以聚乙二醇作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选96条件试剂盒

摘要

本发明公开了一种以聚乙二醇作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选96条件试剂盒，其目的是解决现有的96条件筛选试剂盒在蛋白质结晶条件筛选中成功率低的技术问题。技术方案是采用的PEG是BMCD数据库中统计出的使用频率最高的前8种，不是随机选取，显著地提高了生物大分子结晶的成功率。如刀豆球蛋白的成功率由背景技术的4.2％提高到81.2％，溶菌酶的成功率由背景技术的29.2％提高到46.9％，蛋白酶K的成功率由背景技术的58.3％提高到66.7％，过氧化氢酶的成功率由背景技术的15.6％提高到30.2％。另外由于本试剂盒是以PEG为沉淀剂的，所用试剂种类较少，相对背景技术试剂盒成本较低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白质结晶筛选的96条件试剂盒，特别是以不同分子量的聚乙二醇(PEG)作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选的96条件试剂盒。

背景技术

Hampton Research公司公开的名为Index^TM的96条件筛选试剂盒的具体组成如下表，包括三部分，沉淀剂、盐、缓冲液。沉淀剂主要包括铵盐、钠盐、镁盐、磷酸盐、甲酸盐、有机物、聚合物等，其浓度都较高，在2M左右；盐主要包括钠盐、镁盐、钙盐、硫酸盐、醋酸盐、酒石酸盐等，其浓度较低，在1M以下；缓冲液包括6种，浓度是0.1M，pH值范围从3到9。

表1：Index^TM96条件成分表

  序号盐  缓冲液  pH  沉淀剂  A1  0.1M柠檬酸  3.5  2.0M硫酸铵  A2  0.1M三水乙酸钠  4.5  2.0M硫酸铵  A3  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  2.0M硫酸铵  A4  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  2.0M硫酸铵  A5  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  2.0M硫酸铵  A6  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  2.0M硫酸铵  A7  0.1M柠檬酸  3.5  3.0M氯化钠  A8  0.1M三水乙酸钠  4.5  3.0M氯化钠  A9  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  3.0M氯化钠  A10  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  3.0M氯化钠  A11  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  3.0M氯化钠  A12  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  3.0M氯化钠

  序号盐  缓冲液  pH  沉淀剂  B1  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  0.3M甲酸镁  B2  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  0.5M甲酸镁  B3  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  0.5M甲酸镁  B4  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  0.3M甲酸镁B55.6  1.26M磷酸钠0.14M磷酸钾B66.9  0.49M磷酸钠0.91M磷酸钾B78.2  0.056M磷酸钠1.344M磷酸钾  B8  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  1.4M柠檬酸三钠  B9  1.8M柠檬酸三铵pH 7.0  B10  0.8M丁二酸pH 7.0

  序号盐  缓冲液  pH  沉淀剂B11  2.1M DL-2-羟基丁二酸pH7.0  B12  2.8M三水乙酸钠pH 7.0  C1  3.5M甲酸钠pH 7.0  C2  1.1M酒石酸二铵pH 7.0  C3  2.4M丙二酸钠pH 7.0  C4  35％v/v Tacsimate pH 7.0  C5  60％v/v Tacsimate pH 7.0  C6  0.1M氯化钠  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  1.5M硫酸铵  C7  0.8M酒石酸钾钠  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  0.5％w/v PEG MME 5,000  C8  1.0M硫酸铵  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  1％w/v PEG 3,350C91.1M丙二酸钠pH 7.00.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸7.0  0.5％v/v聚醚胺ED-2001pH7.0

  序号盐  缓冲液  pH  沉淀剂  C10  1.0M丁二酸pH 7.0  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.0  1％w/v PEG MME 2,000  C11  1.0M硫酸铵  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.0  0.5％w/v PEG 8,000C12  15％v/vTacsimate pH 7.00.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸7.02％w/v PEG 3,350  D1  25％w/v PEG 1,500D20.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸7.0  30％v/v聚醚胺M-600pH7.0D30.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸7.0  30％v/v聚醚胺ED-2001pH7.0  D4  0.1M柠檬酸  3.5  25％w/vPEG 3,350  D5  0.1M三水乙酸钠  4.5  25％w/vPEG 3,350  D6  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  25％w/vPEG 3,350  D7  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  25％w/vPEG 3,350

