水产品中持久性含氯有机物的分析测定方法

摘要

本发明公开了一种水产品中持久性含氯有机物的分析测定方法，包括如下步骤：A)将水产品的肌肉组织进行干燥并研磨；B)索氏萃取；C)凝胶色谱净化；D)浓硫酸脱脂；E)弗罗里硅层析柱进行层析；以及F)气相色谱法测定持久性含氯有机物。本发明的方法中，样品提取及净化操作简单，溶剂耗量少，分析速度快，对40种持久性含氯有机物不仅可以准确定性还可以精确定量，检测限底，灵敏度高，检出限均低于4ng/g-lw。

说明书

技术领域

本发明属于化学分析领域，涉及有机污染物的分析测定方法，尤其是水产品中持久性含氯有机物的分析测定方法。

背景技术

持久性含氯有机物主要包括有机氯农药(OCPs)和多氯联苯(PCBs)，其中六六六(HCHs)、滴滴涕(DDTs)、氯丹、艾氏剂、狄氏剂、异狄氏剂、六氯苯(HCB)、多氯联苯(PCBs)等已被列入关于持久性有机污染物(POPs)的斯德哥尔摩公约和世界各国的优先控制污染物黑名单。有机氯农药主要用于防治农业生产中的有害生物，多氯联苯因其优良的化学惰性广泛用于电力工业、塑料加工业、化工和印刷等领域。有机氯农药在使用过程中，多氯联苯伴随着家电的使用、废弃及回收过程都大量释放到周围环境中，对生态系统和人类健康形成潜在危害。目前它们已被作为一类典型的持久性有毒有害物质，受到人们的关注。

随着我国人民生活水平的提高，鱼类水产品在食物结构中所占的比例越来越高。由于我国内陆水体与近岸海域普遍受到污染，因此食用鱼类水产品的安全问题不容忽视。近年来，质检部门针对鱼类水产品化学污染物的检测主要是围绕含量较高、较易检测的抗生素和重金属，很少针对持久性有机污染物开展系统检测。由于鱼类水产品中的污染物成分复杂、含氯有机物种类多且多处于痕量水平，因此鱼类水产品的高效萃取与净化、多种痕量含氯有机物的有效分离和准确测定一直是鱼类水产品中持久性含氯有机物分析的难点。

目前固体样品的萃取技术主要有：索氏萃取、微波辅助萃取、超声萃取、加速溶剂萃取、加压溶剂萃取和超临界流体萃取。其中索氏萃取最为经典，适用范围较广，回收率较高，重现性稳定。但是萃取时间较长，溶剂的使用量较大。相对于索氏萃取，其它萃取方法在萃取时间和溶剂使用量方面有所改进，但是也存在各自的不足，例如微波辅助萃取时弱极性或非极性有机物在萃取时所有非极性萃取剂对微波能利用率不高；超声萃取易使稳定性较差的有机物分解等等。萃取后的样品净化方面，主要有氧化铝净化、弗罗里硅净化、硅胶净化、凝胶渗透净化等。对于净化好的分析样品，当前国内外主要采用气相色谱/电子捕获检测器(GC/ECD)联用的方法进行含氯有机物的分离与测定。

目前还未见有针对鱼类水产品中含氯有机物分析测定的报道。进行所述分析测定存在的困难包括：1、含氯有机物在鱼类水产品中的含量是痕量的，通常仪器的检测限达不到；2、整个流程中含氯化合物的回收率能否理想，即方法的可靠性不能保证；3、含氯化合物的背景复杂(即鱼等生物体内有很多化合物的干扰)，不能有效的去除杂质干扰物)。

发明内容

本发明针对现有技术中还未有水产品中持久性含氯有机物的分析测定方法，而提供一种水产品中持久性含氯有机物的分析测定方法。由于水产品尤其是鱼类水产品中有机物的干扰较多，对杂质彻底净化提出了更高的要求。凝胶色谱和弗罗里硅层析柱净化水产品样品有机萃取液，以去除萃取时带来的极性和非极性干扰物，具有许多优点：凝胶色谱去除水产品尤其是鱼类水产品中大分子干扰物质效果好、自动化程度高，适合多个样品的批量自动净化处理；弗罗里硅层析柱净化效率高、柱子商品化程度高、技术成熟、易得，二者联用加上硫酸脱脂能够实现水产品尤其是鱼类水产品样品萃取液的彻底脱脂与净化。

