仿CT扫描模式多光谱时域荧光分子层析测量系统

摘要

本发明涉及小动物分子成像领域。为提供具有超灵敏度和高时空分辨测量性能，继而实现高质量的多组分、多参数成像功能的仿CT扫描模式多光谱时域荧光分子层析测量系统系统，本发明采用的技术方案是：提供所需波长超短激光的两个皮秒半导体激光器及荧光探针；用于将两种不同波长的同频率超短激光脉冲按固定的时间间隔耦合成一束激光的光纤耦合器；用于将两个皮秒半导体激光器或其中一个的出射激光投射到目标体的入射光纤；用于实现仿CT扫描模式的成像腔及旋转平台；用于接收来自目标体的反射或透射激光的接收光纤；马达驱动滤光轮；用于接收通过相应滤光片后出射光的检测模块。本发明主要应用于小动物分子成像。

说明书

技术领域

本发明涉及小动物分子成像领域，尤其是面向小动物分子成像的时域荧光扩散层析系统和时间分辨光学层析系统，具体涉及仿CT扫描模式多光谱时域荧光分子层析测量系统。

背景技术

分子影像学是应用影像学方法对活体状态下的生物过程在细胞和分子水平进行的定性和定量的研究，是以体内特异性分子作为成像对比度的产生机制，通过影像在细胞或分子水平反映体内的生理和病理变化过程。分子影像学的优势可以主要概括为三点：其一，分子影像技术可将基因表达、生物信号传递等复杂的过程变成直观的图像，使人们能更好地在分子细胞水平上了解疾病的发生机制及特征；其二，能够发现疾病早期的分子细胞变异及病理改变过程；其三，可在活体上连续观察药物或基因治疗的机理和效果。分子影像技术作为一种在活体(in vivo)的探测方法，具有连续、快速、远距离、无损伤的优点，而更可能提供体内分子或细胞的三维图像。它可以揭示病变的早期分子生物学特征，推动了疾病的早期诊断和治疗，也为临床诊断引入了新的概念。

光学分子成像是重要的分子影像模态，兼有超灵敏度、高特异性、实时性和标记灵活性等多种优点，特别适合基于小动物病理模型的生物医学基础研究。。尤其近红外光谱技术(Near-Infrared Spectroscopy，NIRS)在生物组织在体成像应用上发展十分迅速。近红外光与生物组织的作用主要表现为散射和吸收，其中在600-900nm波段范围内具有明显的非相关吸收谱特征，形成了一个生物组织“光学诊断窗”，在此基础上建立的扩散光学层析技术(DiffuseOptical Tomography，DOT)可以获得组织体深部与病生理指标密切相关的光学参数三维定量信息。与此同时，随着光学分子影像学在生物学研究的不断深入应用，建立在DOT方法与特异性分子荧光标记技术相结合基础之上的光学分子层析技术则成为光学分子成像最前沿的研究领域，包括荧光层析(Fluorescence Molecular Tomography，FMT)和生物自发光层析(Bioluminescence Tomography，BLT)两种基本模态。FMT通过激发光和发射荧光两个波段上同时激发光-荧光测量和荧光扩散层析过程，产生反映组织体内部特异分子生化过程强度及其微环境特征的荧光参数的空间分布，包括发射率(荧光剂量子效率和吸收系数之积)和寿命等。根据激发方式的不同，FMT具有三种测量模式：时域(Time Domain，TD)、频域(FrequencyDomain，FD)和连续波(Continuous Wave，CW)，其中CW方式原理和实现上最为简单和直接，而FD和TD方式可望实现更高的功能和指标。对于FD方式虽然可以实现多参数同时重建，但是当应用该方式于小动物成像时，需要1GHz以上的调制频率来达到适当的信噪比，这么高的频率下交流幅值几乎为零，可见FD方式的局限性。因此具备多参数成像能力且性能优良的时域FMT技术获得了广泛的重视。时域FMT技术旨在发展高灵敏时间分辨检测技术，通过多“角度”激发下表面荧光瞬态“投影”的测量和基于精确光子迁移模型的图像反演算法，重建复杂组织体内部特定分子靶标多荧光参数(荧光产率和寿命)的空间分布，并通过时间分辨信息弥补空间采样数量的有限性以有效提高成像质量和检测灵敏度，实现FMT的应用要求。

