一种表达HBHA-IL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗

摘要

本发明公开了一种表达HBHA-IL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗，该疫苗是以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含HBHA-IL-12基因片段的表达载体。该重组耻垢分枝杆菌疫苗能够持续表达具有生物活性的HBHA-IL-12融合蛋白，诱导产生的IFN-γ能够有效清除小鼠体内感染的MTB。该疫苗集中了靶抗原和活载体的优势，可应用于MTB感染的治疗。

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种重组耻垢分枝杆菌(rM.S)疫苗，特别涉及一种表达HBHA-IL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗。

背景技术

1、迫切需要TB的治疗性疫苗

全球目前约1/3人口处于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tuberculosis，MTB)持续感染状态，5％～10％感染者有可能最终发展为活动性结核病(tuberculosis，TB)，并成为MTB感染的重要传染源。化学治疗是结核病的基本治疗方法，虽然部分活动性TB患者能够通过该方法治愈，但由于治疗时间长和副作用大，致使患者依从性差，并易导致耐药性和持续性感染的发生。因此迫切需要研发可缩短疗程、对耐药有效、兼顾治疗持续性感染的药物或治疗策略。

在抗结核药物的基础上，使用免疫调节药物，特别是治疗性疫苗具有较好的应用前景。该类疫苗主要用于已感染MTB的无症状携带者或是已发病的患者，可以根据各种需要进行组合和调整，以利打破免疫耐受，选择性地诱导人体的特异性和非特异性免疫应答，最终达到治疗的目的。目前国内外已报道的TB治疗性疫苗包括DNA疫苗、亚单位疫苗和重组活载体疫苗。DNA疫苗是目前研究较多的治疗性疫苗，但其存在的主要问题是：编码抗原比较单一，引发的免疫应答与MTB自然感染过程有很大差异，需要多次免疫接种，易引发免疫耐受和自身抗体的产生；亚单位疫苗在体内滞留时间短，难以引发长期有效的免疫应答；而活载体疫苗在刺激机体产生保护性免疫应答方面要优于其它基因工程疫苗，是治疗性疫苗研究的一个重要方向。

2、重组耻垢分枝杆菌可用于TB的治疗

目前常用的活疫苗载体主要包括分枝杆菌属、沙门菌、痘苗病毒等。使用分枝杆菌为载体的活疫苗具有以下优点：1)所表达的保护性抗原不需纯化，可直接用于免疫，免去了蛋白质处理的复杂过程；2)活疫苗可在体内长期存活并不断表达外源抗原，单次接种即可持续诱导对靶抗原的反应，维持机体的免疫应答；3)可根据需要对靶抗原进行修饰；4)分枝杆菌本身可作为一种强免疫佐剂，提高宿主的免疫力。

目前研究较多的分枝杆菌载体有卡介苗(BCG)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis，M.S)和母牛分枝杆菌等。由于BCG生长缓慢(增殖一代需10～16h)，细胞壁厚且富含脂质，对之进行基因操作比较困难，因此人们更加关注非致病分枝杆菌。M.S为无毒分枝杆菌，许多实验已证实应用于动物体内是安全的。在美国M.S作为疫苗佐剂已成功用于TB的预防和治疗，证明了M.S作为活载体疫苗的安全性和可靠性。另外，M.S生长速率比BCG快10倍，表达外源蛋白产量高，而且在M.S中表达的MTB相关蛋白与天然蛋白的生化及免疫学特性几乎完全一致。因此，重组耻垢分枝杆菌(Recombinant M.S，rM.S)活疫苗用于MTB感染的治疗，可以通过恢复保护性免疫，促进单核巨噬细胞产生更多的H₂O₂和NO，有效清除MTB，增强机体免疫应答能力；还可改变免疫应答的Th1/Th2模式，使免疫应答从Th2型向Th1型偏移，从而有助于机体免疫细胞杀灭MTB持留菌和耐药菌，缩短化疗疗程。

3、HBHA的免疫在治疗LTBI方面具有独特的优势

存在于MTB的表面蛋白-肝素结合血凝素蛋白(heparin-bingdinghemagglutinin，HBHA)是MTB分泌的一种黏附素，分子量为28kDa，主要表达于细菌表面，参与细胞间的相互作用。HBHA可通过其赖氨酸丰富的碳末端功能区与非吞噬细胞(如上皮细胞等)上含硫酸乙酰肝素的受体结合，从而介导肺结核和肺外播散性结核的发生。动物实验证明HBHA诱导的免疫应答不管是在感染早期还是晚期都具有保护作用，接种HBHA蛋白后可明显降低感染小鼠肺脏及脾脏荷菌数，且肺组织切片表明HBHA所诱导保护作用与BCG相当。

