过程如下：

步骤A1、将安装在一起的采集管和捕捉管拆离，然后将大蜡螟装入采集管，然后在采集管内塞入棉球，使大蜡螟一直停留在网罩13内；

步骤A2、在待采集的土壤上打一个洞，在洞内放入装有大蜡螟的采集管；

步骤A3、48小时后，从洞中取回采集管，并在25℃下培养一天后，观察是否有大蜡螟已死亡；

步骤A4、利用WhiteTrap法对死亡的大蜡螟再进一步培养七到十天，即可分离出昆虫病原线虫。

在步骤A1中，放入采集管内的大蜡螟可为多个。

下面提供一个具体实施例：

首先将安装在一起的采集管和捕捉管拆离，然后打开采集管上盖11，将2头大蜡螟装入采集管的网罩13内，然后将棉球塞进采集管内，使2头大蜡螟一直停留在网罩13内。其中，所述网罩13由普通铁丝网构成。

根据待采集地点的面积，准备足够数量的采集管（其中每只采集管内各装有2头大蜡螟）带到待采集地点，在每一个采集点，用直径约20毫米的方楞锥在土壤中打一个50毫米深的洞，然后埋入3到5只采集管，且相互距离不小于50毫米。

48小时后，取回所有采集管，在25℃下培养一天后，观察是否有大蜡螟已被昆虫病原线虫侵染后死亡。

将死亡的大蜡螟利用WhiteTrap中进一步培养，七到十天后即可分离出昆虫病原线虫。

WhiteTrap法是一种实验室利用活体昆虫培养和收集昆虫病原线虫的方法。具体方法和步骤如下：

将被侵染的昆虫（常用大蜡螟幼虫）放置在倒置的并事先铺好潮湿滤纸的小培养皿（直径=60mm）皿盖内；将上述皿盖放置于大培养皿（直径=100mm）内，放好后在大培养皿内加水，水量以刚好覆盖皿底为宜。盖好大皿盖；放25度恒温箱内培养7天左右待发现水中出现线虫后将线虫水收集并更换新水，每天采收一次知道水中停止出现线虫为止。

本实施方式可实现野外分离线虫，或对田间某一位置是否有线虫进行定性检测。由于检测过程是在野外直接进行，而无需将土样带回实验室，而且不需要解剖死虫体，本实施方式在一定时间内可提高检测效率。

具体实施方式三：本实施方式的土壤中昆虫病原线虫的种群密度测量方法，它基于实施方式一中的昆虫病原线虫的分离与检测装置实现，它的过程如下：

步骤B1、将安装在一起的采集管和捕捉管拆离，然后将大蜡螟装入采集管，然后在采集管内塞入棉球，使大蜡螟一直停留在网罩13内；在捕捉管内装清水至长孔处，然后将盛有清水的捕捉管与装有大蜡螟的采集管安装在一起；

步骤B2、在土壤上打一个洞，然后将步骤B2中安装好的捕捉管和采集管作为整体放入洞中，其中采集管在上、捕捉管在下；

步骤B3、48小时后，从洞中取回安装在一起的采集管和捕捉管，然后卸掉捕捉管，并将捕捉管中的水吸出后，在显微镜下观察水里的昆虫病原线虫的个数；

步骤B4、根据步骤B3中观察到的昆虫病原线虫的个数，计算获得土壤中昆虫病原线虫的种群密度。

其中，步骤B4中所述的计算获得土壤中昆虫病原线虫的种群密度的过程中，是利用事先做好的标准曲线进行的计算。

土壤中昆虫病原线虫通过对寄主昆虫释放的二氧化碳的趋性来寻找寄主，根据这一特性，首先人为定量的将不同浓度梯度的昆虫病原线虫均匀混入同一地块的土壤中，然后利用本发明装置检测昆虫病原线虫进入装置的数量。实践已经证明土壤混入的每平方厘米的线虫数和进入本装置的线虫数成正比。利用这一相关关系即可建立标准曲线。

建立所述标准曲线的具体过程为：

一、试验条件的优化：特定昆虫病原线虫施入量下，检测时间、装置间距离对昆虫病原线虫进入的影响，找到最佳检测时间及最佳应用距离；

二、在已优化条件下，选择7个不同的施用密度，其中包括实际应用密度以及最大和最小田间应用密度，检测线虫进入装置的数量，利用这两组数据则可建立标准曲线。为使建立的标准曲线准确可靠，试验在不同时间重复三次，最后取平均数建立最终的标准曲线。

利用以下浓度梯度（1头/cm²、10头/cm²、20头/cm²、40头/cm²、60头/cm²、80头/cm²）的线虫混入土壤后利用本发明装置进行回收，然后根据实际浓度梯度和回收线虫数量通过线性回归制定出标准曲线，如图4所示，图4所示曲线对应的线性方程为y=0.0002x–2.4478，其中x为横坐标，它为土壤中混入的每平方米的线虫数，y为纵坐标，它为进入本装置的线虫数。

假设在被测土壤里回收的线虫数量是70头，将y=70代入方程式y=0.0002x–2.4478后得出x=362239头/m²。换算成3.6头/cm²。被测土壤中每平方厘米大约含有3.6头线虫。

本实施方式可对土壤中释放的线虫进行定量测定，测定的主要过程是在田间进行，既不破坏作物的正常生长，又无需将土样带回实验室，且无需进行大蜡螟的解剖。本发明在一定时间内可提高检测效率。