时域FMT实现方案现有采用时间相关单光子计(Time-Correlated Single PhotonCounting，TCSPC)技术，是一种具有超高灵敏、合理时间分辨率的离散通道测量技术；还有采用时间选通影像增强CCD相机(Time-gated Intensifier CCD camera)，是一种具有高空间采样率的测量技术，但其线性度和动态范围不高，且相较TCSPC技术在灵敏度和时间分辨率上也无优势。

发明内容

为克服现有技术的不足，弥补现有技术在空间采样密度上的缺陷，使系统兼具有超灵敏度和高时空分辨测量性能，继而实现高质量的多组分、多参数成像功能。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：仿CT扫描模式多光谱时域荧光分子层析测量系统系统，包括：

提供所需波长超短激光的两个皮秒半导体激光器及荧光探针，用于发出激光脉冲，其中一个激光器的波长在荧光探针的激发光波段，另一个波长在荧光探针的荧光波段；

用于将两种不同波长的同频率超短激光脉冲按固定的时间间隔耦合成一束激光的光纤耦合器；

用于将两个皮秒半导体激光器或其中一个的出射激光投射到目标体的入射光纤；

用于实现仿CT扫描模式的成像腔及旋转平台；

用于接收来自目标体的反射或透射激光的接收光纤；

用于滤除或衰减相应激发光的滤光片及实现不同性能滤光片相互切换的马达驱动滤光轮；

用于接收通过相应滤光片后出射光的检测模块，包括：光电子计数PMT检测器组、8通道路由模块、多维时间相关单光子计TCSPC模块。

两个皮秒半导体激光器工作波长以及滤光片组波长设置分别是与不同荧光染料的激发和发射光谱相对对应，根据不同荧光探针进行的组合如下：

1)Cy5.5近红外荧光染料，其峰值激发波长约为670nm，峰值荧光波长约为700nm，则选用的两个皮秒半导体激光器的波长分别为670nm和700nm，滤光片组中有半高宽为10nm中心波长间隔为10nm，波长范围是680-760nm的8个带通滤光片，和一个截止波长为690nm的长通滤波片；

2)吲哚氰绿Indocyanine Green，ICG近红外荧光染料，其峰值激发波长约为780nm，峰值荧光波长约为830nm，则选用的两个皮秒半导体激光器的波长分别为780nm和830nm，滤光片组中有半高宽为10nm中心波长间隔为10nm的，波长范围是790-870nm的8个带通滤光片，及一个截止波长为800nm的长通滤波片；

3)Alexa Fluor 750近红外荧光染料，其峰值激发波长约为750nm，峰值荧光波长约为785nm，则选用的两个皮秒半导体激光器的波长分别为750nm和785nm，滤光片组中有半高宽为10nm中心波长间隔为10nm的，波长范围是760-840nm的8个带通滤光片，及一个截止波长为770m的长通滤波片。

两个皮秒半导体激光器经不同长度的光纤产生固定的时间间隔后通过一个耦合器连接到入射光纤，接收光纤为在入射光纤对面的同平面位置布置的8个探测光纤或光纤束，成像腔置于一个旋转/升降台上，通过旋转/升降台旋转角度和升降高度的步进间隔控制，实现不同空间采样密度的时间分辨测量。

8个探测光纤或光纤束分别对应通过8个12孔滤波轮中的一个，对应接入8个PMT检测通道中的一个通道，12孔滤波轮中一个孔为全透，其余的孔分别设置荧光长通滤光片组及不同中心波长的荧光带通滤光片组，以及用于激发光检测的中性密度ND衰减片，用于进行激发光、全光谱荧光或多光谱荧光信号的测量；8个PMT检测器通过一个8通道路由器接入多维时间相关单光子计TCSPC模块。