HBHA蛋白可通过MHC I或MHC II途径诱导多数潜伏感染患者(latenttuberculosis infection，LTBI)患者的CD4⁺、CD8⁺T细胞活化，产生特异性IFN-γ(IFN-γ是激活巨噬细胞抗MTB活性的中心活性因子，在MTB保护免疫过程中有举足轻重的作用)，并且IFN-γ量可达≥100pg/ml。活化的CD4⁺T细胞可通过产生特异性HBHA的IFN-γ激活感染的巨噬细胞途径而发挥杀菌作用，同时活化的CD4⁺T细胞可加速感染巨噬细胞发生凋亡，并以此途径杀灭胞内菌。HBHA诱导CD8⁺T淋巴细胞活化后，产生穿孔素、TNF-α及IFN-γ等细胞因子。CD8⁺T细胞一方面可通过这些因子发挥细胞毒作用，另一方面这些细胞因子可诱导感染巨噬细胞合成NO以杀灭胞内细菌，因此HBHA在治疗LTBI方面具有独特的优势。

虽然HBHA可诱导多数LTBI患者产生免疫应答，但HBHA只能诱导少数活动型TB患者产生低水平IFN-γ；所以有学者提出HBHA可以作为诊断抗原以区分活动型TB和LTBI。

4、IL-12用于TB的辅助治疗

IL-12在针对胞内菌的细胞免疫中起着关键作用，它可以诱导静止及活化的NK及T细胞产生IFN-γ，促进NK及T细胞的增殖，增强NK细胞的细胞毒作用，促使CTL细胞的成熟。此外，IL-12也可激活巨噬细胞，增强巨噬细胞对入侵MTB的杀伤作用，并已成功用于TB的辅助治疗。

虽然上述保护性抗原单独免疫后即可诱导产生有效的细胞免疫应答，但其对MTB感染的治疗效果仍有待进一步提高。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种表达HBHA-IL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗，该疫苗集中了靶抗原和活载体的优势，在引起免疫应答后能够有效清除MTB(M.tuberculosis，结核分枝杆菌)感染小鼠体内的细菌，是一种安全有效的TB(Tuberculosis，结核病)治疗疫苗。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种表达HBHA-IL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗，是以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含HBHA-IL-12基因片段的表达载体。

所述的HBHA-IL-12基因片段是通过酶切位点和linker I将HBHA基因与IL-12基因连接，所述的linker I序列如SEQ.ID.NO.4所示，HBHA基因如SEQ.ID.NO.1所示，IL-12基因为通过酶切位点和linker II将P40亚基基因与P35亚基基因连接，P40亚基基因如SEQ.ID.NO.2所示，P35亚基基因如SEQ.ID.NO.3所示，linker II序列如SEQ.ID.NO.5所示。

所述的包含HBHA-IL-12基因片段的表达载体是pSMT3-HBHA-IL-12。

所述的表达载体pSMT3-HBHA-IL-12是通过BamHI和HindIII酶切位点将表达载体pEGM-3zf-HBHA-IL-12中的HBHA-IL-12基因片段克隆到分支杆菌表达载体pSMT3而得到的。

所述的表达载体pEGM-3zf-HBHA-IL-12是通过Sph I和Hind III酶切位点将表达载体pEGM-3zf(+)-P35中的P35基因扩增片段克隆到表达载体pEGM-3zf-HBHA-P40而得到的。

所述的表达载体pEGM-3zf-HBHA-P40是通过Sph I和Hind III酶切位点将表达载体pEGM-3zf(+)-P40中的P40基因扩增片段克隆到表达载体pEGM-3zf(+)-HBHA而得到的。

所述的外源性表达载体通过电穿孔法转化感受态的耻垢分枝杆菌，所述的电穿孔法涉及的参数为：0.4cm的电穿孔杯，电压2.5KV，电容25uF，电阻1000Ω。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明提供的表达HBHA-IL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗，以耻垢分枝杆菌作为宿主细胞，构建的外源表达载体pSMT3-HBHA-IL-12得到表达后，能够持续表达具有生物活性的HBHA-IL-12融合蛋白。

