以幼嫩植株及幼叶片切块为外植体的君子兰离体繁殖方法

摘要

本发明为花卉繁殖方法，具体涉及君子兰体外无性快速繁殖方法。本发明采用外植体接种及愈伤诱导、丛生芽的诱导、导分化培养、根的诱导、再生植株培养、再生植株移栽等技术快速繁殖君子兰花卉。可以在不影响母株正常发育及繁殖的情况下使君子兰在相对短的时间内大规模繁殖出遗传背景相同、外观整齐的植株；取材不受季节限制；再生周期短；脱分化率及分化率高；生根率高；移栽成活率高，植株移栽后生长状态良好；非常适用于君子兰稀缺品种的快速繁殖；适用于君子兰“叶盘转化法”转基因；平均单株再生苗的成本极低，非常适合工厂化生产。

说明书

技术领域

本发明为花卉繁殖方法，具体涉及君子兰体外无性快速繁殖方法。

背景技术

植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞的全能性，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，形成完整的植株或产生具有经济价值的其它产品的技术。由植物组织培养所产生的再生植株除了极低的变异外，基本都能保持亲本(外植体来源植株)的优良性状。植物组织培养技术发明以来已经取得了很大的进展，自上世纪60年代以来植物组织培养已经从实验室研究阶段成为一种大规模成批量的工厂化生产方法。君子兰，是石蒜科君子兰属的多年生草本观赏植株。原产南非高山，性喜温凉，于本世纪初经由德国和日本引入我国，并安家落户。是我国名贵花卉，经济价值较高。它株型端庄、叶、花、果并美，深受国内外花卉爱好者的青睐。目前，君子兰的繁殖方式主要为种子繁殖与分株繁殖，这两种方式的繁殖速度都很慢：成龄君子兰一年只开一次花，且种子至少需要9个月才能成熟；分株繁殖-年最多分出1～3株。由于君子兰高度杂合，种子繁殖得到珍品君子兰的得率很低，即便以珍品君子兰做父母本得到珍品的几率仍很低，珍品君子兰在国内、国际市场一直供不应求。利用植物组织培养技术快速地离体繁殖君子兰可以大规模产生株型统一的君子兰，快速繁殖君子兰优良稀缺品种，进一步满足国内、国际市场的需求。前人所做的君子兰组织培养实验虽然已经初步获得成功，但由于再生率低、再生周期长等限制了君子兰组织培养技术在实际生产中的应用。本发明可使君子兰在一年以内实现快速繁殖。

发明内容

为克服传统繁殖方法产生君子兰株型千差万别、繁殖速度慢的缺点；也为了克服前人君子兰组织培养实验中再生率低(平均每块外植体再生出0～2株再生芽)、再生周期长的缺点。提供一种以幼嫩植株及幼叶片切块为外植体的君子兰离体快速繁殖方法

本发明所采用的技术方案是：

1.外植体的获得：取成熟种子，放入无菌超净台中，用75％(体积/体积)酒精浸泡1～2min，用0.1～0.2％(质量/体积)的氯化汞水溶液浸泡10～20分钟，无菌水冲洗3～5遍，将种子接种到不含激素的1/2MS半固体培养基上，20～30℃每天8-12小时光照培养。

2.外植体接种及愈伤诱导：待步骤1种苗长出1-2片叶时，将小植株的地上部分(包括幼叶和幼茎)切为直径3～5mm的小块，接种在含6-BA1～2mg/L、NAA0.5～2.0mg/L、蔗糖3.0％(质量/体积)的MS半固体培养基上，20～30℃每天40W日光灯照射8～9小时。40～50天继代一次，待长出黄色粒状愈伤时即可诱导分化。也可用无菌再生植株幼嫩地上部分为外植体。

3.丛生芽的诱导：将愈伤转接到诱导分化培养基：MS+KT(2.0～4.0mg/L)+2，4-D(0.2～0.5mg/L)+3.0％(质量/体积)蔗糖，40～50天继代一次，20～30℃每天光照10～12小时。转分化培养基4个月时从一片来源的愈伤可分化出121株再生苗。

4.根的诱导：再生植株转到1/2MS+蔗糖2％(质量/体积)的生根培养基上，20～30℃每天10～14小时光照。

5.再生植株移栽：植株生根后便可移栽。腐殖土121℃灭菌30～60分钟以上。移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净。7天左右浇一次透水便可成活。

本发明使君子兰在相对短的时间内大量产生基因背景完全相同、株型统一的再生植株。以幼嫩植株地上部分的切块为外植体的脱分化率均值可达72％，愈伤分化率均值可达87.5％，单片叶产生的愈伤经继代可分化出几百株再生苗，丛生芽生根率可达100％，在适宜环境下移栽成活率达100％。