两个皮秒半导体激光器由计算机进行相关控制以实现同步输出相同频率的光脉冲，再经过不同长度的光纤产生固定的时间间隔后通过耦合器形成一束激光，以实现通过荧光测量前的DOT测量获得该两波长下的背景组织光学参数值。

入射光纤和接收光纤与目标体Ω的边界面有一定距离，位于r_d处接收光纤的光纤探头测得的光流量Γ(r_d，t)与成像腔表面辐射率满足下列射线理论关系：

其中r为表面上任意的位置矢量，和分别为成像腔表面外法向单位矢量和光纤探头方向上的单位矢量，V(r_d，r)为r点与r_d点之间的视见函数，μ_a0光在空气中的衰减系数，R_A为圆柱形目标体的半径。

本发明系统采用光纤耦合非接触模式来实现时域DOT/FMT原型测量，其特点在于：

1、本发明的成像腔与光纤支架为内外同心圆设计，测量时麻醉后的荷瘤小鼠以轻微挤压垂直放入成像腔中，并以光学匹配液填充间隙。两个分别为激发和荧光波长的皮秒脉冲激光器通过一个耦合器连接到入射光纤，在此对面的同平面位置布置有8个探测光纤或光纤束。成像腔置于一个旋转/升降台上，通过旋转角度和升降高度的步进间隔控制，可实现不同空间采样密度的时间分辨测量，所获数据可按不同平面成组进行单平面二维图像重建，或综合利用进行三维立体重建。

2、本发明可实现多光谱测量技术，出射光纤分别接入8个PMT检测通道，每个PMT前耦合一个12孔滤波轮，其中一个孔为全透，其余的孔分别设置荧光长通滤光片组及不同中心波长的荧光带通滤光片组，以及用于激发光检测的中性密度(ND)衰减片，可进行激发光、全光谱荧光或多光谱荧光信号的测量。

3、本发明采用了单通道多维TCSPC测量模式，8个PMT检测器通过一个8通道路由器接入多维TCSPC模块，进行高速时间分辨测量。

4、本发明中入射与出射光纤均为非接触测量模式，如图6所示光源光纤和检测光纤与目标体Ω的边界面有一定距离，即用光纤非接触模式激励目标体和检测光信号。位于r_d处的光纤探头测得的光流量Γ(r_d，t)与成像腔表面辐射率满足下列射线理论关系：

其中r为表面上任意的位置矢量，和分别为成像腔表面外法向单位矢量和光纤探头方向上的单位矢量，V(r_d，r)为r点与r_d点之间的视见函数，μ_a0光在空气中的衰减系数，R_A为圆柱形目标体的半径。

5、本发明的光源系统采用两个分别为激发和荧光波长的皮秒脉冲激光器通过一个耦合器连接到入射光纤。共同使用时两个波长有固定的时间间隔，通过荧光测量前的DOT测量可获得该两波长下的背景组织光学参数值。将此光学参数作为荧光层析图像重建时背景的先验值，可以大幅度地提高荧光层析图像的分辨率和量化精度。

6、本发明的非接触测量模式，不但有效简化测量过程，排除不必要的系统误差和繁琐的耦合标定过程，且使得数据采集变得灵活多样。可通过控制扫描离散角度间隔和范围实现高密度采集和重点区域强调，从而有效的弥补TCSPC技术在空间采样密度上的不足，使系统兼具有超灵敏度和高时空分辨测量性能，继而实现高质量的多组分、多参数成像功能。

附图说明

图1为仿CT扫描模式多光谱时域荧光分子层析测量系统系统框图。

图2光源系统的基本结构示意图。

图3马达驱动滤光轮及光电倍增管组结构示意图。

图4马达驱动滤光轮中滤光片分部示意图。

图5成像腔及扫描控制方案示意图。

图6光纤非接触测量模式层析平面示意图。

具体实施方式

发展仿CT扫描的非接触工作模式在基于TCSPC技术的时域FMT测量系统实现上具有特别重要的意义：一方面，与所有非接触测量模式一样，它可有效简化测量过程，排除不必要的系统误差和繁琐的耦合标定过程；另一方面，非接触式测量使得数据采集变得灵活多样，可通过控制扫描离散角度间隔和范围实现高密度采集和重点区域强调，从而有效的弥补TCSPC技术在空间采样密度上的不足，使系统兼具有超灵敏度和高时空分辨测量性能，继而实现高质量的多组分、多参数成像功能。