连续传代培养监测HBHA-IL-12-rM.S的生长曲线和HBHA-IL-12的表达，结果表明其生长曲线稳定，第1、4、8、10代表达的HBHA-IL-12融合蛋白分别与HBHA单抗和人IL-12抗体具有反应。

2、本发明利用rM.S疫苗治疗结核病疫苗的独特之处在于，该疫苗集中了靶抗原和活载体的优势，表达的HBHA-IL-12融合蛋白可有效提高单个优势抗原的治疗效果，具有明显的协同和增强作用；将该疫苗其用于MTB感染的治疗，可在体内诱导强烈的细胞免疫应答，从而达到清除体内MTB的目的。

HBHA能够在激活免疫细胞后特异性的产生激活巨噬细胞抗MTB活性的中心活性因子IFN-γ，而IL-12在针对胞内菌的细胞免疫中起着关键作用，它可以诱导静止及活化的NK及T细胞产生IFN-γ；接种疫苗组诱发的IFN-γ的水平为1827±245pg/ml，显著高于M.S组的1335±180pg/ml，两者均高于生理盐水组357±75pg/ml。

在该疫苗接种MTB感染的小鼠后，与生理盐水组和M.S免疫组相比，可有效清除MTB的感染，有效降低脾脏荷菌数，其脾脏荷菌对数值为4.83±0.30(P＜0.05)，明显少于M.S免疫组脾脏荷菌对数值为5.38±0.20，生理盐水治疗组为6.63±0.27，从而可用于MTB感染的治疗。

3、本发明提供的表达HBHA-IL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗，是一种重组M.S疫苗，具有较高的安全性，其安全性验证表明免疫后小鼠的脾脏、肺脏无变化。

附图说明

图1是PCR扩增的HBHA基因和IL-12基因片段(包括P40亚基基因片段、P35亚基基因上游片段和P35亚基基因下游片段)的电泳检测结果图；

图2是构建pEGM-3zf-HBHA-IL12表达载体以及各个中间载体酶切鉴定结果图；

图3是pSMT3-HBHA-IL12表达载体的酶切鉴定结果图；

图4是HBHA-IL-12-rM.S菌株PCR扩增产物电泳鉴定结果；图a为HBHA基因扩增后的电泳鉴定结果，图b为IL-12基因扩增后的电泳鉴定结果；

图5是HBHA-IL-12-rM.S菌株裂菌后分离的上清的Western-blot检测结果；

图6是HBHA-IL-12-rM.S菌株与抗IL-12单抗和抗HBHA单抗的免疫荧光结果；其中，图a为抗IL-12单抗的免疫荧光结果，图b为抗IL-12单抗的免疫荧光结果；

图7是HBHA-IL-12-rM.S菌株与M.S菌株的生长曲线比较图；

图8是HBHA-IL-12-rM.S菌株免疫小鼠后诱导的IFN-γ水平分析结果图；

图9是HBHA-IL-12-rM.S菌株连续传代后分泌的HBHA-IL-12融合蛋白与HBHA单抗的Western-blot结果；

图10a是HBHA-IL-12-rM.S免疫小鼠8周后肺脏组织切病理片结果；图10b是HBHA-IL-12-rM.S免疫小鼠8周后脾脏组织病理切片结果。

具体实施方式

本发明提供一种表达HBHA-IL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗，在构建外源性表达载体pSMT3-HBHA-IL-12的基础上，将其转染转染耻垢分枝杆菌制备重组M.S，经过抗性筛选得到HBHA-IL-12-rM.S；并对目的基因的表达和HBHA-IL-12-rM.S的免疫效果进行验证，结果表明该疫苗能够用于MTB感染的治疗。下面结合附图对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、HBHA基因的克隆

以MTB H37Rv DNA为模板PCR克隆HBHA基因，扩增引物设计如下：

上游引物P1：gcggatccat ggctgaaaac tcgaacattg    30；

下游引物P2：atgtcgacct tctgggtgac cttcttg       27；

上游引物P1引入了BamHI酶切位点ggatcc，下游引物P2引入了Sal I酶切位点gtcgac，并去掉终止码；PCR反应体系为：DNA模板1μl，P1、P2引物各1μl，Ex Buffer 5μl，Ex Taq酶1μl，dNTP 4μl，ddH₂O 37μl。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃45s，56℃45s，72℃50s，共30个循环；最后再于72℃延伸10min。