  序号盐  缓冲液  pH  沉淀剂  D8  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  25％w/vPEG 3,350  D9  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  25％w/vPEG 3,350  D10  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  20％w/vPEG MME 5,000  D11  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  28％w/vPEG MME 2,000  D12  0.2M氯化钙  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  45％v/v2-甲基-2，4戊二醇  E1  0.2M氯化钙  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  45％v/v2-甲基-2，4戊二醇  E2  0.2M醋酸铵  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  45％v/v2-甲基-2，4戊二醇  E3  0.2M醋酸铵  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  45％v/v2-甲基-2，4戊二醇  E4  0.2M醋酸铵  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  45％v/v2-甲基-2，4戊二醇  E5  0.2M醋酸铵  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  45％v/v2-甲基-2，4戊二醇  E6  0.05M氯化钙  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  30％v/vPEG MME 550  E7  0.05M六水氯化镁  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  30％v/vPEG MME 550

  序号盐  缓冲液  pH  沉淀剂E80.2M氯化钾  0.05M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸7.535％v/v季戊四醇丙氧酸  E9  0.05M硫酸铵  0.05M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  30％v/v季戊四醇乙氧酸  E10  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  45％v/v聚丙二醇P 400  E11  0.02M六水氯化镁  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  22％w/v聚丙烯酸钠5,100E120.01M六水氯化钴0.1M三羟甲基氨基甲烷8.5  20％w/v聚乙烯吡咯烷酮K15  F1  0.2M L-脯氨酸  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  10％w/vPEG 3,350  F2  0.2M二水氧化三甲胺  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  20％w/vPEG MME 2,000F3  5％v/vTacsimate  pH7.00.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸7.010％w/vPEG MME 5,000  F4  0.005M六水氯化钴  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  12％w/vPEG 3,350  0.005M六水氯化镍

  序号盐  缓冲液  pH  沉淀剂  0.005M氯化镉  0.005M六水氯化镁  F5  0.1M醋酸铵  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  17％w/vPEG 10,000  F6  0.2M硫酸铵  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  25％w/vPEG 3,350  F7  0.2M硫酸铵  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  25％w/vPEG 3,350  F8  0.2M硫酸铵  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  25％w/vPEG 3,350  F9  0.2M硫酸铵  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  25％w/vPEG 3,350  F10  0.2M氯化钠  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  25％w/vPEG 3,350  F11  0.2M氯化钠  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  25％w/vPEG 3,350  F12  0.2M氯化钠  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  25％w/vPEG 3.350  G1  0.2M氯化钠  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  25％w/vPEG 3,350  G2  0.2M一水硫酸锂  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  25％w/vPEG 3,350

  序号盐  缓冲液  pH  沉淀剂  G3  0.2M一水硫酸锂  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  25％w/vPEG 3,350  G4  0.2M一水硫酸锂  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  25％w/vPEG 3,350  G5  0.2M一水硫酸锂  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  25％w/vPEG 3,350  G6  0.2M醋酸铵  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  25％w/vPEG 3,350  G7  0.2M醋酸铵  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  25％w/vPEG 3,350  G8  0.2M醋酸铵  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  25％w/vPEG 3,350  G9  0.2M醋酸铵  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  25％w/vPEG 3,350  G10  0.2M六水氯化镁  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  5.5  25％w/vPEG 3,350  G11  0.2M六水氯化镁  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  6.5  25％w/vPEG 3,350  G12  0.2M六水氯化镁  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  7.5  25％w/vPEG 3,350  H1  0.2M六水氯化镁  0.1M三羟甲基氨基甲烷  8.5  25％w/vPEG 3,350  H2  0.2M酒石酸钾钠  20％w/vPEG 3,350

  序号盐  缓冲液  pH  沉淀剂  H3  0.2M丙二酸钠pH 7.0  20％w/vPEG 3,350H4  0.2M柠檬酸三铵pH7.020％w/vPEG 3,350  H5  0.1M丁二酸pH 7.0  15％w/vPEG 3,350  H6  0.2M甲酸钠  20％w/vPEG 3,350H7  0.15M DL-2-羟基丁二酸pH 7.020％w/vPEG 3,350  H8  0.1M甲酸镁  15％w/vPEG 3,350  H9  0.05M二水醋酸锌  20％w/vPEG 3,350  H10  0.2M柠檬酸三钠  20％w/vPEG 3,350  H11  0.1M硫腈酸钾  30％w/vPEG MME 2,000  H12  0.15M溴化钾  30％w/vPEG MME 2,000

文献1“Cycling Temperature Strategy：A Method to Improve the Efficiency ofCrystallization Condition Screening of Proteins，Crystal Growth&Design，2008，8(12)：4227-4232”公开了采用上述Index^TM的96条件筛选试剂盒对溶菌酶、刀豆球蛋白、蛋白酶K、过氧化氢酶、α-糜蛋白酶原、竹与蛋白等几种蛋白进行了结晶条件筛选研究，统计出其成功率分别为：29.2％、4.2％、58.3％、15.6％、26.0％、3.1％。

