用于肾移植排斥反应血清多肽检测方法

摘要

一种用于肾移植排斥反应的血清多肽检测方法，包含步骤：S1、将事先收集的血清样本按供体病患程度进行分类；S2、采用MB-WCX从血清样本组中的血清中分别捕获多肽并浓缩在磁珠上形成结合分子；S3、从磁珠上洗脱结合分子并进行MALDI-TOF质谱分析，将各个组别的样本测量出的差异多肽峰进行分类，建立分类预测模型，获得差异多肽表达图谱；S4、将待检测的肾移植排斥反应患者的血清样本采用MB-WCX结合后，进行MALDI-TOF质谱分析，并将分析结果与S3中获得的图谱进行比较，标定该血清样本的多肽。该方法有助于从蛋白质组学的层面更好地理解肾移植排斥反应的发病机理，为对肾移植排斥反应做出早期诊断提供了可能。

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物医学检验领域，尤其涉及一种用于肾移植排斥反应的血清多肽检测方法。

【背景技术】

同种异体肾移植术是大多数终末期肾脏病人的首选治疗方案。随着外科手术和免疫抑制疗法的发展进步，接受移植手术后存活超过一年的病人存活率已大于90％，但在移植后早期发生的移植物功能障碍仍是临床上亟待解决的难题之一，需要与当前的处置排斥反应的治疗手段相结合进行有效的早期监测。目前，国际唯一公认的确诊肾移植排斥反应的方法是移植肾活组织检查，该方法花费较高、操作不便，会给病人造成创伤、引起疼痛，同时还会引发如出血、感染、移植物失功等一系列并发症。一些报道还指出该监测手段并不能反映移植肾早期的变化，原因是肾功能并不总是与组织学的好转相关联。因此，急需开发一种能够替代肾活检的非侵袭性的检测方法，以降低因肾活检引起的并发症的发生风险。此外，应用非侵袭性的手段来评价移植肾功能，寻找到一系列新的具有高度敏感性和特异性的生物标记物，可以使更多的移植病人能及早监测到排斥反应发生，便于医生采取及时有效的治疗方案。

血清是生物医学研究领域理想的生物学样品，因为它最易受人体内环境的各种因素影响，它的获得是非侵袭性的，能够进行广泛收集。生物体的血清中约含有超过10,000种的差异蛋白和多肽，这些蛋白和多肽来自机体各部的组织和细胞，它们在数量和质量上的变化都是特异的，不仅受到疾病对组织的影响，还受到整个疾病过程的影响。血清蛋白主要由白蛋白、免疫球蛋白、抗胰蛋白酶、转铁蛋白和低丰度蛋白在内的总蛋白量构成，能指示人体内环境的复杂变化情况。在疾病诊断和药物监测的研究领域，研究者们对人类和实验动物血清蛋白质图谱的研究产生了极大的兴趣，各种血清蛋白质组学技术的开发应用使得疾病生物标记物的鉴定和药品安全和治疗监测成为现实。血清蛋白质组学分析技术不仅在疾病诊断和治疗监测方面较其他生物分析技术更具有优势，而且新的分析技术应用于蛋白质组学研究为从复杂的样品中同步鉴定分析物提供了可能。譬如蛋白质组学的核心技术之一质谱技术，就可以让我们仅用数微升的血清便可获得数以百计的小型或中等大小的多肽。

基质辅助激光解吸电离法(matrix assisted laser desorption ionization，MALDI)是一种广泛应用于蛋白质组学研究的质谱技术，是公认的用来分析蛋白质和多肽的一种最强大的工具。该技术引领了蛋白功能研究的革命，改进了质谱分析的精确度和灵敏度，使得对蛋白质的检测和鉴定达到了前所未有的水平。该技术已被成功地用来从生物液体中发现与疾病相关的生物标记物，研究蛋白间的相互作用，同时，MALDI-TOF MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)检测法在免疫蛋白质组学研究领域的应用前景也不容忽视。通过采用MALDI-TOF MS法联合磁珠纯化技术分离血清样本，并分析血清多肽的生物学信息，获得移植排斥反应患者血清多肽的质谱图，从而评估从小样本量中得到的差异性多肽作为检测肾移植排斥反应的潜在生物标记物的价值，将会为肾移植排斥反应的发病机制及早期诊断提供新的思路和新的依据。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种用于肾移植排斥反应的血清多肽检测方法，以评估从血清样本中得到的差异性多肽作为检测肾移植排斥反应的潜在生物标记物的价值。