凝胶纯化回收PCR产物，扩增的HBHA基因片段的凝胶电泳结果如图1所示，其中，泳道1为Marker，泳道2为扩增的HBHA基因片段；将HBHA基因片段和pEGM-3zf(+)载体分别用BamH I/Sal I双酶切，然后T4连接酶将带有黏性末端的HBHA基因片段和pEGM-3zf(+)表达载体16℃连接过夜，构建中间载体pEGM-3zf(+)-HBHA；将pEGM-3zf(+)-HBHA转染E.Coli DH5α后，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取阳性克隆pEGM-3zf(+)-HBHA，提取质粒，将提取的质粒用BamH I和Sal I双酶切进行鉴定。鉴定结果如图2所示，其中泳道2中的小片段为双酶切获得的600bp HBHA目的基因片段。

将筛选出的阳性克隆进行测序分析(由北京奥科生物技术有限公司完成测序)，其中HBHA基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，与NCBIReference Sequence：NC_000962.2的序列比较，结果一致。

2、IL-12的P40、P35亚基及linker I结构的克隆

由于IL-12全长序列由987bp的P40亚基和762bp的P35亚基构成，在融合基因构建过程中，为了保证各自表达蛋白的正确折叠和独立空间构向，在HBHA与P40基因之间设立了48bp的linker I结构，在P40与P35亚基之间设立了30bp的linker II结构。同时考虑到基因克隆中需使用BamHI酶切位点，必须将P35亚基中已有的BamHI酶切位点定点突变。

2.1 IL-12的P40亚基和linker I的克隆

以人外周血淋巴细胞cDNA为模板，PCR克隆IL-12的P40亚基基因，扩增引物设计如下：

上游引物P3：

gcgtcgacgg tggctcaggt ggctccggtg gaggcggaag cggcggtgga ggatcaatgt 60；

gtcaccagca gttg                                                   74；

下游引物P4：atgcatgcac tgcagggcac agatgc                          26；

上游引物P3引入了Sal I酶切位点gtcgac，并引入48bp的linker I结构(linker I的序列如SEQ.ID.NO.4所示)，下游引物P4引入了Sph I酶切位点gcatgc，并去掉终止码；PCR反应体系为：DNA模板1μl，P3、P4引物各1μl，Ex Buffer 5μl，Ex Taq酶1μl，dNTP 4μl，ddH₂O 37μl。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃45s，56℃45s，72℃50s，共30个循环；最后再于72℃延伸10min。

凝胶纯化回收PCR产物，扩增的P40基因扩增片段(P40+linker I，1035bp)的凝胶电泳结果如图1所示，其中，泳道3为P40基因扩增片段。

将P40基因扩增片段和pEGM-3zf(+)体分别用Sal I/Sph I双酶切，然后T4连接酶将带有黏性末端的P40基因扩增片段和pEGM-3zf(+)表达载体16℃连接过夜，构建中间载体pEGM-3zf(+)-P40；将pEGM-3zf(+)-P40转染E.ColiDH5α后，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取阳性克隆pEGM-3zf(+)-P40，提取质粒，将提取的质粒用Sal I/Sph I双酶切进行鉴定。结果如图2所示，其中泳道3所示的小片段为双酶切获得的1035bp的P40基因扩增片段。

将筛选出的阳性克隆进行测序分析(由北京奥科生物技术有限公司完成测序)，其中P40基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，与NCBI ReferenceSequence：NC_000005.9公开的P40基因序列比较，扩增片段当中的P40基因序列一致。

将pEGM-3zf(+)-P40和pEGM-3zf(+)-HBHA分别用Sal I/Sph I双酶切，然后T4连接酶将带有黏性末端的P40基因扩增片段和pEGM-3zf(+)-HBHA表达载体16℃连接过夜，构建中间载体pEGM-3zf(+)-HBHA-P40；将pEGM-3zf(+)-HBHA-P40转染E.Coli DH5α后，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取阳性克隆pEGM-3zf(+)-HBHA-P40，提取质粒，将提取的质粒用Sal I/Sph I双酶切进行鉴定，观察到HBHA-P40目的片段。

由于P35亚基基因当中包含BamHI酶切位点，为了避免与以后的基因克隆就同一位点发生冲突，保证酶切位点的唯一性，因此对BamHI酶切位点进行PCR定点突变；以该位点为区分，将P35亚基基因分为上、下游两部分克隆，在克隆过程中完成定点突变。