本发明是仿CT扫描模式，即光纤非接触模式下的FMT/DOT测量系统。图1为仿CT扫描模式多光谱时域荧光分子层析测量系统系统的基本结构。其由光源系统1、入射光纤2，成像腔3、出射光纤4、检测系统、计算机11等部分组成。具体光纤非接触模式下的FMT/DOT测量过程描述如下。

A.当Cy5.5为荧光染料时，该系统的测量过程(即系统的两个激光波长分别为670nm和700nm)。

1、在通过荧光测量前，先利用两波长进行DOT测量，从而获得该两波长下的背景组织光学参数值。如图2所示激发波长皮秒脉冲半导体激光器13的波长为670nm，荧光波长皮秒脉冲半导体激光器14的波长为700nm。两个激光器开关由相关软件进行控制，其频率相同且通过功率合成器12同步后接到多维TCSPC模块10的同步信号端。两个激光器所发出的同步激光以由不同长度的光纤接至光纤耦合器15(同步信号频率选为40MHZ，两个波长激光脉冲时间间隔选为12.5ns。由于光纤内径材料为石英(折射率为1.54)，因此两个激光器到光纤耦合器的光纤长度应相差约为2.4米)，从而使得两种不同波长激光以固定的时间间隔混成同一束激光出射到入射光纤2(芯径62.5μm)。

2、入射光纤2将激光打在成像腔3(由半透明有机玻璃制成，直径约2-3cm)上，如图5所示成像腔3与光纤支架45(直径4cm)为内外同心圆设计，测量时麻醉后的荷瘤小鼠以轻微挤压垂直放入成像腔3中，并以光学匹配液填充间隙，在此对面101.25°～258.75°的同平面位置(设入射光在0°角位置)布置有8个出射光纤4(探测光纤，芯径500μm)，相互间隔角为22.5°。成像腔置于一个旋转/升降台46上，通过旋转角度和升降高度的步进间隔控制，实现仿CT扫描模式。由出射光纤4将探测光信号导入检测模块。

3、8个出射光纤4接入马达驱动滤光轮组16-23，马达驱动滤光轮结构如图4所示，其中孔33是全透过孔；孔34是衰减为30dB的中性密度滤光片；孔35是衰减为50dB的中性密度滤光片；在测量荧光前进行DOT测量，则通过滤光轮控制器24调节马达驱动滤光轮，调至孔33/34/35得到适当衰减后的光信号。

4、如图3所示将马达驱动滤光轮组出射的光信号送入带有制冷功能的PMT检测器25-32，PMT将实验中的弱光信号转换为电子脉冲信号。8个PMT检测器通过8通道路由模块9接入到多维TCSPC模块10，对输入的电子脉冲进行计数，并按通道地址信号存入相应的内存块，得到从8个通道测得的探测面出射的8条双波长激发光的时间扩展曲线。

5、双波长DOT测量后，进行FMT测量即荧光测量，仅开启激发波长皮秒脉冲半导体激光器13(波长为670nm)。激光经入射光纤2至成像腔3，通过旋转/升降台46旋转角度和升降高度的步进间隔控制，实现仿CT扫描模式。再由出射光纤4导入检测系统。通过滤光轮控制器24调节马达驱动滤光轮，其中孔36为截止频率为690nm的长通滤光片；孔37-44是半高宽为10nm中心波长间隔为10nm的8个带通滤光片(波长范围是680-760nm)；通过对孔36-44的不同选择得到全光谱荧光或多光谱荧光信号。再通过PMT将实验中的弱光信号转换为电子脉冲信号。8个PMT检测器通过8通道路由模块9接入到多维TCSPC模块10，对输入的电子脉冲进行计数并按通道地址信号存入相应的内存块，从而得到从8个通道测得的探测面出射的8条荧光时间扩展曲线。