本发明的水产品中持久性含氯有机物的分析测定方法包括如下步骤：

A)将水产品的肌肉组织进行干燥并研磨；

B)索氏萃取；

C)凝胶色谱净化；

D)浓硫酸脱脂；

E)弗罗里硅层析柱进行层析；以及

F)气相色谱法测定持久性含氯有机物。

其中，在步骤A)中，水产品的肌肉组织进行冷冻干燥并用玛瑙研钵研磨。

在步骤B)中，索氏萃取后再过用承接有无水硫酸钠的脱脂棉进行过滤，以除去少量水分和固体杂质；其中，索氏萃取采用体积比为1～1.5∶1的正己烷与丙酮混合溶剂作为萃取剂，索氏提取仪加热板温度为60～70℃，自动提取时间为960～1440min。

在步骤C)中，凝胶色谱净化包括单浓缩过程与二连机过程，两过程可由凝胶色谱仪中的单浓缩和二连机程序自动完成，然后再氮吹浓缩。

步骤D)中的浓硫酸脱脂具体为：向步骤C)制得的净化液中加入正己烷，并用浓硫酸进行处理进一步去除脂质，离心分离，水相再用正己烷提取2次，合并有机相，氮吹浓缩。

步骤E)中的层析具体为：在弗罗里硅层析柱上加上一薄层无水硫酸钠，先后用丙酮和正己烷清洗活化层析柱；上样，用体积比为9∶1的正己烷与丙酮的混合液洗脱，收集洗脱液；洗脱液氮吹，再加入正己烷继续氮吹，重复三次，最后定容。

步骤F)中气相色谱法测定持久性含氯有机物用配备电子捕获检测器的气相色谱仪进行定性定量检测，具体为：在(5％苯基)甲基聚硅氧烷HP-5 45m×300um×0.22um非极性色谱柱上分离；载气为高纯氦气，恒压10psi；进样口温度260℃；检测器温度310℃；柱温初始为80℃并保持2min，然后以20℃/min的速率升至150℃，继续以4℃/min的速率升至190℃，然后以1℃/min的速率升温至210℃，2℃/min的速率升至230℃，最后以30℃/min的速率升至300℃，并在300℃保持4min；无分流自动进样1μL；在各化合物保留时间下以色谱峰面积计算水产品中持久性含氯有机物的浓度。

在本发明中，所述水产品为鱼类、虾类或贝类水产品。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明所采用的水产品样品预处理方法，不仅能有效的提取出目标含氯有机物，回收率高，高达68.9％-79.1％，而且能彻底去除共萃取带来的复杂的极性和非极性有机杂质的影响；

2、本发明所采用的气相色谱分析法，既可对水产品中的含氯有机物进行定性研究，又能进行定量分析。尤其对40种含氯有机物中的多种同分异构体，不仅可以准确定性又可精确定量；

3、本发明处理流程自动化程度高，分析速度快，人工劳力节省，适合多个样品的批量处理，样品平行性好，重现性高，分析测定方法可靠；

4、本发明适于水产品中痕量持久性含氯有机物的分析测定，检测限低，灵敏度高，40种含氯有机物的检出限均低于4ng/g-lw(纳克/克-脂重，即水产品尤其是鱼类水产品中每克脂肪中所含有的含氯有机物的纳克数)。

附图说明

图1为本发明的流程示意图

图2A为浙江省湖州市南太湖野生银鱼体内含氯有机物色谱总图；

图2B为图2A中保留时间为13~19min段处的色谱放大图；

图2C为图2A中保留时间为26~38min段处的色谱放大图；

图3A为浙江省湖州市南太湖野生白鱼体内含氯有机物色谱总图；

图3B为图3A中保留时间为14.5～18min段处的色谱放大图；

图3C为图3A中保留时间为22～27min段处的色谱放大图；

图3D为图3A中保留时间为30～36min段处的色谱放大图；

图4A为联合国环境署(UNEP)提供的某种鱼肌肉组织中含氯有机物色谱总图；

图4B为图4A中保留时间为14.5～16.25min段处的色谱放大图；

图4C为图4A中保留时间为17～22min段处的色谱放大图；

图4D为图4A中保留时间为26～36min段处的色谱放大图；以及

图4E为图4A中保留时间为38~50min段处的色谱放大图。

具体实施方式

实施例1

运用本发明对浙江省湖州市南太湖野生银鱼进行分析，测定其中含氯有机物的种类及含量。

从冰箱中取出-20℃保存的银鱼样品，常温下解冻。全鱼冷冻干燥48h，干燥后样品用玛瑙研钵磨碎。

电子天平准确称取3.0g样品两份，用100mL正己烷与丙酮的混合液(体积比为1∶1)连续索氏萃取。索氏提取仪加热板温度为63℃，自动提取时间为960min。一份提取液采用重量法测定银鱼脂肪含量，另一份用承接有无水硫酸钠的脱脂棉过滤，去除少量水分与固体杂质。

提取液然后进凝胶色谱仪进行净化，以去除大分子量物质，在单浓缩程序过程中溶剂浓缩至8mL，在二连机程序过程中溶剂用正己烷置换并浓缩定容至4mL；然后净化液再氮吹浓缩至约1mL。