2.2 IL-12的P35亚基上游片断及linker II结构的克隆

以人外周血淋巴细胞cDNA为模板，PCR克隆IL-12的P35亚基上游片断基因，扩增引物设计如下：

上游引物P5：

atgcatgcgt tcctggagta ggggtacctg gggtgggcat gtggccccct gggtcag  57；

下游引物P6：gggtccatca gaagttttgc attc                          24；

上游引物P5引入了Sph I酶切位点gcatgc，并引入30bp的linker II结构(linker II的序列如SEQ.ID.NO.2所示)，下游引物P6将序列中原有的BamHI酶切位点GGATCC突变为GGACCC(反义码为GGGTCC)。PCR反应体系为：DNA模板1μl，P5、P6引物各1μl，Ex Buffer 5μl，Ex Taq酶1μl，dNTP4μl，ddH₂O 37μl。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃45s，56℃45s，72℃50s，共30个循环；最后再于72℃延伸10min。

凝胶纯化回收PCR产物，P35上游基因扩增片段的凝胶电泳结果如图1所示，其中，泳道5为P35上游基因扩增片段(P35+linker II，578bp)。

2.3 IL-12的P35亚基下游片断的克隆

以人外周血淋巴细胞cDNA为模板，PCR克隆IL-12的P35亚基下游片断基因，扩增引物设计如下：

上游引物P7：caaaacttct gatggaccct aagaggc      27；

下游引物P8：gacaagcttt taggaagcat tcagatagc    29；

上游引物P7将序列中原有的BamHI酶切位点GGATCC突变为GGACCC，下游引物P8引入了Hind III酶切位点aagctt；PCR反应体系为：DNA模板1μl，P7、P8引物各1μl，Ex Buffer 5μl，Ex Taq酶1μl，dNTP 4μl，ddH₂O37μl。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃45s，56℃45s，72℃50s，共30个循环；最后再于72℃延伸10min。

凝胶纯化回收PCR产物，P35下游基因扩增片段的凝胶电泳结果如图1所示，其中，泳道4为P35下游基因扩增片段(214bp)。

2.4重叠PCR扩增P35亚基(包含linker II)

以P5、P8为引物，以扩增的P35上游基因扩增片段、P35下游基因扩增片段为模板，重叠PCR扩增完整P35亚基。PCR反应体系为：DNA模板1μl(上、下游片段各0.5μl)，P5、P8引物各1μl，Ex Buffer 5μl，Ex Taq酶1μl，dNTP 4μl，ddH₂O 37μl。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃45s，56℃45s，72℃50s，共30个循环；最后再于72℃延伸10min。

凝胶纯化回收PCR产物，P35基因扩增片段(linker II+上游片段+下游片段，592bp)的凝胶电泳结果如图1所示，其中泳道6为P35基因扩增片段；将P35基因扩增片段和pEGM-3zf(+)体分别用Sph I/Hind III双酶切，然后T4连接酶将带有黏性末端的P35基因扩增片段和pEGM-3zf(+)表达载体16℃连接过夜，构建中间载体pEGM-3zf(+)-P35；将pEGM-3zf(+)-P35转染E.Coli DH5α后，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取阳性克隆pEGM-3zf(+)-P35，提取质粒，将提取的质粒用Sph I/Hind III双酶切进行鉴定。结果如图2所示，其中泳道4中的小片段为双酶切获得的792bp的P35基因扩增片段。

将筛选出的阳性克隆进行测序分析(由北京奥科生物技术有限公司完成测序)，其中P35基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示(序列表所提供的序列不包含linker序列)，与NCBI Reference Sequence：NC 000003.11公开的P35基因序列比较，在SEQ.ID.NO.3所示的序列当中第534bp由g突变为a(用于调整gc含量)，第546bp由t突变为c(BamH I酶切突变位点)，但上述两处突变均为同义突变。

2.5表达载体pEGM-3zf-HBHA-IL-12的构建

将中间载体pEGM-3zf-HBHA-P40和pEGM-3zf(+)-P35体分别用SphI/Hind III双酶切，然后T4连接酶将带有黏性末端的P35基因扩增片段和pEGM-3zf-HBHA-P40载体16℃连接过夜，构建载体pEGM-3zf-HBHA-IL12；将pEGM-3zf-HBHA-IL12转染E.Coli DH5α后，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取阳性克隆pEGM-3zf-HBHA-IL12，提取质粒，将提取的质粒用Sph I/Hind III双酶切进行鉴定。结果如图2所示，其中泳道5所示的小片段为双酶切后获得的2427bp的HBHA-IL12的目的片段，具体为HBHA：600bp+linker I：48bp+P40：987bp+linker II：30bp+P35：762bp的目的片段。