但是Index^TM的局限在于所用沉淀剂都是随机选取，无针对性，对蛋白质结晶的成功率还有待提高；而且所用试剂种类较多，成本较高。

发明内容

为了克服现有的96条件筛选试剂盒在蛋白质结晶条件筛选中成功率低的不足，本发明提供一种以聚乙二醇作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选96条件试剂盒，可以提高蛋白质结晶条件筛选成功率。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：一种以聚乙二醇为基础的96条件生物大分子结晶筛选试剂盒，其特点是成分组成如下表：

  序号  缓冲液  pH  沉淀剂  添加剂  A1  0.1M乙酸钠  pH 4.6  20％PEG4000  0.1M硫酸铵  A6  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  25％PEG4000  10％v/v  乙二醇  A7  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  25％PEG4000  10％v/v异丙醇  A8  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  25％PEG4000  0.1M丙二酸钠  A9  0.1M乙酸钠  pH 4.6  30％PEG4000  0.1M甘氨酸  A10  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  30％PEG4000  0.1M酒石酸钾钠  A11  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  30％PEG4000  0.01M  乙二胺四乙酸  A12  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  30％PEG4000  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  B1  0.1M乙酸钠  pH 4.6  10％PEG8000  0.1M硫酸铵  B2  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  10％PEG8000  0.1M  甲酸钠  B3  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  10％PEG8000  0.1M氯化镁  B4  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  10％PEG8000  0.1M丙二酸钠  B5  0.1M乙酸钠  pH 4.6  15％PEG8000  10％v/v 2-甲基-2，4戊二醇

  序号  缓冲液  pH  沉淀剂  添加剂  B6  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  15％PEG8000  10％v/v  乙二醇  B7  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  15％PEG8000  10％v/v异丙醇  B8  0.1M  N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  15％PEG8000  0.1M丙二酸钠  B9  0.1M乙酸钠  pH 4.6  20％PEG8000  0.1M甘氨酸  B10  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  20％PEG8000  0.1M酒石酸钾钠  B11  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  20％PEG8000  0.01M乙二胺四乙酸  B12  0.1M  N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  20％PEG8000  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  C1  0.1M乙酸钠  pH 4.6  10％PEG6000  0.1M硫酸铵  C2  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  10％PEG6000  0.1M  甲酸钠  C3  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  10％PEG6000  0.1M氯化镁  C4  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  10％PEG6000  0.1M丙二酸钠  C5  0.1M乙酸钠  pH 4.6  15％PEG6000  10％v/v 2-甲基-2，4戊二醇  C6  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  15％PEG6000  10％v/v  乙二醇

  序号  缓冲液  pH  沉淀剂  添加剂  C7  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  15％PEG6000  10％v/v异丙醇  C8  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  15％PEG6000  0.1M丙二酸钠  C9  0.1M乙酸钠  pH 4.6  20％PEG6000  0.1M甘氨酸  C10  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  20％PEG6000  0.1M酒石酸钾钠  C11  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 65  20％PEG6000  0.01M  乙二胺四乙酸  C12  0.1M  N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  20％PEG6000  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  D1  0.1M乙酸钠  pH 4.6  20％PEG3350  0.1M硫酸铵  D2  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  20％PEG3350  0.1M  甲酸钠  D3  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  20％PEG3350  0.1M氯化镁  D4  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  20％PEG3350  0.1M  丙二酸钠  D5  0.1M乙酸钠  pH 4.6  25％PEG3350  10％v/v 2-甲基-2，4戊二醇  D6  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  25％PEG3350  10％v/v  乙二醇

  序号  缓冲液  pH  沉淀剂  添加剂  D7  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  25％PEG3350  10％v/v异丙醇  D8  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  25％PEG3350  0.1M丙二酸钠  D9  0.1M乙酸钠  pH 4.6  30％PEG3350  0.1M甘氨酸  D10  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  30％PEG3350  0.1M酒石酸钾钠  D11  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  30％PEG3350  0.01M乙二胺四乙酸  D12  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  30％PEG3350  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  E1  0.1M乙酸钠  pH 4.6  15％PEG400  0.1M硫酸铵  E2  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  15％PEG400  0.1M  甲酸钠  E3  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  15％PEG400  0.1M氯化镁  E4  0.1M  N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  15％PEG400  0.1M丙二酸钠  E5  0.1M乙酸钠  pH 4.6  20％PEG400  10％v/v 2-甲基-2，4戊二醇  E6  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  20％PEG400  10％v/v  乙二醇  E7  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  20％PEG400  10％v/v异丙醇