为达到上述发明目的，本发明提出以下的技术方案：

一种用于肾移植排斥反应的血清多肽检测方法，包含以下步骤：

S1将事先收集的血清样本按病患志愿者肾活组织检查病理分级进行分类，分为急性移植肾排斥患者血清组、慢性移植肾排斥患者血清组、稳定移植肾功能对照血清组和健康对照血清组；

S2采用MB-WCX(弱阳离子交换磁珠)从上述血清样本组中的血清中分别捕获多肽并浓缩在磁珠上形成结合分子；

S3从磁珠上洗脱结合分子并进行MALDI-TOF质谱分析，将各个组别的样本测量出的差异多肽峰进行分类，建立分类预测模型，获得差异多肽表达图谱；

S4将待检测的肾移植排斥反应患者的血清样本采用MB-WCX结合后，进行MALDI-TOF质谱分析，并将分析结果与S3中获得的图谱进行比较，标定该血清样本的多肽。

本发明所提供的用于肾移植排斥反应的血清多肽检测方法中，所述步骤S2中MB-WCX结合的方法是：

S2-1涡旋混匀磁珠，获得均匀的磁珠混悬液；

S2-2将WCX磁珠混悬液转移到标准EP管中，吸打混匀；

S2-3向EP管加入样本血清，吸打混匀；

S2-4将EP管放置在磁珠分离器中，反复分离三次，收集贴在管壁的磁珠，

并用移液管移去上清液，待用。

本发明所提供的用于肾移植排斥反应的血清多肽检测方法中，所述步骤S3中从磁珠上洗脱结合分子的步骤包括：

1)向EP管加入磁珠洗液，在磁珠分离器中反复分离，收集管壁上的磁珠，并移去上清液；

2)向EP管加入WCX磁珠洗脱液，并用反复吸打，洗涤管壁上的磁珠；

3)收集管壁上的磁珠和上清液，转移到新的EP管内，并加入WCX磁珠固定液，吸打混匀，待用。

本发明所提供的用于肾移植排斥反应的血清多肽检测方法中，所述步骤S3中MALDI-TOF质谱分析的参数为：m/z：1,000-10,000，每一个质谱设置800个激光点，在50Hz频率下将每50个激光点作为一个组合，并定位在不同的位点表面。

本发明所提供的用于肾移植排斥反应的血清多肽检测方法中，所述步骤S3中对差异多肽峰进行分类前，还需要先对各组别样品的原始谱图进行处理，包括基线消减，并进行校正和归一化，再对多肽峰数据进行统计学分析。

从以上技术方案可以看出，本发明所提供的用于肾移植排斥反应的血清多肽检测方法检测出了有价值的差异性多肽，获得了可作为诊断肾移植排斥反应的潜在生物标记物，建立了有效区分移植排斥反应的诊断预测模型，有助于从蛋白质组学的层面更好地理解肾移植排斥反应的发病机理，为对肾移植排斥反应做出早期诊断提供了可能。

【附图说明】

图1所示是本发明实施例中MB-WCX纯化后各实验组的蛋白质谱图；

图2所示是本发明实施例中四个组别的单个样本重复四次的质谱图。

【具体实施方式】

1、材料和方法

1.1样本资料

样本血清的收集都来自空腹抽取志愿者，22位肾移植志愿者为经肾活检证明发生了排斥反应的患病志愿者、12例移植术后肾功能稳定患病志愿者、13例门诊体检正常的志愿者全血3ml置于生化管，4℃静置1h后，3000r/min离心5min，取上清冰浴，每20μl装一份，-80℃保存。

排斥患者肾活检样本按照Banff97分类法进行分类，其中有10例确诊为急性排斥反应，12例确诊为慢性排斥反应。12例慢性移植性肾病约在移植术后1.0～5.5年内发生，10例急性排斥约在移植术后1.0～90.0天内发生，并且都在用免疫抑制剂之前进行肾活检。另有12例年龄匹配的移植功能稳定患病志愿者设置为对照组，13例健康人设置为健康对照组。