3、重组表达载体pSMT3-HBHA-IL-12的构建

将表达载体pEGM-3zf-HBHA-IL12和pSMT3(由UCLA School ofMedicine的Professor Marcus A.Horwitz，M.D馈赠)分别用BamH I/Hind III双酶切，并在琼脂糖电泳后回收载体片段，将带有黏性末端的pSMT3线性载体和HBHA-IL12基因片段，通过T4DNA连接酶的连接构建重组表达载体pSMT3-HBHA-IL-12；

将构建完成的pSMT3-HBHA-IL-12重组表达载体用BamH I和Hind III双酶切进行鉴定，酶切鉴定结果如图3所示：泳道3为Marker，泳道1、2均为pSMT3-HBHA-IL-12载体被BamH I和Hind III双酶切的结果，可以在泳道2、3清晰的看到2427bp的目标基因条带；表明重组表达载体pSMT3-HBHA-IL-12构建成功。

4、分泌表达HBHA-IL-12的重组耻垢分枝杆菌(HBHA-IL-12-rM.S)的构建及表达

将MS在7H9培养基中大量培养4周后，按1％的比例转接；再培养3周后，7H9培养基中加入2M的甘氨酸，继续培养2d后冰浴30min(使细菌休克，制备感受态)。

用冰浴的10％甘油制备5×10⁶CFU(菌落形成单位)M.S感受态细胞，然后将纯化的pSMT3-HBHA-IL-12用电穿孔法转化感受态M.S；所述的电穿孔法其具体参数为：0.4cm的电穿孔杯，电压2.5KV，电容25uF，电阻1000Ω。

转染后的重组耻垢分枝杆菌(rM.S)在7H9培养基中37℃培养24h后，涂布于含ADC(葡萄糖-牛血清白蛋白因子v-过氧化氢酶)和潮霉素的7H10平板中，设空白质粒的分枝杆菌作为对照，37℃培养30～35d。

利用潮霉素抗性筛选和PCR方法筛选获得含pSMT3-HBHA-IL-12基因的r.MS：

在含有潮霉素的7H10平板培养5周后，挑出7H10平板上生长的克隆，接种于5ml 7H9培养基中培养21d后，离心收集细菌，提取细菌DNA，用PCR法鉴定pSMT3-HBHA-IL-12成功转染的阳性克隆。扩增引物用HBHA-IL-12基因的克隆时设计的引物(P1和P2、P3和P4、P5和P8)，RCR扩增体系和条件也相同。

HBHA的PCR扩增产物的电泳结果如图4a所示；泳道1为Marker，泳道2为对照，泳道3为挑取的阳性克隆的PCR扩增鉴定结果，可以在泳道4清晰的看到600bp的HBHA目标基因。IL-12的PCR扩增产物的电泳结果如图4b所示；泳道3为Marker，泳道1和2分别为挑取的阳性克隆的PCR扩增P40和P35的鉴定结果，可以在泳道1和2清晰的看到1035bp和792bp的IL-12目标基因P40和P35(均包含linker)。这表明HBHA-IL-12基因整合到了潮霉素抗性筛选的阳性克隆中。

PCR鉴定正确的阳性克隆加入含有潮霉素的7H9培养基中培养，37℃震荡培养30d；10000rpm离心3min，分别收集菌体沉淀和培养上清。

如果HBHA-IL-12-rMS的外源表达载体HBHA-IL-12得到表达，而由于表达的融合蛋白HBHA-IL-12是分泌型的，那么在离心收集HBHA-IL-12-rMS菌体时分离得到的上清中就应该包含HBHA-IL-12；因此对分离得到包含HBHA-IL-12的上清进行Western-blot鉴定：

取部分HBHA-IL-12-rM.S菌株的培养上清进行经12％SDS-PAGE电泳分离，并电转至PVDF膜。以含5％脱脂奶粉的TBST(Tris-Tween盐缓冲液)4℃封闭过夜，TBST洗膜，分别加入抗人IL-12单抗(一抗)和小鼠的HBHA单抗(1∶500稀释)作用1h，TBST洗膜；对应二抗分别为HRP标记的抗人IgG和抗小鼠IgG(1∶500稀释)，室温孵育1h，TBST洗膜后，DAB显色。