6、成像腔每次旋转一个角度(一般选为1°)，重复进行上述测量过程，直到旋转360°后，通过电控升降台步进一个步长(一般为1mm)后再重复旋转测量的过程。成像圆柱一般长5cm，因此升降台的步进范围大于5cm。即一般可得到的探测数据量为360×50×8＝144000个。由于可选用更精密的电控旋转和升降台，所以进一步提高探测的空间分辨并不困难。

B.当ICG为荧光染料时，该系统的测量过程(即系统的两个激光波长分别为780nm和830nm)。

1、在通过荧光测量前，先利用两波长进行DOT测量，从而获得该两波长下的背景组织光学参数值。如图2所示激发波长皮秒脉冲半导体激光器13的波长为780nm，荧光波长皮秒脉冲半导体激光器14的波长为830nm。两个激光器开关由相关软件进行控制，其频率相同且通过功率合成器12同步后接到多维TCSPC模块10的同步信号端。两个激光器所发出的同步激光以由不同长度的光纤接至光纤耦合器15(同步信号频率选为40MHZ，两个波长激光脉冲时间间隔选为12.5ns。由于光纤内径材料为石英(折射率为1.54)，因此两个激光器到光纤耦合器的光纤长度应相差约为2.4米)，从而使得两种不同波长激光以固定的时间间隔混成同一束激光出射到入射光纤2(芯径62.5μm)。

2、入射光纤2将激光打在成像腔3(由半透明有机玻璃制成，直径约2-3cm)上，如图5所示成像腔3与光纤支架45(直径4cm)为内外同心圆设计，测量时麻醉后的荷瘤小鼠以轻微挤压垂直放入成像腔3中，并以光学匹配液填充间隙，在此对面101.25°～258.75°的同平面位置(设入射光在0°角位置)布置有8个出射光纤4(探测光纤，芯径500μm)，相互间隔角为22.5°。成像腔置于一个旋转/升降台46上，通过旋转角度和升降高度的步进间隔控制，实现仿CT扫描模式。由出射光纤4将探测光信号导入检测模块。

3、8个出射光纤4接入马达驱动滤光轮组16-23，马达驱动滤光轮结构如图4所示，其中孔33是全透过孔；孔34是衰减为30dB的中性密度滤光片；孔35是衰减为50dB的中性密度滤光片；在测量荧光前进行DOT测量，则通过滤光轮控制器24调节马达驱动滤光轮，调至孔33/34/35得到适当衰减后的光信号。

4、如图3所示将马达驱动滤光轮组出射的光信号送入带有制冷功能的PMT检测器25-32，PMT将实验中的弱光信号转换为电子脉冲信号。8个PMT检测器通过8通道路由模块9接入到多维TCSPC模块10，对输入的电子脉冲进行计数，并按通道地址信号存入相应的内存块，得到从8个通道测得的探测面出射的8条双波长激发光的时间扩展曲线。

5、双波长DOT测量后，进行FMT测量即荧光测量，仅开启激发波长皮秒脉冲半导体激光器13(波长为780nm)。激光经入射光纤2至成像腔3，通过旋转/升降台46旋转角度和升降高度的步进间隔控制，实现仿CT扫描模式。再由出射光纤4导入检测系统。通过滤光轮控制器24调节马达驱动滤光轮，其中孔36为截止频率为800nm的长通滤光片；孔37-44是半高宽为10nm中心波长间隔为10nm的8个带通滤光片(波长范围是790-870nm)；通过对孔36-44的不同选择得到全光谱荧光或多光谱荧光信号。再通过PMT将实验中的弱光信号转换为电子脉冲信号。8个PMT检测器通过8通道路由模块9接入到多维TCSPC模块10，对输入的电子脉冲进行计数并按通道地址信号存入相应的内存块，从而得到从8个通道测得的探测面出射的8条荧光时间扩展曲线。

6、成像腔每次旋转一个角度(一般选为1°)，重复进行上述测量过程，直到旋转360°后，通过电控升降台步进一个步长(一般为1mm)后再重复旋转测量的过程。成像圆柱一般长5cm，因此升降台的步进范围大于5cm。即一般可得到的探测数据量为360×50×8＝144000个。由于可选用更精密的电控旋转和升降台，所以进一步提高探测的空间分辨并不困难。

