一种油菜光周期敏感细胞核雄性不育系的选育方法及应用

摘要

本发明公开了一种油菜光周期敏感细胞核雄性不育系的选育方法，利用甘蓝型油菜光敏不育系汇油50S(CCTCC No：P201004)和其他优良品种或材料进行杂交，由衍生后代中分离出的光敏不育株选育而成优良不育系。该油菜光周期敏感细胞核雄性不育系可用于生产两系杂交种，简化育种程序，提高育种效率。

说明书

技术领域

本发明属于农作物杂种优势利用领域，涉及油菜不育系的选育方法，特别是一种油菜光周期敏感细胞核雄性不育系的选育方法及应用。

背景技术

作物雄性不育是利用其植物杂种优势、获得高产、抗病、优质作物产品的重要途径。很多雄性不育对环境变化比较敏感，例如油菜中的polimaCMS、nap CMS以及国内报道的AB1、501-8S、533S等属于对温度敏感的细胞质不育。另外许多细胞核不育也对环境敏感(Virmani SS and Ilyas AM.2001.Environment sensitive genic male sterility(EGMS)in crops.Advances inAgronomy 72：139-195)，现在常称为光、温敏核不育，实践中又根据不同不育系对光、温敏感程度的主次不同，划分为温敏(为主)核不育TMS、光敏(为主)核不育PMS、光温敏核不育PTMS(卢兴桂.两系杂交水稻理论与技术，科学出版社，2001)。有意思的是，有些光、温敏核不育在不同遗传背景下可能表现不同，比如国内不同单位利用粳稻光敏不育系农垦58S，转育出了一大批光敏核不育、温敏核不育和光温敏核不育系。例如四川农业大学用农垦58S转育而成籼稻不育系2558S、2877S、8902S和W6154S，发现2558S是可育临界温度低的温敏系，2877S是和农垦58S类似临界温度较低的光敏系，8902S是临界温度较高的光敏系，W6154S是临界温度高的温敏系(邓晓建，周开达，李仁端.农垦58S转育的四个籼型光温敏核不育系的不育性遗传研究.四川农业大学学报，1994年第2期)。

相对于细胞质不育系，油菜光、温敏核不育用于两系法杂交制种的优势更明显：(1)一般为隐性核基因控制，可以通过杂交、回交，把不育基因转入到任何一个目标品种或自交系，选育成优良的新型不育系；(2)其他品种一般都可用作恢复系，故可以广泛配制杂交组合，具有更高的产量潜力；(3)省略保持系，制种程序简化；(4)无细胞质负效应，避免利用单一细胞质造成的流行病害大发生(例如玉米T型CMS对小斑病敏感)。

目前甘蓝型油菜当中发现的有温敏核不育、光温敏核不育材料，都表现为在低温、短日照条件下雄性可育，在高温、长日照条件下雄性不育，其相关文献如下：

【1】湖南省农科院育成的温敏核不育湘91S，是从86A与其它品种复合杂交后代中发现的，受2～4对隐性不育基因及1～3对温敏基因控制(席代汶等，湖南农业科学，1994(4)：17-18)。湘91S在和中双4号杂交改良时，F₂代2472株才能分离出3株温敏不育株和7株稳定不育株(邬贤梦等，中国油料作物学报，2005(3)：74-76)；

【2】贵州油料科学研究所育成的光温敏核不育H90S，是从中油821的天然雄性不育株而来，育性由3对隐性基因控制，和117A、S45A不同(赵继献等，中国油料作物学报，2001(4)：11-15)；