  序号  缓冲液  pH  沉淀剂  添加剂  E8  0.1M  N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  20％PEG400  0.1M丙二酸钠  E9  0.1M乙酸钠  pH 4.6  25％PEG400  0.1M  甘氨酸  E10  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  25％PEG400  0.1M酒石酸钾钠  E11  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  25％PEG400  0.01M乙二胺四乙酸  E12  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  25％PEG400  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  F1  0.1M乙酸钠  pH 4.6  15％PEG1000  0.1M硫酸铵  F2  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  15％PEG1000  0.1M  甲酸钠  F3  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  15％PEG1000  0.1M氯化镁  F4  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  15％PEG1000  0.1M  丙二酸钠  F5  0.1M乙酸钠  pH 4.6  20％PEG1000  10％v/v 2-甲基-2，4戊二醇  F6  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  20％PEG1000  10％v/v  乙二醇  F7  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  20％PEG1000  10％v/v异丙醇  F8  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  20％PEG1000  0.1M  丙二酸钠

  序号  缓冲液  pH  沉淀剂  添加剂  F9  0.1M乙酸钠  pH 4.6  25％PEG1000  0.1M甘氨酸  F10  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  25％PEG1000  0.1M酒石酸钾钠  F11  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  25％PEG1000  0.01M乙二胺四乙酸  F12  0.1M  N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  25％PEG1000  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  G1  0.1M乙酸钠  pH 4.6  10％PEG2000  0.1M硫酸铵  G2  0.1M柠檬酸钠  PH5.6  10％PEG2000  0.1M  甲酸钠  G3  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  10％PEG2000  0.1M氯化镁  G4  0.1M  N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  10％PEG2000  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  G5  0.1M乙酸钠  pH 4.6  15％PEG2000  10％v/v 2-甲基-2，4戊二醇  G6  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  15％PEG2000  10％v/v  乙二醇  G7  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  15％PEG2000  10％v/v异丙醇  G8  0.1M  N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  15％PEG2000  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  G9  0.1M乙酸钠  pH 4.6  20％PEG2000  0.1M甘氨酸

  序号  缓冲液  pH  沉淀剂  添加剂  G10  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  20％PEG2000  0.1M酒石酸钾钠  G11  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  20％PEG2000  0.01M乙二胺四乙酸  G12  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  20％PEG2000  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  H1  0.1M乙酸钠  pH 4.6  15％PEG1500  0.1M硫酸铵  H2  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  15％PEG1500  0.1M  甲酸钠  H3  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  15％PEG1500  0.1M氯化镁  H4  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  15％PEG1500  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  H5  0.1M乙酸钠  pH 4.6  20％PEG1500  10％v/v 2-甲基-2，4戊二醇  H6  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  20％PEG1500  10％v/v  乙二醇  H7  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  20％PEG1500  10％v/v异丙醇  H8  0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  20％PEG1500  10％v/v  Tacsimate PH 7.0  H9  0.1M乙酸钠  pH 4.6  25％PEG1500  0.1M甘氨酸  H10  0.1M柠檬酸钠  PH 5.6  25％PEG1500  0.1M酒石酸钾钠

  序号  缓冲液  pH  沉淀剂  添加剂  H11  0.1M 2，2-双二羟甲基苯胺  PH 6.5  25％PEG1500  0.01M  乙二胺四乙酸  H12  0.1M  N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸  PH 7.5  25％PEG1500  10％v/v  Tacsimate PH 7.0

所述沉淀是PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG3350、PEG400、PEG1000、PEG2000或PEG1500任一种。浓度为10％～30％v/v。

所述添加剂是硫酸铵、甲酸钠、氯化镁、丙二酸钠、2-甲基-2，4戊二醇、乙二醇、异丙醇、Tacsimate PH 7.0、甘氨酸、酒石酸钾钠或乙二胺四乙酸任一种。其浓度为0.1M。

所述缓冲液是乙酸钠、柠檬酸钠、2，2-双二羟甲基苯胺或N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸。浓度为0.1M。pH值范围从4到8。

本发明的有益效果是：①本试剂盒所选沉淀剂是BMCD数据库中统计出的使用频率最高的前8种PEG，不是随机选取，所以会显著提高生物大分子结晶的成功率，比如刀豆球蛋白的成功率从4.2％提高到81.2％，溶菌酶的成功率从29.2％提高到46.9％，蛋白酶K的成功率从58.3％提高到66.7％，过氧化氢酶的成功率从15.6％提高到30.2％。②本试剂盒只用了8种PEG，11种添加剂，4种缓冲液，所用试剂种类较少，而且浓度相对较低，所以相对背景技术试剂盒成本较低，有商业推广价值。