1.2移植肾活组织检查样本

肾活检样本严格按照Banff97分类法进行分类，10例急排和12例慢排病人的组织标本经免疫组化显微镜检查法进行检测和确认。

1.3运用弱阳离子磁珠结合血清蛋白

采用弱阳离子交换磁珠MB-WCX(Bruker Daltonics，Ettlingen，Germany)结合样本的血清蛋白。①涡旋混匀磁珠1min，获得均一的磁珠混悬液；②将10μlWCX磁珠混悬液转移到0.5ml的标准EP管中，用吸液枪吸打混匀；③向EP管加入每例样本的血清各5μl，吸打混匀；④将EP管放置在磁珠分离器中，反复分离三次，1min后收集贴管壁的磁珠；⑤用移液管小心地移去上清液；⑥向EP管加入100μl的磁珠洗液，在磁珠分离器中反复分离十次，收集管壁上的磁珠，用吸液枪小心移去上清液，重复步骤六两次；⑦向EP管加入5μl的WCX磁珠洗脱液，并用移液枪反复吸打，洗涤管壁上的磁珠；⑧2min后收集管壁上的磁珠和上清液，转移到新的EP管内，并加入4μlWCX磁珠固定液，吸打混匀，预备在MALDI-TOF MS上点样并进行质谱分析。

1.4MALDI-TOF质谱分析

质谱在ClinProt系统下执行，血清多肽的数据分析由Autofiex MALDI-TOF/TOF质谱(Bruker Daltonik，Bremen，Germany)完成。设备包括355-nm Nd-YAG激光、网格离子源、延迟提取电子设备(DE)、高分辨率的同步离子选择器(TIS)、2-GHz数字转换器。质谱设置在m/z 1,000-10,000的最佳化状态，每一个质谱有800个激光点，在50-Hz频率下把每50个激光点作为一个组合，可得到16个组合，并定位在不同的位点表面。所得谱图均由flexAnalysis软件(Bruker Daltonik)自动获得，设置关键仪器模糊调节控制程序，以产生最佳品质的原始数据。

1.5统计分析肾移植排斥组的差异蛋白表达谱

应用ClinProTools 2.2软件(Bruker，Daltonik)分析所有从血清样本中得到的各个实验组和对照组的数据之前，应对样品原始谱图进行处理，包括基线消减，并进行校正和归一化。随后，选择软件内嵌的统计算法进行统计学分析，获得移植排斥组的差异表达蛋白质。显著的差异多肽峰由软件中的Welch′s T检验确定，分类预测模型由快速分类算法(Quick Classifier Algorithm，QC)建立。为了解分类预测的准确性，采用分类预测算法随机挑选一个样本作为实验样本，其余样本作为验证样本对建立的模型进行交叉验证。

2、结果

为了分析全部样本的血清蛋白生物学信息，本实施例成功地使用MB-WCX试剂盒对血清蛋白进行富集和纯化(结果如图1所示，图1所示的A到C是47例样本经WCX磁珠纯化后的分析图谱；A中是13例正常人、12例移植功能稳定患者、10例急排反应患者的联合分析图谱；B中是13例正常人、12例移植功能稳定患者、12例慢排反应患者的联合分析图谱；C中是12例慢排反应患者、10例急排反应患者的联合分析图谱。纯化后的样品经MALDI-TOF质谱上样后由ClinProTools软件分析生物学信息。图中的(N)代表健康对照组，(S)代表移植功能稳定组，(A)代表急排组，(C)代表慢排组，每个血清样本的生物学信息由密度曲线表示。X轴，分子质量(m/z)；y轴，特定的样本；水平线表示将健康对照组、移植功能稳定组、急排组、慢排组的样本区分开来。4组沿X轴所展示的密度差异代表将样本显著区分开的特异性多肽。样本经MALDI-TOF MS获得高分辨率的图谱，并经ClinPro Tools软件2.2分析，经由组间的密度差异显著区分各个样本的差异性多肽。

通过比较急排组和健康对照组的质谱图，筛选出18个有表达差异的多肽峰作为鉴别急排反应的潜在生物标记，各个峰m/z分别为2102.53，2756.02，2919.75，2991.01，3095.5，3884.65，4056.31，4093.64，4212.62，4251.74，4647.07，4894.62，4919.21，5739.17，5799.75，5812.07，5826.5，7968.44；其中8个在急排组高表达，分别是m/z 2756.02，2919.75，4894.62，4919.21，5739.17，5799.75，5812.07，5826.5。在急排组和移植功能稳定组的比较中，筛选出m/z为2079.24，2090.9，3229.03，5344.85共4个有表达差异的多肽峰，这4个多肽峰在急排组低表达，可作为鉴别急排反应的潜在生物标记。(见下表1)