【3】江西宜春农科所选育的光温敏核不育N196S，遗传及生理特点不明确(刘尊文等，江西农业大学学报.2006，28(5)：654-656)；

【4】西北农林科技大学报道的不育系373S对温度等环境因素敏感，正在进行品质改良(于澄宇等，中国农学通报2007，(7)：255-258)。

而油菜光敏不育系及其光反应生理、遗传特征目前还没有文献报导。杨光圣等(油菜光敏感雄性不育系及其杂交种选育方法，专利申请号01106599.0)公开了光敏不育系PSMS₂₂₈理论应用方案，但其所用材料来源、遗传规律、生理特征没有具体文献报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种新的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系的选育方法，并提供在该油菜光周期敏感细胞核雄性不育系杂在交油菜制种中的应用。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术措施得以实现：

一种油菜光周期敏感细胞核雄性不育系的选育方法，其特征在于，该方法选用甘蓝型油菜光敏不育系汇油50S作为供体材料，和其他优良品种或育种材料进行杂交、复合杂交、或者回交，在衍生后代中选择对光照(光周期)敏感的不育株，并经过一定的育种程序进行纯化，结合育性鉴定、品质分析，使得性状稳定，选育而成的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系的基本特征为：育性遗传受细胞核基因控制，主要对光周期敏感，即随着气候从短日照向长日照变化，育性从可育转变为半不育，直至完全不育。

上述的甘蓝型油菜光敏不育系汇油50S，申请人已经于2010年3月22日收藏于中国典型培养物保藏中心(保藏号CCTCC No：P201004)。

具体选育过程是：将甘蓝型油菜光敏不育系汇油50S和其他优良油菜品种或育种材料进行授粉，形成杂交F₁代，F₁代自交产生F₂代、F₂代自交产生F₃代，以此类推，在F₂、F₃代等衍生后代中选择对光照敏感的不育株，进行品质测试，选择低芥酸、低硫甙株系，再经过连续自交纯化，或者运用小孢子培养和单倍体加倍技术，使得不育基因纯合，其它性状比较稳定，就选育出油菜光周期敏感细胞核雄性不育系。

或者通过如下过程进行选育：将杂交F₁以及在F₂、F₃代等衍生后代中分离出的光照敏感不育株，再次和亲本优良品种或育种材料回交，自交分离不育株，进行品质测试，选择低芥酸、低硫甙株系，如此重复回交1-6次，对后代中分离出的光照敏感不育株，再自交纯化若干世代以上，或者运用小孢子培养和单倍体加倍技术，使得不育基因纯合，其它性状比较稳定，就能够选育成和亲本优良品种或育种材料比较相似的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系。

或者通过如下过程进行选育：将权利要求3所述杂交F₁以及在F₂、F₃代等衍生后代中分离出的光照敏感不育株，再次和另外一个优良品种或育种材料杂交，形成复合杂交，对后代中分离出的不育株再次进行选择，选择对光照等敏感的植株，进行品质测试，选择低芥酸、低硫甙株系，再自交纯化若干世代以上，或者运用小孢子培养和单倍体加倍技术，使得不育基因纯合，其它性状比较稳定，就能够选育成符合育种目标的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系。

所述的育性鉴定具体方法为：把得到的光敏不育株及其衍生不育群体分别置于至少两种不同的环境A、环境B条件下，两种不同环境的温度、光谱范围和光照强度应满足油菜正常发育的生理需求；其中环境A为短光周期环境，每日日照时数为5小时～12.5小时，优选为8～11小时；环境B为长光周期环境，每日日照时数12.5～24小时，优选为13～16小时；两种环境温度范围为8～30摄氏度，最好在15～25摄氏度；对处在环境A下育性可以部分或完全恢复的单株，自交结实繁殖种子；然后对那些处在环境B下表现可育或者部分可育的材料进行淘汰，而对处在环境B下表现为稳定雄性不育的单株或株系，作为符合育性要求的光敏核不育材料，继续繁衍其在环境A下所获得的种子。

本发明的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系在短光周期环境下进行自交繁殖，在长光周期环境下和恢复系杂交生产两系杂交油菜的应用。