具体实施方式

配制PEG Grid Screen96筛选条件：以Al(0.1M的PH4.6的三水醋酸钠、20％的PEG4000、0.1M硫酸铵)为例：第一步：配好浓度为0.1M，PH4.6的醋酸钠缓冲液；第二步：称好PEG4000和硫酸铵(假如配制体积为50ml)至50ml烧杯中，加入配制好的醋酸钠缓冲液，使其溶解后置50ml容量瓶中定容；第三步：将定容好的溶液用滤膜过滤到50ml的管中，A1条件配制完毕。同样的方法配制其他条件。下面用几种蛋白质的结晶实验来验证该试剂盒的效果。

实施例1：用上述配制的PEG Grid Screen96条件对刀豆球蛋白(ConcanavalinA)进行条件筛选。

第一步：将美国Sigma公司的货号为L7647的刀豆球蛋白，溶于pH为7.0，浓度为0.025mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-Na缓冲液中，配制成浓度为20mg/ml的刀豆球蛋白溶液，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：用上述96条件对刀豆球蛋白结晶条件进行筛选。

第三步：使用坐滴板，每深孔中加入90μl的池液，使用自动移液系统将1μl筛选结晶剂和1μl蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。

第四步：上述结晶溶液体系在20℃温控箱中放置7天后，利用自动显微拍照系统观察并统计出现刀豆球蛋白晶体的条件数目。

经过统计得到结果如下：刀豆球蛋白结晶的成功率为81.2％，与文献1相比其成功率提高了77.0％，有大幅提高。

实施例2：用上述配制的PEG Grid Screen96条件对溶菌酶(lysozyme)进行条件筛选。

第一步：将经过六次重结晶的日本Seikagaku公司的货号为100940的溶菌酶，溶于pH为7.0，浓度为0.025mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-Na缓冲液中，配制成浓度为40mg/ml的溶菌酶溶液，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：用上述96条件对溶菌酶结晶条件进行筛选。

第三步：使用坐滴板，每深孔中加入90μl的池液，使用自动移液系统将1μl筛选结晶剂和1μl蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。

第四步：上述结晶溶液体系在20℃温控箱中放置7天后，利用自动显微拍照系统观察并统计出现溶菌酶晶体的条件数目。

经过统计得到结果如下：溶菌酶结晶的成功率为46.9％，与文献1相比其成功率提高了17.7％，有显著提高。

实施例3：用上述配制的PEG Grid Screen96条件对蛋白酶K(proteinase K)进行条件筛选。

第一步：将美国Sigma公司的货号为P6556的蛋白酶K，溶于pH为7.0，浓度为0.025mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-Na缓冲液中，配制成浓度为30mg/ml的蛋白酶K溶液，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：用上述96条件对蛋白酶K结晶条件进行筛选。

第三步：使用坐滴板，每深孔中加入90μl的池液，使用自动移液系统将1μl筛选结晶剂和1μl蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。

第四步：上述结晶溶液体系在20℃温控箱中放置7天后，利用自动显微拍照系统观察并统计出现蛋白酶K晶体的条件数目。

经过统计得到结果如下：蛋白酶K结晶的成功率为66.7％，与文献1相比其成功率提高了8.4％，有显著提高。

实施例4：用上述配制的PEG Grid Screen96条件对过氧化氢酶(Catalase)进行条件筛选。

第一步：将美国Sigma公司货号为C0615的过氧化氢酶，溶于pH为7.00，浓度为0.025mol/L N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-Na缓冲液中，配制成浓度为20mg/ml的过氧化氢酶溶液，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：用上述96条件对过氧化氢酶结晶条件进行筛选。

第三步：使用坐滴板，每深孔中加入90μl的池液，使用自动移液系统将1μl筛选结晶剂和1μl蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。

第四步：上述结晶溶液体系在20℃温控箱中放置7天后，利用自动显微拍照系统观察并统计出现过氧化氢酶晶体的条件数目。

经过统计得到结果如下：过氧化氢酶结晶的成功率为30.2％，与文献1相比其成功率提高了14.6％，有显著提高。

除上述的实施例外，本发明方法也用于竹与蛋白、核糖核酸酶A、乳白蛋白、糜蛋白酶以及糜蛋白酶原等结晶条件的筛选，得到的蛋白质结晶筛选成功率也有显著提高。