本发明可以在不影响母株正常发育及繁殖的情况下使君子兰在相对短的时间内大规模繁殖出遗传背景相同、外观整齐的植株；取材不受季节限制；再生周期短；脱分化率及分化率高；生根率高；移栽成活率高，植株移栽后生长状态良好；非常适用于君子兰稀缺品种的快速繁殖；适用于君子兰“叶盘转化法”转基因；平均单株再生苗的成本极低，非常适合工厂化生产。

具体实施方式

下面将结合实际操作对本发明作进一步的说明，但本发明的范围并不局限于以下的实施例。

实施例1：

1.外植体的获得：取成熟种子，放入无菌超净台中，用75％(体积/体积)酒精浸泡1min，用0.1％(质量/体积)的氯化汞水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗3遍，将种子接种到不含激素的1/2MS半固体培养基上，20℃每天8小时光照培养。

2.外植体接种及愈伤诱导：将步骤1中长出1片叶的小植株或者含有1片叶的无菌再生植株的地上部分(包括幼叶和幼茎)切为直径3mm的小块，接种在含6-BA1mg/L、NAA0.5mg/L、蔗糖3.0％(质量/体积)的MS半固体培养基上，20℃每天40W日光灯照射8小时。40天继代一次，待长出黄色粒状愈伤时即可诱导分化。

3.丛生芽的诱导：将愈伤转接到诱导分化培养基：MS+KT2.0mg/L+2，4-D0.2mg/L+3.0％(质量/体积)蔗糖，40天继代一次，20C每天光照10小时。

4.根的诱导：再生植株转到1/2MS+蔗糖2％(质量/体积)的生根培养基上，20℃每天10小时光照。

5.再生植株移栽：植株生根后便可移栽。腐殖土121℃灭菌30分钟。移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净。7天左右浇一次透水便可成活。

实施例2：

1.外植体的获得：取成熟种子，放入无菌超净台中，用75％(体积/体积)酒精浸泡2min，用0.2％(质量/体积)的氯化汞水溶液浸泡20分钟，无菌水冲洗5遍，将种子接种到不含激素的1/2MS半固体培养基上，30℃每天12小时光照培养。

2.外植体接种及愈伤诱导：将步骤1中长出两片叶的小植株或长有两片叶的无菌再生植株的地上部分(包括幼叶和幼茎)切为直径5mm的小块，接种在含6-BA2mg/L、NAA2.0mg/L、蔗糖3.0％(质量/体积)的MS半固体培养基上，30℃每天40W日光灯照射9小时。50天继代一次，待长出黄色粒状愈伤时即可诱导分化。

3.丛生芽的诱导：将愈伤转接到诱导分化培养基：MS+KT4.0mg/L+2，4-D0.5mg/L+3.0％(质量/体积)蔗糖，50天继代一次，30℃每天光照12小时。

4.根的诱导：再生植株转到1/2MS+蔗糖2％(质量/体积)的生根培养基上，30℃每天14小时光照。

5.再生植株移栽：植株生根后便可移栽。腐殖土121℃灭菌60分钟。移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净。7天左右浇一次透水便可成活。、

实施例3：

1.外植体的获得：取成熟种子，放入无菌超净台中，用75％(体积/体积)酒精浸泡40S，用0.15％(质量/体积)的氯化汞水溶液浸泡15分钟，无菌水冲洗4遍，将种子接种到不含激素的1/2MS半固体培养基上，24℃每天10小时光照培养。

2.外植体接种及愈伤诱导：待步骤1种苗长出1片叶时，将小植株的地上部分(包括幼叶和幼茎)切为直径4mm的小块，接种在含6-BA1.5mg/L、NAA1.0mg/L、蔗糖3.0％(质量/体积)的MS半固体培养基上，24℃每天40W日光灯照射8.5小时。45天继代一次，待长出黄色粒状愈伤时即可诱导分化。也可用一片叶的无菌再生植株幼嫩地上部分为外植体。

3.丛生芽的诱导：将愈伤转接到诱导分化培养基：MS+KT(3mg/L)+2，4-D(0.4～mg/L)+3.0％(质量/体积)蔗糖，45天继代一次，24℃每天光照11小时。

4.根的诱导：再生植株转到1/2MS+蔗糖2％(质量/体积)的生根培养基上，24℃每天12小时光照。

5.再生植株移栽：植株生根后便可移栽。腐殖土121℃灭菌50分钟以上。移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净。7天左右浇一次透水便可成活。