本发明选育的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系一系两用：即秋播自交繁种，春、夏播杂交制种；秋播使不育系次年蕾苔期至开花期处在春季相对短光周期的气候条件下，育性恢复而自交繁殖；春播或夏播，使不育系蕾苔期至开花期处在夏季相对长光周期的环境条件下，保持稳定的不育状态，然后再和其它能够恢复其育性的品种自交系或材料杂交，配制杂交种。

本发明获得的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系与其他雄性不育类型相比，具有以下明显的特点：

(1)遗传方式比较简单，申请人在“汇油50S”杂交改良过程中发现，F₂代环境敏感不育株出现机率很高，一般达到5％～15％，而且F₂代可育株当中还存在大量不育基因位点杂合的个体，经过自交即可分离出环境敏感不育株。所以容易筛选到与农艺性状、品质性状优良基因重组的环境敏感不育株，也容易利用DNA分子标记等遗传标记检测基因型。可以缩小群体规模，简化育种程序，容易杂交改良成新的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系；

(2)与细胞质雄性不育和一般细胞核不育相比，可以简化杂交制种程序，省略用保持系繁殖不育系或者拔除母本可育株的环节，实现一系两用，例如在南方冬油菜种植区秋播，次年春季短光周条件下，不育系育性得以恢复而自交繁殖，而在甘肃、青海、内蒙、云贵高原等地春夏播，不育系处于夏季长光周期条件下，获得全不育系，用以配制杂交种。

附图说明

图1是甘蓝型油菜光敏不育系汇油50S的不育花S、半不育PS花、可育花F。“汇油50S”的雌蕊较一般品种长，不易自交结实。

图2是甘蓝型油菜光敏不育系汇油50S小孢子败育的细胞学特点图片。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

甘蓝型油菜品种汇油50(原名为77-50)是南汇县农科所于1975年以7401为母本，白菜型本地油菜为父本杂交选育而成的半冬性中熟品种。申请人1999年发现在引进的汇油50中一个株系1035-6后代结实性低于其它株系，2000年再次发现从该株系收获的株系477-1仍然表现自交结实性较低，此后便用477-1连续自交，于2007年育成甘蓝型油菜光敏不育系汇油50S(以下简称“汇油50S”)，并于2010年3月22日收藏于中国典型培养物保藏中心(保藏号CCTCC No：P201004)。通过连年育性观察，发现“汇油50S”在陕西杨凌秋播种植，次年初花期一般可育或者半不育，随后逐渐向不育过渡，受4月初日照超过12.5h的影响，所开的花达到完全不育。经多年大田分期播种和人工环境鉴定，确认“汇油50S”属于以光敏为主的隐性细胞核不育，温度效应很微弱。不同纬度的异地鉴定试验表明：“汇油50S”在陕西关中秋播可以少量自交繁殖；2008-2009年试验在南方(江苏扬州)秋播，“汇油50S”可以大量自交繁殖；2006-2007年在青海西宁春播，“汇油50S”花期表现全不育。细胞学观察发现“汇油50S”败育时期主要在花粉母细胞减数分裂-小孢子单核期。遗传分析表明育性受2对隐性细胞核不育基因控制。

可见光敏不育系“汇油50S”是一种与温敏不育系湘91S、光温敏不育系H90S等在光温反应、遗传规律方面不同的新型不育系。

但是，光敏不育系“汇油50S”的品质性状与高芥酸、高硫甙品种汇油50相似，不符合低芥酸(脂肪酸中芥酸小于1％)、低硫甙(饼粕中硫甙葡萄糖含量小于30μmol/g)的双低油菜国家标准要求，且含油量较低，需要加以改良才能应用于农业生产。为了利用这一遗传资源，本发明提出了对其进行改良、选育新型的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系方法，及其利用该油菜光周期敏感细胞核雄性不育系配制杂交种的应用。