表1排斥组和对照组有显著差异的多肽峰

Mass：质荷比；Dave：组间最大和最小的峰平均值之间的差；PTTA：Wilcoxon或Kruskal-Wallis检验的P值；PAD：Anderson-darling正态检验的P值；Ave，组间峰差的算术平均值。

在慢排组和健康对照组的比较中，筛选6个有表达差异的多肽峰，分别是m/z 2023.77，2043.16，2756.71，2869.99，3180.95，5900.5，其中m/z为2023.77和2043.16的多肽峰在慢排组低表达。同时，通过比较慢排组和移植功能稳定组多肽差异，发现有16个存在表达差异的多肽峰，分别是m/z 2079.01，2090.81，2540.69，2850.09，2919.88，2939.63，2946.84，5329.97，5383.73，5951.77，5992.85，6043.93，6382.12，7835.65，7876.8，9291.89，其中m/z为6382.12，7835.65，7876.8和9291.89的多肽峰在慢排组高表达。(见表1)

比较分析急排组和慢排组的多肽差异，发现有6个存在表达差异的多肽峰，分别是m/z 1433.88，1676.36，3180.75，4255.83，4359.83，4806.47，其中m/z为1433.88，1676.36，4359.83，4806.47的4个多肽峰在急排组高表达，将急排组与慢排组显著区分开来，结果如表1所示。

急排组、移植功能稳定组和健康组的比较中，筛选了m/z为2043.35，2647.74，2919.88，2939.82，3228.91，8690.67共6个有表达差异的多肽峰；慢排组、移植功能稳定组和健康组的比较中，筛选了m/z为2043.05，2647.56，2850，2868.63，2919.98，2939.72，3083.95，3180.71，3228.98共9个有表达差异的多肽峰。另外，通过比较移植功能稳定组和健康组的多肽差异，也筛选出了7个有表达差异的多肽峰，分别是m/z 2043.58，2647.37，2917.8，2939.68，3180.59，3228.96，5899.34，结果如表1所示。

本实施例采用ClinPro Tools 2.2软件对上述实验结果进行统计分析，并用QC算法对样本进行分类以及建立诊断预测模型。该模型对于区分急排组和移植功能稳定组的识别率为90.28％，交叉验证能力为83.83％；对区分急排组和健康组的识别率为82.64％，交叉验证能力为77.03％。建立的诊断模型对区分慢排组和移植功能稳定组的识别率为87.85％，交叉验证能力为86.50％；对区分慢排组和健康组的识别率为98.96％，交叉验证能力为97.58％；模型对区分急排组和慢排组的识别率为88.69％，交叉验证能力为84.00％。

3、结论

本发明采用了一种简便、高效的蛋白质组学技术MB-WCX纯化联合MALDI-TOF质谱分析作为鉴定新的生物标记物的方法。经过MB-WCX纯化，组间峰值差异显著，组内多肽峰则保持一致(见图2，A(急排组)、C(慢排组)、S(移植功能稳定组)、N(健康对照组)四个实验组的单个样本重复四次的质谱图，表明经WCX磁珠纯化后样品重复性好。)。

在本实施例中，把血清样本分为4组，包括急排组10例、慢排组12例、移植功能稳定组12例、健康组13例，并比较了各组间的多肽差异。

移植排斥反应是移植术后发生的一种复杂的生物学现象，临床上的肾移植排斥反应是各种免疫因素共同作用的结果，而特异性的免疫反应又是排斥发生的关键。另外，各种并发症如糖尿病、高血压、心血管疾病、感染及恶性肿瘤等危险因子也是直接或间接影响移植病人移植肾排斥反应、移植肾失功以及存活的主要原因。

通过健康对照组和移植各组的比较，筛选出18个有表达差异的可用于鉴别急排组和健康组的多肽峰，其中的8个在急排组高表达；筛选出的6个有表达差异的多肽峰可用于鉴别慢排组和健康组，其中有2个在慢排组低表达；7个有表达差异的多肽峰可用于鉴别移植功能稳定组和健康组。上述结果表明，移植病人的血清多肽生物学信息与健康人相比存在显著差异。在急排组与慢排组的比较中，筛选6个有表达差异的多肽峰，4个在急排组高表达。另外，在多个组的比较中，也获得了有显著差异的多肽峰，表明本实施例的4组血清样本的生物学信息存在显著差异。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。