Western-blot结果如图显示5：泳道1为蛋白Marker，在泳道2、3中可以清楚的看到目的蛋白能够分别与抗HBHA和抗IL-12的单抗在约90kD处结合，这表明HBHA-IL-12-rM.S菌株以分泌的形式表达了目的蛋白HBHA-IL-12。

HBHA-IL-12-rM.S菌株37℃摇床(225rpm)培养72h，10000rpm离心2min，收集细菌，用无菌生理盐水洗涤三次，流式细胞仪计数后调至10×10⁸CFU/300μL，加入正常小牛血清50μL，37℃封闭1h，用无菌生理盐水洗涤菌体两次后，分别加入HBHA单抗(由第四军医大学西京医院检验科提供)和IL-12单抗(由Lab Vision公司提供，USA)，置于37℃孵育30min，10000rpm离心2min弃上清，用无菌生理盐水洗涤三次，定容至300μL，然后加入FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶4000)，置于室温15min，用无菌生理盐水洗涤菌体三次，取3μL菌悬液涂片，在荧光显微镜下观察。结果如图6所示：图6a为加入HBHA单抗的菌悬液，清楚的观察到结合了FITC标记的免疫反应物后发出的绿色荧光；图6b为加入IL-12单抗的菌悬液，同样清楚的观察到结合了FITC标记的免疫反应物后发出的绿色荧光；这表明分离筛选到的阳性克隆能够稳定的分泌HBHA-IL-12融合蛋白。

5、HBHA-IL-12-rM.S菌株的生长特性鉴定

将分泌表达HBHA-IL-12融合蛋白的HBHA-IL-12-rM.S菌株和普通M.S菌株分别接种在含10％ADC的7H9培养液中，37℃振荡培养，测定不同时间点的值，OD₆₀₀绘制生长曲线，比较观察rM.S的增殖特性与普通M.S的差别；结果如图7所示，HBHA-IL-12-rM.S的生长与普通M.S无显著差别；这表明HBHA-IL-12-M.S菌株并没有因为HBHA-IL-12的分泌而减缓菌体的生长。

6、HBHA-IL-12-rM.S菌株在小鼠体内诱导产生的免疫应答

1)将HBHA-IL-12-rM.S和普通M.S首先用7H10琼脂平板稀释计数，取6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组进行免疫：M.S对照组、生理盐水对照组、HBHA-IL-12-rM.S组，每组10只；M.S对照组和HBHA-IL-12-rM.S组采用1×10⁶ CFU/只皮下接种，生理盐水组为皮下0.2ml/只，均免疫1次。6W后分离血清的同时无菌取脾脏，置于200目的钢网上，用注射器针芯研磨，并用不含血清的RPMI1640培养液冲洗，将获取的脾脏细胞悬液转入2倍体积的小鼠淋巴细胞分离液，1000r/min离心15min，吸取中间单核细胞层，用不含血清的RPMI1640洗涤两次后，用含10％FCS的RPMII640培养液，将收集的脾细胞数调整至5×10⁶/ml，分别加入到24孔板中培养，800μl/孔；

再分别加入120μl/孔的HBHA蛋白(30mg/L溶于PBS)刺激诱导产生IFN-γ，置37℃，5％CO₂孵箱中培养72h，收集培养液，以5000r/min离心5min，取上清，采用夹心ELISA法检测IFN-γ的含量；

图8所示的免疫诱导的IFN-γ的水平检测结果：HBHA-IL-12-r.M.S组诱发的IFN-γ的水平为1827±245pg/ml，显著高于MS组的1335±180pg/ml，两者均高于生理盐水组357±75pg/ml；说明HBHA-IL-12-rMS分泌的HBHA-IL-12蛋白能够诱发较高水平的IFN-γ。而IFN-γ是激活巨噬细胞抗MTB活性的中心活性因子，在MTB保护免疫过程中有举足轻重的作用，由IFN-γ激活感染的巨噬细胞途径而发挥杀菌作用，从而使得机体具有强的保护力，可抵抗MTB的感染。

2)治疗效果观察：

取6～8周龄雄性BALB/c小鼠用结核分枝杆菌毒株H37Rv经静脉感染，剂量为10⁵CFU，4周后随机分为3组进行免疫治疗：M.S对照组、生理盐水对照组、HBHA-IL-12-rM.S组，每组10只；M.S对照组和HBHA-IL-12-rMS组用1×10⁶CFU/只皮下接种，生理盐水组为皮下0.2ml/只，均免疫1次。