本发明的油菜光(周期)敏感细胞核雄性不育系选育的基本思路是：

1、利用杂交、回交、复交育种手段选育新的油菜环境敏感细胞核雄性不育系，包括如下基本步骤：

选用甘蓝型油菜光敏不育系汇油50S(于2010年3月22日收藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：P201004)和其他优良品种或材料进行杂交，F₁自交得到F₂，F₂自交可得到F₃，以此类推，在F₂、F₃等世代中分离出对光照等生态因子敏感的不育株；

得到的不育株通过1个世代以上的自交得到纯化，也可以运用目前广泛应用的小孢子培养和单倍体加倍技术，直接得到纯合的双单倍体DH群体，加快育种进度。

有时出于育种家的需要，需要对不育系进行定向改良，所以“汇油50S”和其他优良品种或材料杂交的F₁以及F₂不育株也可以继续和优良亲本品种进行回交若干次，然后在后代中选择育性对光照等生态因子敏感的植株，再经过连续自交进行纯化，或者运用小孢子培养和单倍体加倍技术，使得不育基因纯合，其它性状比较稳定，就选育出农艺性状等和优良品种相似的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系。

或者，以“汇油50S”和其他优良品种或材料的杂交F₁以及F₂不育株也可以和第二个优良品种或育种材料杂交，形成育种学上所谓的复合杂交，然后在后代中选择育性对光照等生态因子敏感的植株，再经过连续自交进行纯化，或者运用小孢子培养和单倍体加倍技术，使得不育基因纯合，其它性状比较稳定，就选育出新型的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系。

2、光敏不育系的鉴定选择，须分别置于至少两种不同的环境A和环境B条件下。环境A为短光环境，每日日照时数5～12.5小时，考虑到最低要满足油菜光合作用需要，光周期可优选设置为8～11小时。B为相对长光环境，每日日照时数12.5～24小时，一般优选设置13～16小时即可满足需要。此外，两种环境的温度、光谱范围、光照强度应满足油菜正常发育生理需求。温度可以在8～30摄氏度，最好在15～25摄氏，光谱范围包含植物生长有效光区段，即波长400nm～700nm的蓝光～红光区，光照强度宜在2万～10万勒克斯之间(油菜叶片光饱和点为3万勒克斯左右)。

对处在环境A下育性可以部分或完全恢复的单株，自交结实繁殖种子；然后对那些处在环境B下育性仍然不稳定的材料进行淘汰，而对处在环境B下表现为稳定雄性不育的单株或株系，作为符合育性要求的环境敏感细胞核雄性不育材料，继续繁衍其在环境A下所获得的种子。

这两种环境条件的实现可以通过室内人工控制；也可以采用异地种植实现(例如秋播油菜在次年春季开花时的气候属于环境A，而春、夏播油菜开花时候的气候为环境B)；还可以在同一地点分期播种，使油菜在不同季节开花，利用气候条件自然变化规律来实现(例如陕西关中，11月至次年3月底气候为环境A，4月中下旬至10月为环境B)。

3、选育的油菜光周期敏感细胞核雄性不育系主要目的是在杂交制种中实现“一系两用”，即在适宜地区适时播种，使得油菜光周期敏感细胞核雄性不育系在短光条件下，例如日照长度＜12小时，育性得以部分或全部恢复而自交繁殖；而将油菜光周期敏感细胞核雄性不育系在另外长光条件下，例如日照长度＞12.5小时，保持稳定不育性状，用于和其它品种自交系或材料杂交，配制杂交种。

油菜光周期敏感细胞核雄性不育系“一系两用”方法，在生产实践中可理解为“秋播自交繁种，春夏播杂交制种”。具体到不育系“汇油50S”及其衍生不育系，就是秋播使光敏不育系次年蕾苔期至开花期处在2月～4月初相对短光周期的气候条件下，育性恢复而自交繁殖；而春夏播，使不育系蕾苔期至开花期处在4月中旬～7月相对长光周期的环境条件下，保持稳定的不育状态，然后再和其它能够恢复其育性的品种自交系或材料杂交，配制杂交种。