加入3mL正己烷，再用3mL浓硫酸处理进一步脱脂，离心分离，水相继续用3mL正己烷提取两次，合并有机相，氮吹浓缩至约1mL。

先用5mL丙酮清洗活化商用弗罗里硅小柱，再用5mL正己烷清洗活化，弃去清洗液；然后将浓硫酸处理过的提取液过小柱，样品瓶用少量正己烷清洗后过柱；然后用5mL正己烷与丙酮的混合液(体积比为9∶1)淋洗小柱，收集三部分过柱流出液并柔和氮吹浓缩至约1mL。加入5mL正己烷再氮吹浓缩至约1mL，此步骤重复三次，最后浓缩定容为100μL。

采用Agilent7890型气相色谱与电子俘获检测器(ECD)定量测定该样品。待测样品在(5％苯基)甲基聚硅氧烷Agilent HP-5非极性色谱柱上分离；载气为高纯氦气，恒压10psi；进样口温度260℃；检测器温度310℃；柱温初始为80℃，保持2min，以20℃/min的速率升至150℃，继续以4℃/min的速率升至190℃，然后以1℃/min的速率升温至210℃，2℃/min的速率升至230℃，最后以30℃/min的速率升至300℃，保持4min；无分流自动进样1μL。在各含氯有机物色谱保留时间的基础上，根据获得的色谱峰数据与各含氯有机物的标准色谱峰数据进行对比分析，判断是否含有该种含氯有机物。在各保留时间下按色谱峰高定量分析各含氯有机物的含量。色谱图结果见图2。测定结果为：在15.568min检出HCB，浓度为8.00ng/g-lw；15.728min检出PCA(五氯苯甲醚)，浓度为5.47ng/g-lw；17.643min检出δ-HCH，浓度为3.63ng/g-lw；27.453min检出o，p’-DDE，浓度为11.0ng/g-lw；30.314min检出p，p’-DDE，浓度为186ng/g-lw；34.457min检出p，p’-DDD，浓度为18.9ng/g-lw；34.729min检出o，p’-DDT，浓度为14.3ng/g-lw；35.819min检出CB153，浓度为6.78ng/g-lw；38.382min检出p，p’-DDT，浓度为18.3ng/g-lw。

实施例2

运用本发明对浙江省湖州市南太湖野生白鱼进行分析，测定其中含氯有机物的种类及含量。

从冰箱中取出-20℃保存的白鱼样品，常温下解冻。取白鱼背部肌肉，冷冻干燥48h。干燥后样品用玛瑙研钵磨碎。

电子天平准确称取3.0g样品两份，用100mL正己烷与丙酮的混合液(体积比为1∶1)连续索氏萃取。索氏提取仪加热板温度为63℃，自动提取时间为960min。一份提取液采用重量法测定白鱼脂肪含量，另一份用承接有无水硫酸钠的脱脂棉过滤，去除少量水分与固体杂质。

提取液然后进凝胶色谱仪进行净化，以去除大分子量物质，在单浓缩程序过程中溶剂浓缩至8mL，在二连机程序过程中溶剂用正己烷置换并浓缩定容至4mL；然后净化液再氮吹浓缩至约1mL。

加入3mL正己烷，再用3mL浓硫酸处理进一步脱脂，离心分离，水相继续用3mL正己烷提取两次，合并有机相，氮吹浓缩至约1mL。

先用5mL丙酮清洗活化弗罗里硅小柱，再用5mL正己烷清洗活化，弃去清洗液；然后将浓硫酸处理过的提取液过小柱，样品瓶用少量正己烷清洗后过柱；然后用5mL正己烷与丙酮的混合液(体积比为9∶1)淋洗小柱，收集三部分过柱流出液并柔和氮吹浓缩至约1mL。加入5mL正己烷再氮吹浓缩至约1mL，此步骤重复三次，最后浓缩定容为100μL。