6周后取小鼠脾脏组织匀浆，1000倍稀释后涂于7H10平板，4周后计数CFU，计算脏器MTB荷菌数，结果以脾脏和肺脏MTB荷菌数的log10CFU表示：

结果表明，与生理盐水组和M.S免疫组相比，HBHA-IL-12-r.M.S组可有效清除MTB的感染，有效降低脾脏荷菌数，其脾脏荷菌对数值(Ig，CFU/g)为4.83±0.30(P＜0.05)；M.S免疫组脾脏荷菌对数值为5.38±0.20，生理盐水治疗组为6.63±0.27。这表明HBHA-IL-12-r.M.S菌株可有效治疗机体的MTB感染。

综合上述1)～2)的验证结果表明：在接受HBHA-IL-12-rM.S免疫后，机体产生的免疫应答能够有效清除MTB，有望用于MTB感染的治疗。

6、HBHA-IL-12-rM.S菌株的稳定性验证

将分泌表达HBHA-IL-12的HBHA-IL-12-rM.S连续传代，检测插入基因HBHA-IL-12有无缺失，生长曲线有无变化；

检测到第10代培养的HBHA-IL-12-rM.S菌株，其生长曲线稳定，外源基因稳定表达，HBHA-IL-12-rM.S连续传代后分泌的HBHA-IL-12与HBHA-IL-12抗体的Western-blot结果如图9所示，可以清晰看到第1、4、8、10代的菌株均稳定分泌HBHA-IL-12。

7、HBHA-IL-12-r.M.S菌株的安全性验证

一组小鼠皮下接种10⁷CFU的HBHA-IL-12-rM.S，另一组接种10⁶CFU的M.S，4周时分别处死部分小鼠，无菌取脾和肺，肉眼观察无明显的病理变化；

将小鼠的肺脏、脾脏组织用10％的甲醛固定，制备病理切片，100×镜下观察肺脏和脾脏的组织变化；肺、脾脏组织切病理片结果分别如图10a、图10b所示，结果表明小鼠的肺、脾脏以淋巴细胞浸润为主，无明显的病理变化。

本发明提供的HBHA-IL-12-rM.S疫苗在免疫机体之后，一方面稳定的分泌融合蛋白HBHA-IL-12，有利于细胞免疫因子的协同发挥，另一方使机体产生针对HBHA-IL-12-rM.S的细胞免疫应答，有效清除体内感染的MTB，而且具有免疫后的安全性，从而使该疫苗可用于MTB的急性/或隐性感染者。

核苷酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种表达HBHA-IL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗

<160>5

<210>1

<211>600

<212>DNA

<213>MTB H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)

<400>1

atggctgaaa actcgaacat tgatgacatc aaggctccgt tgcttgccgc gcttggagcg     60

gccgacctgg ccttggccac tgtcaacgag ttgatcacga acctgcgtga gcgtgcggag    120

gagactcgta cggacacccg cagccgggtc gaggagagcc gtgctcgcct gaccaagctg    180

caggaagatc tgcccgagca gctcaccgag ctgcgtgaga agttcaccgc cgaggagctg    240

cgtaaggccg ccgagggcta cctcgaggcc gcgactagcc ggtacaacga gctggtcgag    300

cgcggtgagg ccgctctaga gcggctgcgc agccagcaga gcttcgagga agtgtcggcg    360

cgcgccgaag gctacgtgga ccaggcggtg gagttgaccc aggaggcgtt gggtacggtc    420

gcatcgcaga cccgcgcggt cggtgagcgt gccgccaagc tggtcggcat cgagctgcct    480

aagaaggctg ctccggccaa gaaggccgct ccggccaaga aggccgctcc ggccaagaag    540

gcggcggcca agaaggcgcc cgcgaagaag gcggcggcca agaaggtcac ccagaagtag    600

<210>2

<211>987

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc     60

gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat    120

gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg    180

accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa    240

gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg    300

ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag    360

aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc    420

acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga    480

ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc    540

agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca    600

gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat    660

gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac    720

ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac    780

acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag    840

agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc    900

cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc    960

gaatgggcat ctgtgccctg cagttag                                        987

<210>3

<211>762

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg     60

catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc    120

ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc    180

gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg    240

gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct    300

gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta    360

ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact    420

aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt    480

atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaaacttctg    540

atggacccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg    600

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gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca    720

gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aa                       762

<210>4

<211>48

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ggtggctcag gtggctccgg tggaggcgga agcggcggtg gaggatca    48

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

gttcctggag taggggtacc tggggtgggc                        30