以下以“汇油50S”的遗传、细胞学、光温反应、育种改良范例来体现用本发明方法所选育的新光周期敏感核不育系应该具有的与“汇油50S”相似的基本特征。

应用实例1：“汇油50S”的遗传测验与分析

用“汇油50S”与双隐性核不育117A衍生不育系配制的杂交种油研10号选系“油研10号S-1”、“油研10号S-2”进行杂交，测交世代育性没有分离(表1)。用另外一个得到广泛应用的三对隐性基因互作不育材料9012A选育的杂交种皖油14分离的不育系“Wan14A”作母本测交，F₁也表现为全可育(表1)，说明“汇油50S”光敏不育基因与117A、9012A的不育基因是非等位的。

表1.遗传等位性测验结果

  测交组合  不育株  可育株  油研10号S-1×汇油50S  0  25  油研10号S-2×汇油50S  0  59  Wan14A×汇油50S-1  0  127  Wan14A×汇油50S-2  0  99

“汇油50S”的遗传分析：用“汇油50S”与扬油4号、华双5号进行正反杂交，F₁可育，F₂代不育对可育株分离比接近1∶15，F₁与不育系回交BC₁代不育对可育分离比接近1∶3(表2)。而且分离世代的不育株都对环境敏感。推测“汇油50S”育性的遗传主要受2对隐性核不育基因控制。用“汇油50S”发现时原始育性分离群体477-1中的一个可育株“SPP1”与“汇油50S”杂交，后代呈1∶1分离，用分离出的可育株再与“汇油50S”回交，也呈1∶1分离，说明“SPP1”是其中一个位点杂合的基因型。

表2.杂交后代育性分离比例

另外，“汇油50S”与中双2号、扬油4号、华双4号、华双5号、优88、扬油6号、中双4号、中油220、中双6号、中油119、中9WH、9558、沪油15、沪油17、161C、宁油12、宁油14、川油18、川油20、Q6C、Q9C、y2、B11、Y4C、Q7C、Q8C、史力丰、苏油1号、苏油4号、红油3号、Solida、H15R、宁油16、宁油18、SP92R、Baros、Viking、浙双72、浙油18、浙油17、Mohican、Polo、Elect、Bronowski、Profit等45个品系测交当代完全可育，表明“汇油50S”及其衍生的光敏不育系具有广泛的恢复系来源，易于配制强优势杂交组合。

应用实例2：“汇油50S”育性鉴定

通过大田分期播种试验发现，“汇油50S”主要对开花前7～12天的光周期变化敏感，在3月20日春分之前形成的花蕾倾向于可育，在4月初日照长度大于12.5h，形成的花蕾倾向于不育。

因此，在2008/2009、2009/2010两个年度开展人工控制环境下盆栽试验鉴定：12月中旬将通过春化的不育系移栽室内，抽薹后设置2种温度条件，即高温24℃/16℃(昼/夜，下同)和低温16℃/8℃，分别用Philips Son-T400农用钠灯(比利时造，光强大于55000勒克斯)控制5种光周期条件：11h/13h(昼/夜，下同)、11.5h/12.5h、12h/12h、12.5h/11.5h、13h/11h。如此共有10个处理，每处理4-6株。对照为正常品种汇油50。

开花后调查计算育性指数MFI：按照油菜花6枚雄蕊中花丝伸长且花药膨大有花粉的雄蕊个数，将单花育性分为0、1、2、3、4、5、6共7级。单株MFI为当日开放花朵育性的加权平均值，群体MFI为群体中单株的育性加权平均值。

试验结果表明：不同处理下对照汇油50始终表现正常可育。而不育系“汇油50S”，无论在高温、低温情况，均表现为随着光周期延长，育性减弱，在11h/13h短光周期条件下恢复可育，11.5h/12.5h下为高度可育，12h/12h下为半不育，12.5h/11.5h为高度不育，而13h/11h长光周期条件处理下为完全不育。高温、低温处理比较，高温可加快油菜开花速度，低温抑制开花，但温度对最终育性的影响较小，不如光周期对“汇油50S”育性有决定性作用。