采用Agilent7890型气相色谱与ECD电子俘获检测器定量测定该样品。待测样品在(5％苯基)甲基聚硅氧烷Agilent HP-5非极性色谱柱上分离；载气为高纯氦气，恒压10psi；进样口温度260℃；检测器温度310℃；柱温初始为80℃(保持2min)，以20℃/min的速率升至150℃，继续以4℃/min的速率升至190℃，然后以1℃/min的速率升温至210℃，2℃/min的速率升至230℃，最后以30℃/min的速率升至300℃，(保持4min)；无分流自动进样1μL。在各含氯有机物色谱保留时间的基础上，根据获得的色谱峰数据与各含氯有机物的标准色谱峰数据进行对比分析，判断是否含有该种含氯有机物。在各保留时间下按色谱峰高定量分析各含氯有机物的含量。色谱图结果见图3。测定结果为：在15.561min检出HCB(六氯苯)，浓度为23.3ng/g-lw；在15.729min检出PCA(五氯苯甲醚)，浓度为20.2ng/g-lw；16.557min检出γ-HCH，浓度为16.6ng/g-lw；17.645min检出δ-HCH，浓度为60.3ng/g-lw；22.575min检出CB44，浓度为299ng/g-lw；27.391min检出o，p’-DDE，浓度为23.7ng/g-lw；30.241min检出p，p’-DDE，浓度为681ng/g-lw；30.987min检出o，p’-DDD，浓度为108ng/g-lw；34.373min检出p，p’-DDD，浓度为63.6ng/g-lw；35.815min检出CB153，浓度为44.7ng/g-lw。

实施例3

运用本发明对联合国环境署(UNEP)提供的某种鱼类肌肉组织进行分析，测定其中含氯有机物的种类及含量。

电子天平准确称取2.5g已干燥研磨后的样品，用100mL正己烷与丙酮的混合液(体积比为1∶1)连续索氏萃取。索氏提取仪加热板温度为63℃，自动提取时间为960min。提取液用承接有无水硫酸钠的脱脂棉过滤，去除少量水分与固体杂质。

提取液然后进凝胶色谱仪进行净化，以去除大分子量物质，在单浓缩程序过程中溶剂浓缩至8mL，在二连机程序过程中溶剂用正己烷置换并浓缩定容至4mL；然后净化液再氮吹浓缩至约1mL。

加入3mL正己烷，再用3mL浓硫酸处理进一步脱脂，离心分离，水相继续用3mL正己烷提取两次，合并有机相，氮吹浓缩至约1mL。

先用5mL丙酮清洗活化弗罗里硅小柱，再用5mL正己烷清洗活化，弃去清洗液；然后将浓硫酸处理过的提取液过小柱，样品瓶用少量正己烷清洗后过柱；然后用5mL正己烷与丙酮的混合液(体积比为9∶1)淋洗小柱，收集三部分过柱流出液并柔和氮吹浓缩至约1mL。加入5mL正己烷再氮吹浓缩至约1mL，此步骤重复三次，最后浓缩定容为100μL。

采用Agilent7890型气相色谱与ECD电子俘获检测器定量测定该样品。待测样品在(5％苯基)甲基聚硅氧烷Agilent HP-5非极性色谱柱上分离；载气为高纯氦气，恒压10psi；进样口温度260℃；检测器温度310℃；柱温初始为80℃(保持2min)，以20℃/min的速率升至150℃，继续以4℃/min的速率升至190℃，然后以1℃/min的速率升温至210℃，2℃/min的速率升至230℃，最后以30℃/min的速率升至300℃，(保持4min)；无分流自动进样1μL。在各含氯有机物色谱保留时间的基础上，根据获得的色谱峰数据与各含氯有机物的标准色谱峰数据进行对比分析，判断是否含有该种含氯有机物。在各保留时间下按色谱峰高定量分析各含氯有机物的含量。色谱图结果见图4。测定结果为：在15.568min检出HCB(六氯苯)，浓度为2.99ng/g-dw；19.271min检出CB28，浓度为4.22ng/g-dw；21.258min检出CB52，浓度为13.8ng/g-dw；22.576min检出CB44，浓度为9.6ng/g-dw；27.432min检出o，p’-DDE，浓度为26.2ng/g-dw；30.291min检出p，p’-DDE，浓度为61.5ng/g-dw；32.101min检出异狄氏剂，浓度为27.0ng/g-dw；33.005min检出硫丹II，浓度为13.8ng/g-dw；33.291min检出CB149，浓度为80.9ng/g-dw；33.481min检出CB118，浓度为105ng/g-dw；34.438min检出p，p’-DDD，浓度为85.0ng/g-dw；35.248min检出CB146，浓度为34.6ng/g-dw；35.887min检出CB153，浓度为195ng/g-dw；38.331min检出p，p’-DDT，浓度为125ng/g-dw；38.698min检出CB138，浓度为174ng/g-dw；40.950min检出CB183，浓度为38.4ng/g-dw；45.532min检出CB180，浓度为136ng/g-dw；46.934min检出CB170，浓度为37.6ng/g-dw；50.184min检出CB209，浓度为8.56ng/g-dw。

本发明在克服了背景技术所述三点困难的基础上，所能检测的含氯有机物种类多达40种，包括有机氯农药和多氯联苯两大类，其在色谱上的分开是一大难题。为了解决40种化合物的定性问题，本研究将HP-5柱(30米长)和HT-5柱(15米长)接起来，才达到了目标物既有效分开，也全都能出峰的效果。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。