C.当Alexa Fluor 750为荧光染料时，该系统的测量过程(即系统的两个激光波长分别为750nm和785nm)。

1、在通过荧光测量前，先利用两波长进行DOT测量，从而获得该两波长下的背景组织光学参数值。如图2所示激发波长皮秒脉冲半导体激光器13的波长为750nm，荧光波长皮秒脉冲半导体激光器14的波长为785nm。两个激光器开关由相关软件进行控制，其频率相同且通过功率合成器12同步后接到多维TCSPC模块10的同步信号端。两个激光器所发出的同步激光以由不同长度的光纤接至光纤耦合器15(同步信号频率选为40MHZ，两个波长激光脉冲时间间隔选为12.5ns。由于光纤内径材料为石英(折射率为1.54)，因此两个激光器到光纤耦合器的光纤长度应相差约为2.4米)，从而使得两种不同波长激光以固定的时间间隔混成同一束激光出射到入射光纤2(芯径62.5μm)。

2、入射光纤2将激光打在成像腔3(由半透明有机玻璃制成，直径约2-3cm)上，如图5所示成像腔3与光纤支架45(直径4cm)为内外同心圆设计，测量时麻醉后的荷瘤小鼠以轻微挤压垂直放入成像腔3中，并以光学匹配液填充间隙，在此对面101.25°～258.75°的同平面位置(设入射光在0°角位置)布置有8个出射光纤4(探测光纤，芯径500μm)，相互间隔角为22.5°。成像腔置于一个旋转/升降台46上，通过旋转角度和升降高度的步进间隔控制，实现仿CT扫描模式。由出射光纤4将探测光信号导入检测模块。

3、8个出射光纤4接入马达驱动滤光轮组16-23，马达驱动滤光轮结构如图4所示，其中孔33是全透过孔；孔34是衰减为30dB的中性密度滤光片；孔35是衰减为50dB的中性密度滤光片；在测量荧光前进行DOT测量，则通过滤光轮控制器24调节马达驱动滤光轮，调至孔33/34/35得到适当衰减后的光信号。

4、如图3所示将马达驱动滤光轮组出射的光信号送入带有制冷功能的PMT检测器25-32，PMT将实验中的弱光信号转换为电子脉冲信号。8个PMT检测器通过8通道路由模块9接入到多维TCSPC模块10，对输入的电子脉冲进行计数，并按通道地址信号存入相应的内存块，得到从8个通道测得的探测面出射的8条双波长激发光的时间扩展曲线。

5、双波长DOT测量后，进行FMT测量即荧光测量，仅开启激发波长皮秒脉冲半导体激光器13(波长为750nm)。激光经入射光纤2至成像腔3，通过旋转/升降台46旋转角度和升降高度的步进间隔控制，实现仿CT扫描模式。再由出射光纤4导入检测系统。通过滤光轮控制器24调节马达驱动滤光轮，其中孔36为截止频率为770nm的长通滤光片；孔37-44是半高宽为10nm中心波长间隔为10nm的8个带通滤光片(波长范围是760-840nm)；通过对孔36-44的不同选择得到全光谱荧光或多光谱荧光信号。再通过PMT将实验中的弱光信号转换为电子脉冲信号。8个PMT检测器通过8通道路由模块9接入到多维TCSPC模块10，对输入的电子脉冲进行计数并按通道地址信号存入相应的内存块，从而得到从8个通道测得的探测面出射的8条荧光时间扩展曲线。

6、成像腔每次旋转一个角度(一般选为1°)，重复进行上述测量过程，直到旋转360°后，通过电控升降台步进一个步长(一般为1mm)后再重复旋转测量的过程。成像圆柱一般长5cm，因此升降台的步进范围大于5cm。即一般可得到的探测数据量为360×50×8＝144000个。由于可选用更精密的电控旋转和升降台，所以进一步提高探测的空间分辨并不困难。