表3.不同光周期和温度处理下汇油50S的育性指数

  处理  低温16℃/8℃  高温24℃/16℃  11h/13h  5.32  5.47  11.5h/12.5h  4.23  4.05  12h/12h  2.65  2.42  12.5h/11.5h  0.21  0.26  13h/11h  0.00  0.00

另外尝试了变换光周期处理：先在11h/13h条件下处理，“汇油50S”可育，然后用13h/11h光周期条件处理，标记不同大小花蕾。结果从变换条件之后10日起向完全不育转变，此处花蕾在标记当时长度是2-3mm，这与败育发生在花粉母细胞减数分裂-小孢子单核期的观察结果一致。

综合分析，“汇油50S”的育性转换有决定性作用，而温度对育性的影响不明显，故“汇油50S”应当归类为光敏为主的不育系，即光敏核不育。

该结果还暗示，由于油菜是无限花序、株型高大(一般1.2～2.2米)、分枝多(5～13个)、开花时间长(22～35天)、开花数量多(300～500个)，光周期对不同时期、不同分枝、花序不同部位的花蕾发育影响可能有差异，所以不同花蕾在一定光周期范围内(11.5h～12.5h)育性有差异，只有在此范围之外，才能使不同部位花朵育性表现为比较一致的不育或可育。而不是像水稻等花期很短的作物那样可以用单一数值表示光周期临界点。

应用实例3：“汇油50S”败育过程的细胞学观察

将在温室13h/11h光周期条件下的“汇油50S”，取花药用醋酸洋红染色，在光学显微镜下观察，发现“汇油50S”花药前期(减数分裂中期见图2A)发育比较正常，“汇油50S”败育主要发生在花粉母细胞减数分裂末期-小孢子单核期，尤其畸形四分体较多(图2B、C、D)，最后形成破裂、空瘪、难以染色的空壳花粉(图2E)。通过常规石蜡切片苏木精染色，可见双核期绒毡层还比较完整(图2F)，花药发育后期绒毡层逐渐解体，花粉畸形空瘪，但是局部残留核物质还可以染色(图2G)，花粉囊变形(图2H)，用冬青油整体透明的花药也可见花药内部败育萎缩、花粉畸形(图2I)。

应用实例4：

新型不育系Z2-S选育过程：2004年以抗菌核病、杆硬抗倒伏、低芥酸、低硫甙品种中双2号作为母本，与“汇油50S”杂交，F₁代全可育。2006年F₁代自交得到F₂，种植4个株系，各有108、56、136、151个单株，分别出现7、7、4、11个光敏不育株。收获这些不育株以及74个农艺性状优良的可育单株，经过品质测试，发现低芥酸单株12个，但硫甙全部超过50μmol/g。继续种植并测试收获的种子，2008年在后代中发现一个双低不育株，2009年鉴定发现具有与“汇油50S”相同的光敏不育特征，初步育成双低光敏不育系Z2-S。其选育模式可以简单总结为：杂交→分离→筛选→自交→鉴定。

应用实例5：

新型不育系Z29-S选育过程：2004年以抗菌核病、抗倒伏、低芥酸、低硫甙品种中双2号作为母本，与“汇油50S”杂交，F₁代全可育。2006年直接用F₁与中双9号复交，在复交F₁代筛选到品质接近双低的单株5个，种植5个株系，2008年有2个株系07-37、07-36出现光敏不育株。继续种植，收获种子测试品质，2009年在07-37后代中发现2个双低不育株，对其中一个自交后代鉴定表明具有与“汇油50S”相同的光敏不育特征，表明初步得到双低光敏不育Z29-S株系。其选育模式可以简单总结为：杂交→复交→筛选→分离→自交→鉴定。